약학회지 제 5 4 권 제6호 5 0 0 ~ " 5 0 6 ( 2 0 1 0 ) Yakhak Hoeji V o l. 5 4 , N o . 6
Tetravalent Bispecific 항체 분자인 Di-diabody 의 제조 및 표적 단백질에 대한 항염증 영향
정 선 기* '* * '' • 류 창 선* '' • 김 선 규* * * 마 진 열* * * • 김 상겸 *'수
* 충 남 대 학 교 약 학 대 학, 형 질 전 환 복 제 돼 지 센 터, 한 화 케 미 칼 중 앙 연 구 소, 한 국 한 의학 연 구 원 신 한 방 제 제 연 구 센 터
(R e c e iv e d S e p t e m b e r 1 0 , 2 0 1 0 ; R e v is e d N o v e m b e r 1 7 , 2 0 1 0 ; A c c e p te d N o v e m b e r 2 2 , 2 0 1 0 )
P r o d u c t i o n o f D i - d i a b o d y , a T e t r a v a l e n t B i s p e c i f i c A n t i b o d y M o l e c u l e a n d i t s A n t i - i n f l a m m a t o r y E f f e c t s o n t h e T a r g e t P r o t e i n s
S u n K i J u n g * ' * * ' ' , C h a n g S e o n R y u * ' \ S u n K y u K i m * * , J i n Y e o l M a * * * a n d S a n g K y u m K i m * ' *
^College o f Pharmacy and Research Center f o r Transgenic Cloned Pigs, Chungnam N a tion al University, Daejeon 305-763, Korea
**H anw ha Chemical R & D Center, Daejeon 305-804, Korea
***C e nter fo r Herbal Medicine Improvement Research, Korea Institute o f Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Korea
A b s t r a c t — T N F - a a n d V C A M -1 p la y a p iv o ta l r o le in t h e p a th o g e n e s i s o f r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , a n d t h e d e v e l o p m e n t o f d r u g s t a r g e t i n g t h e s e m o l e c u l e s h a s e x t e n d e d t h e th e r a p e u t i c a l a p p r o a c h e s t o r h e u m a t o i d a r t h r i t i s p a t i e n t s . B is p e c ific a n t i b o d ie s c o m b in e t h e a n tig e n - b in d in g s i t e s o f tw o a n tib o d ie s w ith in a s in g le m o le c u le a n d t h u s t h e y a r e a b le t o b in d to tw o d if f e r e n t e p i t o p e s s im u lta n e o u s ly . A s p e c ific b is p e c if ic a n tib o d y f o r m a t t e r m e d *T )i-diaboci/ 후 w a s m a d e f o r t h e e ffic ie n t a p p r o a c h t o a n ti- in f la m m a tio n . I n t h i s s tu d y , t h e D N A v e c t o r c o n s t r u c t o f D i-d ia b o d y w a s b u ilt u p a g a i n s t tw o a n tig e n s , V C A M - 1 a n d T N F - a . F o r e v a l u a tin g th i s D i-d ia b o d y a s a b is p e c if ic a n tib o d y o n t h e e ffic a c y o f a n ti- in f la m m a tio n , t h e p r o te in s w e r e a n a l y z e d a c c o r d in g t o e a c h a n t i g e n b in d in g a ffin ity a n d c e ll b a s e d a s s a y r e l a t e d s e p a r a t e m o le c u le s . T h e 7 H / H u m ir a D i- d ia b o d y p r o d u c e d in t h i s s t u d y i n t e r a c t e d w ith i t s lig a n d s , V C A M -1 a n d T N F - a , r e s p e c tiv e ly . A ls o , th i s a n tib o d y e x h ib ite d t h e s im ila r fu n c tio n a l a c t iv itie s a s c o m p a r e d t o 7 H - I g G in r e s p e c t t o in h ib itio n o f h V C A M - 1 - in d u c e d c e ll a d h e s io n a n d H u m ir a - I g G in r e s p e c t t o in h ib itio n o f T N F - a in d u c e d c y to to x ic ity . F u r t h e r s t u d y t o e lu c id a te t h e p h a rm a c o lo g ic a l s ig n if ic a n c e o f t h e D i-d ia b o d y is w a r r a n t e d u s i n g e x p e r i m e n t a l a n im a ls .
K e y w o r d s □ r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , T N F - a l p h a , V C A M * 1 , b is p e c if ic a n tib o d y , D i-d ia b o d y
류 마티스 관절염은 가장 번번히 발생되는 만성 염증성 관절 질 환의 하 나 로 전세계 인구의 0 . 5 ~ 1%에서 발병되며 관절의 염증 파 파괴에 기 인 한 관절 통 증 과 팽 창, 경 직을 수 반 한 다. 결 국 신 체롤 물리적 불 능 상 태 로 만둘어 중 국에 는 사망에 이르게 할 수 있 다. 관 절염은 자가면역질환의 일중으로 발병 원 인은 완전히 규 명되지 않 았 지 만 T 세 포 를 포 함 한 면역 세포둘이 관절 주위의 조직 세포 들 을 외 부 물 질 로 인 식, 공격하쉬 염증을 일으킴으로써 발 병 되 는 것 으 로 알려져 있 다. 염증 반 응 은 혈관에서의 면역세 포돌이 염증 주위 로 이동 및 침투에 의해 발생하게 되며 면역 세 포의 표면에서 발현되 는 다양 한 분 자 들 과 관절 주위의 내피세포
우본논문에 관한문의는저자에게로 (전화) 0 4 2 - 8 2 1 - 5 9 3 0 (팩스) 0 4 2 - 8 2 3 - 6 5 6 6 (E -m a il) s a n g k im @ c n u .a c .k r
T h e s e a u th o r s e q u ally c o n trib u te d to th is w o rk .
에서 발현되는 분 자 간의 결할서1 의해 일어나게 된 다. 또 한 대표 적인 염 중 메개 인 자 인 T N F ( t u m o r n e c r o s i s f a c t o r )는 단 핵 구
( m o n o c y t e )와 대식세포( m a c r o p h a g e ) 등에서 발현되는 다양한 역
할을 가진 사어토카인( c y t o k i n e )으로조직의 손상을 일으키는 IL - l ( i n t e r l e u k i n - 1 ) A G M - C S F ( G r a n u l o c y t e m a c r o p h a g e - c o l o n y
s t i m u l a t i n g fa c to r; 과럽 구 대식세포 콜로니 자국인자)의 발현을
증가시켜 관절염을 포 함한 대부분의 염증에 중요 한 역할을 담당 하는 것으로 알려져 있 다/
혈관계에서 백 혈 구( l e u k o c y t e )는 염중 반응에 중 요 한 역할을 하며 내피세포와 여러 단계에서 상호작용을 한 다. 상호작용은 순 차 적 으 로 r a n d o m c o n t a c t , r o ll in g , a r r e s t , t r a n s m i g r a t i o n 등 을 포함하며 이틀 통해 백혈구는 내괴세포률 통 과 한 다."^ 이 러한 모 든 과 정 은 백 혈 구 와 내 피 세 포 의 세 포 접 착 분 자(c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s , C A M s )의 여러 조 합 에 의해 수 행 된 다. I n t e g r i n ,
500
Di-diabody 의항염중영향 501
s e l e c t i n , I C A M ( I n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e ) , V C A M
(V a s c u la r c e ll a d h e s i o n m o l e c u l e ) 등의 많은 세포접착분자가 이 러한 과정에 관 여 한 다. 이 돌 단 백 질 은 기 능 적 으 로 백 혈 구 와 내 피세포와의 상호작용에 관여하는 s e l e c t i n류, 접착고정에 관여 하
는 i n t e g r i n류 와 I C A M , V C A M 등의 던역글로볼린 등 으 로 분 류
된 다. 이둘 단백질에 의한 세포접착은 면역작용, 염증 발생 뿐 만 아 니 라 혈액의 응 고 등 많 은 생 리 반 응 에 주 요 한 역 할 을 하 고 있 다. ^
류 마 티 스 관 절염에 대 한 항체 치 료 제 는 약물의 표 적 에 따 라
T N F - a 등의 사어토카인을 억제하는 항 체, B 세포와 T 세포의 면
역세포롤 조절하는 항체로 분류될 수 있 다. 이 중 T N F - a의 활성
을 억 제하는 항체 치 료 제 가 가 장 일 반 적 으 로 사 용 된 다. 그 러 나,
항 T N F - a 항 체로 치료 되지 않 는 환 자 가 임 상 적 로 보 고 되 고
있으며, 이러한 환자께게 면역세포의 활성을 조절하는 항체률투 여하여 치료효과롤 증대시키는 방법이 주목 받고 었 다.®"®* 그러므 로 류 마티스 관절염에서 하나의 표 적만 을 저 해하는 치료 방법 보 다는 다른 약리기전을 가지는복수의 표적을 동시에 조절하는 것 이 좋은 관절염 치료제의 개발을 위한하나의 전락이 될 수 있 다. 따 라 서, 본 연 구 에 서 는 첫 째, 염증성 질환의 병인 기전에 서
T N F - a의 수용체에 대 한 T N F - a의 작 용 을 억 제하는 약리 기 전,
둘 째, 백혈구 등의 면 역세포가 V C A M - 1 과 작용함으로써 내피세 포룰 통과하여 염증 부 위 로 이 동 하 는 것을 억 제하는 약리 기전 을 이용하여 관절염 치 료제용 항 체를 제 작 하 고, 이에 대 한 항염 증 활성을 측정하 는 것을 목 적으 로 하 였 다. 이 를 위츠I여 이종의 항원 결합 부위를 하나의 항체로 결합시킨 것으로, 두 개의 항원 에 대하여 결 합 할 수 있게 만 든 항체 포 맷 인 b i s p e e i f i c 항 체 를 제 작 하 였다. 이 는 두 개의 다 른 표적 또 는 e p i t o p e을 동시에 약 물 표적화하식 항체의 생물학적 활성을 증진시키는 방 법 으 로, 증 가된 치료 효과 를 기 대 할 수 있 다 . ® 이 러 한 b is p e c if ic 항체의 포맷 중 에 서, 동물세포에서 발현될 수 있고 항원 결 합력과 생물 학적 활성이 우 수하다고 보고된 D i- d ia b o d y률 항체 포 맷으 로 선 정 하 였 다. D i - d ia b o d y는 2 0 0 3년 I m d o n e사의 Z h u 연 구팀에 의 해 유전 자 재조합 기술을 이용하여 개발되었으며 ^^' 이 항체포맷 은 항원 결 합력과 생물학적 활성의 죽면에서 d i v a l e n t b is p e c if ic
d ia b o d y 보 다 더 효과적인 것으로 보고되었다.^신이에 본 연구에
서는 T N F - a와 V C A M - 1 을 동시에 억제 할 수 었는 b i s p e c i f i c 항
체인 D i- d ia b o d y룰 유 견자 재 조합 기술을 사용하여 제 작하고, 항
염증 영향 평가를 통해 치료용 항체 의약품의 가눙성에 대해 연 구 하였 다.
생물학 및 세포생물학에 사 용 되 는 시 약 들 은 A b C a m ( C a m b r i d g e , U K ) , A m r e s c o ( S o l o n , O H ) , B e c k o n D i c k i n s o n B i o S c e i n c e ( F l a n k i n L a k e s , N J ) , I n v i t o g e n ( C a r l s b a d , C A ), N e w E n g l a n d B i o l a b s ( B e r v e r l y ; M A ) 와, P r o m e g a ( M a d i s o n , W I ), R & D S y s t e m s ( M i n n e a p o l i s , M N )로부터 구 입 하 였 다. 본 연 구 에 는 다 옴 의 항 체 와 재 조 합 단 백 질 이 사 용 되 었 다. A n t i - m y c m A b ( I n v i t r o g e n , P / N 4 6 - 0 7 0 9 ) , h u m a n V C A M - l / F c ( R & D S y s t e m s , 8 6 2 - V C ), h u m a n V C A M - 1 ( R & D s y s t e m s , 8 0 9 - V R ) , h u m a n T N F - a ( A b c a m , a b 9 6 4 2 ) , h u m a n I g G k a p p a ( S i g m a , 1 5 1 5 4 ) , a n t i - h u m a n F c - H R P ( T h e r m o S c ie n tif ic , 3 1 4 1 3 ) , B D P h a r m i g e n m o u s e a n t i - h u m a n C D 1 0 6 ( B D B i o s c i e n c e , 5 5 5 6 4 5 ) 등 은 항 원 의 결 합 활성 및 in vitro 효능 활 성 을 측 정 하 는 데 시 용 하 였 다.
세포배양
단 백 질 생 산 을 위해 C H O 동 물 세 포 주 를 배 양 하 였 다( A T C C , M a n a s s a s , V A ). C h i n e s e H a m s t e r O v a r y C e l l ( C H O )은 단 백 질 생산세포주로 가장 많이 활 용 된 다. C H O - S 세 포 주 C H 0 - K 1 을 부 유 배 앙 적 응시킨 것 으 로 C D - C H O ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) 배 지 에 8m M L - g l u t a m i n e ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A )과 lO O X h y p e r x a n t h i n e ( H T , I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ), lO O X a n t i - a n t i ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A )를 첨가하여 부 유 배양하였다. I n vitro 효 능 활 성 에 사 용 된 세 포 주 는 L 9 2 9와 U 9 3 7이 었 다( A T C C , M a n a s s a s , V A ). L 9 2 9는 m u r i n e f i b r o b l a s t 세 포 로 R P M I 1 6 4 0 ( R o s w e ll P a r k M e m o r ia l I n s t i t u t e m e d i u m , I n v i t r o g e n C a r ls b a d , C A ) 배지에 1 0 % F B S와 lO O X a n t i - a n t i롤 첨 가 하 여 부 착 배 양 하 였 다. U 937-?_ - 백 혈 구 세포의 일 중 으 로( h u m a n p r o m o n o c y t i c l e u k o c y t e ) , R P M I 1 6 4 0 배지에 1 0 % F B S를 첨가하여 부유된 상 태로 부 착 배 양 하 였 다.
Di-diabody의유전자클로닝
항 인간 V C A M - 1 과 항 인간 T N F a의 b i s p e c i f i c 항체를 제작
하기 위해 기본 구조 로 s c F v률 제 작 한 후, 동물세포에서의 발현
b i s p e c i f i c 항체 제작을 진 행 하 였 다. 동 물 세 포 에서 의 발현 형태 로
는 d i a b o d y가 F c에 f u s i o n ¥ l 형 태( V l A - V h B - C h 2 - C h 3 , V l B - D i - d ia b o d y룰 유 견 자 클 로 닝 하 였 다. D i - d i a b o d y의 주형
이 되 는 d ia b o d y 형 태 인 V h A - V l B과 V n B - V ^ A에서 A는 항
V C A M - 1 항체인 7 H , 1 1 C c l o n e , B는 항 T N F - a 항체인 h u m i r a
가 되 며, 제작된 각각의 s c F v 형 태를 주 형 으 로 P C R을 수행하^ ^
제 작 하 였 다.
실 험 방 법
시약
일반 시약들은 S i g m a ( S t . L o u i s , M O )에서 구입하였으며 분 자
Di-diabody 단백질 생산을위한동물세포 배양
C H O - S 세포주의 경우, t r a n s f e c t i o n 전날 C D - C H O ( I n v i t r o g e n , C a r ls b a d , C A ) 배지에 1 . 5 x 1 0 ^ c e ll/m /로 V C D (v i a b le c e ll d e n s i t y ) 률 맞 춘 C H O - S c e l l 약 1 0 0 m /을 배 앙 하 였 다. T r a n s f e c t i o n 당
Vol. 54, No. 6,2010
502 정선기 • 류창선 ■ 김선규 ■ 마진열 ■ 김상겸
약 2 . 5 ~ 3 x l 0 ® c e l l / m/로 자 란 세 포를 1% D M S O ( S i g m a , S t.
L o u i s , M O)가 들 어 었 는 C D - C H O 배지 로 2 . 1 x 1 0 ® c e ll/ m/의 밀 도로 준 비 하 였 다. 8% C0 2, 3 7 X , 1 0 0 r p m 배양기에서 3시간 동 안 배 양 하 였 다. 원 심 분 러 기 를 사용하여 3 , 0 0 0 r p m에서 1 5분 간 세 포 분 리 를 한 다 옴, R P M I 1 6 4 0 ( w / 2 . 5 % F B S ) ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) 배지 1 0 0 m/에 현탁하였다. 5 0 0 m / E l l e n M e y e r - f la s k에 현탁？ 1 세포를 분주한 다 옴, D N A / P E I ( p o l y e t h y l e n e i m i n e )
혼합액 1 0 m/을 첨 가 하 였 다. 5% C02, 3 T C , 1 0 0 r p m 배양기에
서 4시간 동 안 배 양 하 였 다. C D - C H O 배지 1 0 0 mZ을 첨 가 하 고, 8% CC>2, 3 7 X , 1 1 0 r p m 배 양 기 에 서 3 ~ 4일 동 안 배 양 하 였 다.
D N A / P E I 혼 합 액 을 제조할 시에는 각각의 D N A률 O P T I - M E M
I r e d u c e d s e r u m m e d i a d n v i t r o g e n , C a l s b a d , C A ) 에 넣어 희석
하는 데 P E K 1 m g / m/)을 각 D N A 양의 4배 로 넣고 혼 합 하 였 다.
상온에서 1 0분 간 배 양 한 후 세포에 바 로 넣을 수 있 도록 준비 하 였 다.
항체의 rPA 정제 및농측
A s s a y용 정제시료에 대해서는 A K T A p u r i f i e r ( G E H e a l t h c a r e , P i s c a t a w a y , I번 )를 이용 하 였 으 며 r e c o m b i n a n t P r o t e i n A (r P A ) c o l u m n은 r P r o t e i n A F F ( H i t r a p 5 m / / m in , G E H e a l t h c a r e , P i s c a t a w a y , N J ) H 사용하였다. E q u i l i b r a t i o n b u f f e r ( 5 0 m M T r is -
H C l , 1 0 0 m M N a C l , p H 7 . 4)로 평형 조 건을 잡은후 배잉=액 시
료 룰 lo a d i n g하 고 r P A r e s i n에 F c f u s i o n p r o t e i n을 포 집 하 였 다. 이 무 e l u t i o n b u f f e r ( 5 0 m M N a - C i t r a t e , p H 3 . 0)로 p H 급 감 을
주어 포집된 단백질을 용출하여 시료틀 얻고 n e u t r a l i z a t i o n b u f f e r
( 1 M T r i s - H C l , p H 9 . 0)로 p H 7 . 0 ~ 8 . 0으 로 중화시켜 목적 단백 질 을 정 제 하 는 방 법 을 사 용 하 였 다. c o l u m n 내의 불 순 물 제거률 위해 e l u t i o n b u f f e r률 사 용 하 기 전에 w a s h i n g b u f f e r ( 5 0 m M
N a - C i t r a t e , p H 5 . 0) 률 사 용 하 였 다. 정 제 된 단 백 질 의 농 측 은
A m i c o n U l t r a - 1 5 c e n t r i f u g a l f i l t e r u n i t ( M i l l i p o r e , B ille r ic a , M A)를 사 용 하 였 다.
Di-diabody 동물세포정제 단백질의 항원 결함 ELISA
D i- d i a b o d y에는 h u m a n F c 7 |- 재조합되어 있으JEU L 항원 결합
E L I S A에는 h u m a n F c를 검출할 수 있는 항체를사 용 하 였 다. 항
V C A M - 1 결 합 에 대 해 서 는 h u m a n V C A M - l ( w / o h F c , R & D s y s t e m s , M i n n e a p o l i s , M N) 을 w e ll 당 1 . 5 n g / m / , 1 0 0 를 c o a t i n g하 고 4 ° C에 1 6시간 배 양 하 였 다. 이후 1% B S A ( A m r e s c o , S o l o n , O H ) 가 있 는 P B S ( S i g m a , S t . L o u i s , M O)로 2시 간
b lo c k i n g한 이후 시료률 w e l l 당 1 0 0 를 넣은 후 3 7 X에서 2시
간 배 양 하 였 다. 검 즐 항 체 로 H R P - c o n j u g a t e d a n t i - h u m a n F c m A b ( T h e r m o S c ie n tif ic , R o c k f o r d , I L)을 1 : 4 0 , 0 0 0으 로 희석 하
여 w e l l 당 1 0 0 m/률 넣 고 3 7 T 에서 2시간 배 양 한 후 T M B
( S i g m a , S t . L o u i s , M O)로 발 색 하 였 다. 항 T N F - a 결합에 대해
서 는 r e c o m b i n a n t h u m a n T N F - a ( A b c a m , C a m b r i d g e , U K)룰
1 . 5 1 0 0 를 c o a t i n g하 고 시 료 률 처 리 한 후 검 출 항 체 로
H R P - c o n j u g a t e d a n t i - h u m a n F c m A b ( T h e r m o S c ie n tif ic , R o c k f o r d , I L)을 1 : 4 0 , 0 0 0으 로 희석하쉬 w e ll 당 1 0 0 ( i를 넣고
3 7 ° C에서 2시간배양한후 T M B 로 발색하였다. 매 과정은 P B S T
( w / 0 . 0 5 % T w e e n 2 0)로 5회 w a s h i n g하 였 다. 시 료 는 정 제 된 단백질을사 용하므로 몰농도를 맞추어 4분의 희석하<늬사용 하 였 다.
L929 cytotoxicity assay
시료를 l O n M부터 4분의 일로 배지에 희석하식 9 6 w e l l p l a t e
에 1 0 0 Mi 분주하였다. 2 n g / m/의 T N F - a를 각 w e ll에 5 0 fJ 넣어
0 . 5 n g / m/이 되게 하식 실온에서 3 0분 배 양 하 였 다. L 9 2 9 세포주
를 I X 10® c e lls / m / 농 도 로( R P M I 1 6 4 0 w/10% F B S + l |i g / m / A c tin o m y c in D [ S i g m a , S t . L o u i s , M O ] ) 준비하여 5 0 |j/룰 분주 하 였 다. 2 2시간 정도를 5 % C 0 2 , 3 7 ° C 배앙기에서 배 양 하 였 다. W S T - l ( R o c h e , S w i t z e r l a n d)를 2 0 첨 가하고 2시간 배 양 한 후 E L I S A R e a d e r로( 4 5 0 / 6 9 0 n m , M o le c u la r D e v ic e s , S u n n y v a le ,
C A ) 측 정 하 였 다.
Antigen-U937 cell adhesion assay
H u m a n V C A M - 1 항 원 을 9 6 w e l l p l a t e에 2 ng/m l 농 도 로 분
주하고 1 6시간, 4 ° C에서 배 양 하 였 다. 이를 1 % B S A가 녹아있는
P B S 용액으로 2시간 실온에서 b l o c k i n g하였다. 용액을 제거하고
C F S E (C a r b o x y f lu o r e s c e in s u c d n im id y l e s te r ) ( I n v i t r o g e n , C a ls b a d , C A)가 라밸된 U 9 3 7 세포( R P M I m e d i a , w / 1 % F B S ) 1x 1 0® c e ll 수 를 10 0 m；분 주 하 였 다. 3 7 X 1 5분 동 안 암 반 응 배 양 하 였 다.
2 6 0 m/의 배지로 나머지률 채우고 5분간 2 0 0g로 p l a t e를 뒤집어
서 원심분리하였다. W e ll의 용액을 제거하고 1 5 0 ^4/의 l y s i s b u f f e r ( 0 . 1 % S D S , 5 0 m M T r i s - H C l , p H 8 . 5)률 첨가하여 1 5분 간 실 온에서 배 양 하 였 다. 피벳팅 후 형 광 분 석 기( M o l e c u l a r D e v i c e s , S u n n y v a l e , C A )로( 4 8 5 ~ 5 3 0 n m ) 측 정 하 였 다. 세포 형 광 라밸의
경 우 C F S E t t 5 |. i M 농 도 로 5분 배 양 하 고 I X P B S로 3번
w a s h i n g한 후 F c R 억 제 률 위해 h u m a n s e r u m ( S i g m a , S t.
L o u i s , M O X으로 5 x 1 0 * ^ c e lls / m / 농도 로 1 5분간 b lo c k i n g하고 배
지로 w a s h i n g하식 형광 표지된 세포 룰 준 비 하 였 다.
실 험 결 과 및 고 찰
재조합 Di-diabody 항체의 제작
유전자 재조합기술을사용하여 c r o s s - o v e r된 s c F v p o ly p e p tid e c h a i n 하 나 를 먼저 만 들 고, 힌지 구역 ( h i n g e r e g i o n)을 I g G의
C h 2 - C h 3 d o m a in의 N 말단에 융합시켰다. 또한 다른 한 쪽에 마
찬가지 로 c r o s s - o v e r된 s c F v p o l y p e p t i d e ! - d o m a i n에
J. Pharm. Soc. Korea
10-* 10--^ 10- io-' Mr C o n c e n t r a t io n ( n M )
10-
F ig . 1 - rh V C A M -1 b in d in g a ffin ity o f p u rifie d 7 H / H u m ir a D i- d ia b o d y a n d l l C / H u m i r a I)i- d ia b o d y in C H O - S c u ltu r e . T h e p u rifie d D i-d ia b o d ie s a n d p a r e n ta l Ig G s w e r e fir s t in c u b a te d w ith rh V C A M - 1 {1 }_ig/m/) c o a te d in m ic r o p la te s , fo llo w e d b y in c u b a tio n w ith H R P -c o n ju g a te d a n ti-h F c a n tib o d y . 7 H / H u m ir a D i-d ia b o d y b in d s to h u m a n V C A M -1 w ith t h e s im ila r a c tiv ity a s 7 H - I g G p a r e n ta l fo r m . In th e c a s e o f l l C / H u m i r a D i-d ia b o d y , it h a d lo w b in d in g a c tiv ity r a t h e r th a n th o s e o f b o th 7 H - I g G a n d 7 H / H u m ir a D i- diabo dy . A n tig e n b in d in g a c tiv itie s , r a n k e d in d e s c e n d in g o r d e r a r e a s fo llo w : 7 H - I g G = 7 H / H u m ir a D i- d ia b o d y > 1 1 C / H u m ir a D i-d ia b o d y > 1 1 C -Ig G . D a ta s h o w n r e p r e s e n t th e m e a n ± S .D . o f trip lic a te s a m p l e s .
Vol. 54, No. 6, 2010
KH 10-' 10-고 10-' 10" 10' 10-
C o n c e n t r a t i o n ( n M )
F i{ |. 2 - r h T N F - a b in d in g a ffin ity o f p u r if ie d 7 H / H u m ir a D i-d ia b o d y a n d l lC / H u m ir a D i-d ia b o d y in C H O - S c u ltu r e . T h e p u rifie d D i-d ia b o d ie s a n d p a r e n ta l I g G s w e r e f ir s t in c u b a te d w ith r h T N F - a ( 1 m g /m /) c o a t e d in m ic r o p la te s , fo llo w e d b y in c u b a tio n w ith H R P -c o n ju g a te d a n ti- h F c a n tib o d y . B o th o f 7 H / H u m ir a D i-d ia b o d y a n d l l C / H u m i r a D i-d ia b o d y b in d to h u m a n T N F - a w ith th e s im ila r a c tiv ity a s H u m ir a - I g G p a r e n ta l fo r m . D a ta s h o w n r e p r e s e n t t h e m e a n ± S .D . o f tr ip lic a te s a m p le s .
였 다. 이 결과는 b is p e c if ic 분자의 조합 을 이종이량체화하여 I g G -
li k e 분 자 형 태 로 분 자 량 을 증 가 시 키 면, 약 물 동 력 학 적 인 측면이
개선되어 효능을 I g G와 유사하게 유 지 할 수 있다 는 보고*^>와 일
치 한 다. 반면에 m i n i b o d y 형태에서 항원 결 합 력 은 있 으 나 세포
접 착 저해능이 없는 1 1 C d o n e의 경 우, 특 이 하 게 도 D i- d ia b o d y
형태 가 I g G 형 태보다 V C A M - 1 에 대한 결 합 활성이 보 다 우 수 하
였 다. 이 는 1 1 C d o n e의 경우 D i - d i a b o d y 형 태 로 개량됨 으로 써
I g G 형 태 보 다 결합 활성이 개선되는 효 과 를 보 였 다.
또 한 공 통 된 h u m i r a의 v a r i a b l e r e g i o n을 가 진 D i - d i a b o d y는
7 H와 1 1 C가 h V C A M - 1 항원에 대 한 결합 활성이 다 른 것에 반
해 항 h T N F - a에 대한 결합 활성은 유사함을 S K 1 하 였 다( F i g . 2 ) .
이 결과 는 항 T N F 항체인 h u m i r a의 경 우, I g G에서 D i- d ia b o d y 로 항체의 형 태 가 변 형되어노 T N F - a에 대 한 결합력이 유 지 됨 을 보 인 다.
첨가적으로 제작된 b i s p e c i f i c 항체인 D i- d i a b o d y는 p a r e n t a l 항
체인 I g G 형 태 와 유 사 한 항원 결 합 력 을 가지며 각각의 항 원에
대해 득 럽 적 으 로 결합력을 가지는 것을 확 인 하 였 다.
Anti-TNF-a 세포득성 중화농분석
L 9 2 9 c y t o t o x i c i t y a s s a y는 h T N F - a 와 m o u s e f i b r o b l a s t c e l l
l i n e인 L 9 2 9 c e l l을 흔 합 하 고 여기에 항 체 를 농 도 벌 로 처리하여
배양 후 L 9 2 9 세포의 c y t o t o x i c i t y률 W S T - 1 처러률 통해 측 정 하 여 항체의 중 화 눙 을 조 사 하 였 다.^® 양성 대 조 군 인 H u m i r a - I g G 융합시킨 형태률 제작하여 b is p e c if ic d ia b o d y - C n Z - C H S f u s i o r f e
만 돌 었 다. 이 러 한 두 개의 d ia b o d y -C：H 2 -C H 3 f u s i o n의 유 전 자 롤
C H O 동물 세포주에서 동시에 발현하게 하 여, h i n g e와
가 결합된 d ia b o d y - C H 2 - C n 3 이량 체 틀 생 성 하 였 다. 제작된 재조
합 유전자는 D N A s e q u e n c i n g을' 통해 엮기서열을 확 인하 였 으 며,
동물세포주 t r a n s f e c t i o n 이후 수 득한 배양액의 각각의 항원에 대
한 결합 활성 E L I S A를 통해 항체 단백질이 발현됨을 확인하였다.
정제된 Di-diabody 항체의 항원 결함활성 착인
C H O - S 배양 후 r P A 정제률통해 수득¥ 1 7 H , 1 1 C D i- d ia b o d y 항 체 는 각각의 항원인 h V C A M - 1 과 h T N F - a에 대 한 항체의 결
합력의 차이률 동일 농도에서 E L I S A!르확 인 하 였 다. 항원에 대
한 항 체 의 a f f in i ty 측 정 은 B i a C o r e ( B i o m o l e c u l a r I n t e r a c t i o n A n a l y s i s ) S P R T e c h n o l o g y 등의 방 법 으 로 정확한 값 을 죽 정 하 는 것이 일 반 적 이 나 본 연 구에서는 항체 농 도 별 E L I S A에서 의 발색 수치률곡선S1히여 상대적인 결합력 처이롤 비교하였다
항원 h V C A M - 1 에 대 한 결 합 은 7 H - I g G에 비해 l l C / H u m i r a D i-d ia b o d y -；：- 상 대 적 으 로 낮 았 으 며 7 H / H u m i r a D i - d i a b o d y는 7 H - I g G와 유사한 항원 결합력을 S K 1 하 였 다( F i g . 1 ) . 항 V C A M -
1 후보 항체인 7 H에 대해서는 I g G 형태에서 D i - d ia b o d y 항체로
개량되어도 항원에 대 한 결합력은 변하지 않고 유사함을 확인하
Di-diabody 외항염중영향 503
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504 정선기 • 류창선 • 김선규 ■ 마진열 • 김상겸
C o n c e n t r a t i o n ( n l V l )
Fig. 3 - A n ti- T N F - a c y to to x ic ity n e u tr a liz in g e ffe c t o f b is p e ic ifc a n tib o d ie s , 7 H / H u m ir a D i-d ia b o d y a n d l l C / H u m i r a D i- d iab o d y . T h e O D v a lu e o f 4 5 0 n m , w h ic h r e f le c te d m e ta b o lic a ily a c tiv e c e lls b y W S T - 1 , in c r e a s e d p ro p o r tio n a lly w h e n L 9 2 9 c e lls w e r e e x p o s e d to in c r e a s in g a m o u n ts o f b o th H u m ir a a n d b is p e c ific D i-d ia b o d ie s . B o th 7 H / H u m ira D i-d ia b o d y a n d l l C / H u m i r a D i-d ia b o d y s h o w e d t h e s im ila r n e u tr a liz in g a c tiv ity in T N F - a in d u c e d L 9 2 9 c y to to x ic ity a s H u m ir a - I g G p a r e n ta l fo r m . D D m e a n s D i-d ia b o d y . D a ta s h o w n r e p r e s e n t t h e m e a n + S .D . o f trip lic a te s a m p le s .
.S 20
Fig. 4
i M U i i
c s
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1■벽
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<잘
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% •sC o o§ % o V© 1 o VO § o
§
BD Ig G Di-diabody IgG Di-diabody
Reference 711 l i e
Ab
A d h e s io n in h ib itio n o f 7 H / H u m ir a a n d l l C / H u m i r a D i- d ia b o d y b e tw e e n V C A M -1 a n d ly m p h o c y te s ; U 9 3 7 . A d h e s io n o f U 9 3 7 o n a n a n tig e n w a s in v e s tig a te d in 9 6 - w e ll p la te s p r e - c o a te d w ith rh V C A M - 1 . N u m b e r o f a d h e r e n t c e lls p e r w e ll w a s d e te r m in e d u s in g a flu o r e s c e n t a s s a y (O D w ith lin e a r c o r r e la tio n to n u m b e r o f a d h e r e n t c e lls la b e le d b y C F S E ). 7 H / H u m ir a D i-d ia b o d y in h ib ite d U 9 3 7 a d h e s io n a g a in s t h V C A M -1 a t t h e s im ila r le v e l a s a c o m p a r e d to 7 H -Ig G , n o t l l C / H u m i r a D i-d iabo d y. B D a n tib o d y is u s e d fo r p o s itiv e c o n tr o l th a t b in d s to V L A 4 o f U 9 3 7 in th is a s s a y s y s te m . T h r e e in d e p e n d e n t e x p e r im e n ts o f trip lic a te s a m p le s w e r e d o n e a n d r e s u l t s a r e s h o w n a s m e a n ± S .D .
에 비해 D i - d i a b o d y의 경 우, 항 V C A M - 1 의 d o n e에 상 관 없 이 m , l i e 모두에서 H u m i r a - I g G와 유 사 한 h T N F - a 중 화 눙 을 확 인 하 였 다( F i g . 3 ) . 이 는 T N F - a 항원 결합력 측정 E L I S A에서 와 같이 , 다른 항원의 종류에 상관없이 항체 형태가 변형되어도 T N F -
a에 대 한 항원 결합력이 유지되어 in vitro 활성인 세포득성 중
화 능 에 서 도 유 사 한 활성 을 가 지 는 것으로 보 인 다.
VCAM-1 에 대한세포점착저해농분석
h V C A M - 1 항원에 대 한 l e u k o c y t e인 U 9 3 7 세포주의 접 착 저
해눙 시험은 9 6 w e ll p l a t e게항원인 h V C A M - 1 을 2 0 0 n g / 1 0 0 너/ w e ll c o a t i n g하2 후보 항체를 6, 6 0 , 6 0 0 n M 처리한후 C F S E 형
광 표지된 U 9 3 7 세포틀 결 합시켰다. 이렇게 접착된 세포롤 용해
하여 형광 분석 기 로 용출액의 형광을 즉정하여 항 원과 l e u k o c y t e 간의 항체의 접 착 저 해능을 측 정 하 였 다. 이 는 내피 세포에서 면 역 자 극 시 일 시 적 으로 발 현되 는 V C A M - 1 에 대 한 백혈구의 접 착을 세 포 간 반응에서 세포 표면의 분 자 간 반응으로 변 형 하 쉬,
V C A M - 1 항 원 을 항 체 가 결합함으로써 백혈구의 V L A - 4와의 반
응 을 저해 하 는 a s s a y 분 석법이다.^®> 앙성 대 조 군 으 로 는 B D P h a r m i n g e n m o u s e a n ti- h u m a n C D 1 0 6 ( B D B io s c ie n c e , 5 5 5 6 4 5 ) 을 사 용 하 였 으 며, 이 는 V C A M - 1 에 직접적으로 결합하지 않 지 만,
백혈구의 V L A - 4에 결합하여 세 포 접 착 저 해능 을 가 지 는 항체이
다.2 옴성 대 조군으로 두 항원에 대 한 결 합 부 위 가 없는 h u m a n
I g G률 ■하였고이에 대한 형광 수 치 률 기 준 값인 0 %로 하의
저해능을 상대적으로 평 가하였다. 양성 대조군은 6n M의 낮은 농
도에서도 8 0 %의 저해능을 보였 다( F i g 4 ) . 7 H의 경우, Ig G와 D i-
d ia b o d y가 6 0 n M 이상에서 6 0 %의 저해능이 있옴을 확 인 하 였다.
1 1 C의 경 우, 6 0 0 n M 농도에서 D i- d ia b o d y 포 맷 은 4 0 %의 저해
능을 가 지나, I g G 포맷에서는 2 0 %의 저해능이 측 정 되 었다. 특이
하 게 도, 1 1 C I g G는 모든 농도에서 세 포 접 착 저해능이 낮 으 나,
D i- d ia b o d y 형태로 번경할 시에 6 0 0 n M 이상의 고농도에서 세포
접착 저해능이 I g G 형태보다 2배 이 상 개선됨을 보 였 다. 이로서
l l C / H u m i r a D i- d ia b o d y의 경 우, 항체 형태의 변 형 으 로 활성의
개선효과를 보 였 다. 세포 접 착 저해능의 활 성은 7 H / H u m i r a D i- d ia b o d y = 7 H - I g G > 1 I C / H u m i r a D i- d ia b o d y > l l C - I g G의 순 서 로 확 인 되 었다.
결 론적으로, 7 H / H u m i r a D i- d ia b o d y는 7 H - I g G과 비교하여 세 포 접 착 저헤능이 모 든 농도에서 유 사 하 여, 항체 형 태 가 번형되
어 도 항 V C A M - 1 의 in vitro 활성인 세 포 접 착 저해능 은 유지되
었 다.
결 론
본 연구의 목 적 은 T N F - a와 V C A M - 1 을 동시에 억 제할 수 있
는 b is p e c if ic 항체룰 D i- d ia b o d y 유견 자 재조합 기술을 사용하여
제 작 하 고, 제작된 항체의 항염 증 활성 을 평 가하 는 것 이 었 다. 실 험결과 다옴 과 같은 결론을 도 출 하 였 다.
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