A Study on the Effect of Erycibae Caulis and Corydalis Tuber Pharmacopuncture on a Mouse Model with Collagen Induced Rheumatoid Arthritis

丁公藤玄胡索 藥鍼이 류마티스 관절염 생쥐 모델에 미치는 영향

김현지, 전주현, 김영일

대전대학교 한의과대학 침구의학교실

[Abstract]

AStudyontheEffectofErycibaeCaulisandCorydalisTuber

PharmacopunctureonaMouseModelwithCollagenInduced RheumatoidArthritis

HyunJiKim,JuHyunJeonandYoungIlKim

Dept.ofAcupuncture&Moxibustion,CollegeofKoreanMedicine,DaejeonUniversity Objectives : TheaimofthepresentstudyistoexaminetheeffectandmechanismofErycibae

CaulisandCorydalisTuberPharmacopuncture(ECP)onamousemodelwithcollageninduced rheumatoidarthritis(CIA).

Methods : WeevaluatedtheAspartateaminotransferase(AST),Alanineaminotransferase(ALT), Creatinine,andtheBloodureanitrogen(BUN)ofserumtoexaminethesafetyofthisstudy.In vivo,wecomparedtheresultsofthenon-treatedgroup,thenormalsalinepharmacopuncture treatedcontrolgroup,theindomethacintreatedgroupandtheECPgroup.Weevaluated rheumatoidarthritismanifestationandtheRheumatoidArthritisIndex(AI).Also,immunecells inbloodaffectedbyECPwereevaluatedbycalculatingthelevelofwhitebloodcells(WBC), neutrophil,lympocytesandmonocytes.Next,thelevelofImmunoglobulinM(IgM),Immunoglob- ulinG(IgG),Interleukin(IL)-1β,IL-6,IL-17,TumorNecrosisFactor(TNF)-α andGranulocyte- macrophageStimulatingFactor(GM-CSF)inserumweremeasured.Weexaminedtheimaging ofcartilagedegenerationusingmicroCT-arthrographyofthehindpaw.Additionally,weex- aminedtheeffectsofreducingbonevolume(BV)ratioandbonesurface/bonevolume(BS/BV) ratiowith3DMicro-CT.Finally,wedidahistopathologicexaminationanalysis.

Results : Theabsenceofliverandkidneytoxicitywasevident.

Invivo,edemaofthejointsoftheECPgroupdecreasedgreatlyinmacroscopicobservation.

AImeasurementoftheECPgroupalsodecreasedsignificantlycomparedtothecontrolgroup.

ThelevelofWBC,neutrophil,lympocytes,andmonocytesintheblooddecreasedbutthere wasnostatisticalsignificanceofthisdata.IgMoftheECPgroupdecreasedsignificantlycom- paredtothecontrolgroup.IL-1β,IL-6,TNF-α,andGM-CSFproductionoftheECPgroup decreasedsignificantlycomparedtothecontrolgroup.Asaresultofexaminingjointcondition with3DmicroCT,deformationanddestructionofthejointwasshowntohavedecreased.

BonedensityofECPgroupincreasedatastatisticallysignificantlevelcomparedtothecontrol group.DegreeofjointinflammationofECPgroupdecreasedsignificantlycomparedtothe controlgroup.AfterH&EandM-Tstaining,infiltrationofimmunecells,subsidenceofthe cartilage,damagetothesynovialcellsandjointerosiondecreased.

Conclusion : ThisstudyshowedthatECPhinderedtheprocessofrheumatoidarthritisandpro- tectedjointsandcartilage.

✱ Correspondingauthor:Dept.ofAcupuncture&Moxibustion,CollegeofKoreanMedicine, DaejeonUniversity,Daejeon,RepublicofKorea

Tel:＋82－42－470－9137 E－mail:[email protected] Key words :

ErycibaeCaulis;

CorydalisTuber;

Phamacopuncture;

Rheumatoidarthritis

Received : 2016. 04. 29.

Revised : 2016. 05. 30.

Accepted : 2016. 06. 03.

On－line : 2016. 06. 20.

ThisisanOpen-AccessarticledistributedunderthetermsoftheCreativeCommonsAttributionNon-CommercialLicense(http://creativecommons.org/licenses/by- nc/3.0)whichpermitsunrestrictednon-commercialuse,distribution,andreproductioninanymedium,providedtheoriginalworkisproperlycited.

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Copyright2016KAMMS.KoreanAcupuncture&MoxibustionMedicineSociety.Allrightsreserved.

Ⅰ. 서론

최근 식습관 등 생활 습관의 변화와 함께 염증성 자가면 역질환의 발병이 증가하며 그에 따른 사회적 관심이 더욱 대두되고 있다

. 류마티스 관절염 역시 이에 포함되며, 서 서히 발병하여 점진적으로 진행하는 가장 흔한 전신적 만 성 질환 중 하나이다

. 전 세계적으로 약 1 %에 달하는 유 병률을 가지며

, 대표적인 증상으로는 주로 대칭성의 근 위지절, 중수지절, 중족지절 관절염과 통증, 아침 기상 후 의 강직감 (morning stiffness), 관절의 움직임 제한과 변 형, 파괴 등이 있다. 또한 전신 증상으로 관절 외의 류마티 스 결절, 안구건조증, 림프절 병증, 심폐기능 및 신경기능 이상 등이 발현하기도 한다

. 최근 한 연구에서는 류마티 스 관절염으로 인한 통증과 수면장애가 삶의 질을 저하시 키는 결과를 보고하였다

. 그렇지만 원인이 불명확하고 사 람에 따라 그 병정과 예후가 각기 다양해 치료법 역시 뚜렷 하지 않은 실정이다.

서양의학에서는 아스피린, 비스테로이드성 소염진통 제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs), 부신피질호르몬, 항류마티스제제(Disease Modifying AntiRheumatic Drugs; DMARDs), 항 Tumor Necro- sis Factor-α(TNF-α)제제, 면역억제제, 세포독성 억제 제 등을 류마티스 관절염의 치료에 사용하고 있으며, 최근 에는 초기부터 적극적인 DMARDs 처방을 권장하여

직접 적인 치료를 지향하고 있지만, 여전히 치료 효과에 반응하 지 않는 환자의 수가 상당하며 부작용이 발생하는 경우가 많아 안전성이 확보된 치료법 연구가 지속적으로 필요한 실정이다

.

한의학적 관점에서 류마티스 관절염은 痺症과 歷節風의 범주에 해당하며, 風寒濕과 熱, 그리고 음식과 생활환경 또 한 관련이 있다고 하였다

. 치료법으로는 祛風散寒, 溫通 經脈, 淸熱除濕, 活血和瘀, 祛痰, 補氣血, 補腎助陽, 滋陰 養肝 등을 목표로 삼는다

.

본 연구에서 사용한 藥鍼療法은 鍼, 藥物療法을 결합한 방법으로 원하는 穴位에 대한 침 자극과 약물의 개별적 특 성을 이용한 복합적 효과를 도모하는 장점이 있으며, 류마 티스 관절염 연구에서 다양하게 쓰이고 있다

.

丁公藤 (Erycibae Caulis)에 대해 Im 등

은 조골 세포 증식 및 파골세포 억제의 결과를 보고하였고, Chu

는 nerve 결찰 모델에서 진통 효과를 보고하였다. 玄胡索 (Corydalis Tuber)에 대해 Choi 등

이 玄胡索 추출물이 염증 매개 물질을 조절하는 결과를 보고하였고, Yoon 등

은 관절염 병태 모델 치료 효과를 보고하였다. 그렇지만 아

직 丁公藤玄胡索의 혼합방이 보이는 류마티스 관절염 치 료 효과에 대하여 보고된 바가 없었다.

본 연구는 丁公藤玄胡索 藥鍼의 류마티스 관절염 치료 에 대한 효능을 규명하고자 In vivo에서 collagen-in- duced arthritis(CIA) mouse에서 인체의 足三里 (Jok- samli, ST36)에 상응하는 혈위에 丁公藤玄胡索 藥鍼 투 여 후 육안적 관찰 및 Rheumatoid Arthritis Index (AI) 측정, 혈액 내의 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 등 면역세 포와 혈청 내의 면역글로블린 및 Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-17, Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, Granulocyte-macrophage Stimulating Factor (GM- CSF) 등의 cytokine과 chemokine의 생성량을 측정하였 다. 3D micro-computed tomography (micro CT)를 통한 관절 상태, 골밀도, 관절 염증 정도 측정과 병리조직 학적 변화를 측정하였으며 안전성 검사 또한 확인하여 유 의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1.재료 1)약재

본 실험에 사용한 丁公藤玄胡索 (Erycibae Caulis and Corydalis Tuber, 이하 EC로 표기)의 구성 약재들은 ㈜옴 니허브에서 구입해 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선 후 사용하였고, 그 내용 및 분량 (1첩)은 다음과 같다(Table 1).

2)실험동물의사양및관리

실험동물인 수컷 5주령의 DBA/1 생쥐 (16 ∼ 22 g)를

㈜중앙실험동물에서 공급받았으며 실험 당일까지 충분한 고형사료 (㈜퓨리나)와 물을 공급하고 온도 22 ± 2 ℃, 습 도 55 ± 15 %, 12시간 - 12시간 주기(light - dark cycle) 의 환경에서 2주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 본 실

Table 1. ThePrescriptionof ErycibaeCaulis and CorydalisTuber

Pharmacognostic name Weight(g)

Erycibae Caulis 30

Corydalis Tuber 30

Total amount 60

험은 대전대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인 (동물사 용 윤리위원회 승인번호–DJUARB 2015-029)을 받아 동물윤리준칙에 의거해서 실험하였다.

3)시약

Isopropanol (Sigma Co., U.S.A.), gelred (Sigma Co., U.S.A.), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS: Welgene, Korea), ether(SigmaCo., U.S.A.), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), streptomycin (Hyclone Co., U.S.A.), 2,2'- azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid) (ABTS : Sigma Co., U.S.A.), formaldehyde (Sigma Co., U.S.A.), trypan blue (Sigma Co., U.S.A.), Im- munization Grade Bovine Type II Collagen, Solution (Chondrex Co., U.S.A) 등을 사용하였다.

4)기기

Rotary vacuum evaporator (Bu

chi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO

incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), cleanbench(VisionscientificCo., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimadizu Co., Japan), centrifuge(SigmaCo., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany) 등을 사용하였다.

2.방법 1)시료추출

EC 1첩 (60 g)에 80 % 에탄올 1,200 ㎖을 넣어 3시간 동 안 환류 추출을 한 후 여과액을 rotary vacuum evapo- rator로 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말 2.4 g을 얻었고, 얻어낸 분말을 초저 온 냉동고 (-80 ℃)에서 보관하며 실험에 필요한 농도로 증류수에 희석해 사용하였다.

2)약침액의제조

분쇄기를 이용하여 EC 2첩 (120 g)을 분쇄해서 분말로 만든 후, 삼각 flask에 넣고 증류수 500 ㎖를 가해 3시간 동안 환류 추출하였다. 여과지로 3회에 걸쳐 추출액을 여 과한 후 rotary evaporator로 감압 농축하였다. 농축액에

90 % ethyl alcohol 30 ㎖를 가하였으며, 실온에서 교반 한 후 놓아두어 침전물이 생성되게 한 후 여과하였다. 이 여과액을 rotary evaporator에서 감압 농축한 다음, 다시 농축액을 여과하였다. 80 % ethyl alcohol 30 ㎖를 이 여 과액에 가하여 잠시 교반한 후 놓아두어 침전물이 생성되 게 한 다음 여과하였다. 70 % ethyl alcohol 30 ㎖를 여과 액에 가하고 교반한 뒤 놓아두었다가 다시 여과하는 과정 을 총 2회 반복하였다. Rotary evaporator를 사용해 여 과액 중의 ethyl alcohol 성분을 감압 제거하여 남은 농축 액을 20 ㎖가 되게 하였다. EC에서 얻은 실시액을 감압 농 축해 건조한 분말을 1M NaOH를 이용해서 pH 6.8의 농 축액이 되도록 조절하고, 12시간 동안 4 ℃에서 놓아둔 후 syringe filtering하여 침전물을 제거하였다. 여과한 농축 액에 PBS를 첨가해 5 %로 희석하여 丁公藤玄胡索藥鍼 (CombinationofErycibaeCaulisandCorydalisTuber Pharmacopuncture, 이하 ECP로 표기)으로 사용하였다.

3)안전성검사

혈청 내의 Aspartate aminotransferase (AST), Ala- nine aminotransferase (ALT), Creatinine, Blood urea nitrogen (BUN) 활성도를 측정하기 위해서 실험 종 료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 대전대학교 한방BIO FabLab (Dae- jeon, Korea)에 분석 의뢰하였다.

3. In vivo

1)류마티스관절염유발및약침처리

농도 2 ㎎/㎖인 제2형 콜라겐 용액을 동일한 농도인 complete Freund’s adjuvant (CFA)와 1：1의 비율로 혼합하였다. 5주령의 DBA/1 생쥐를 2주간 안정기를 거쳐 7주령이 된 생쥐에 꼬리의 기저부에서부터 1.5∼3 cm 아 래쪽의 피내를 통하여 제2형 콜라겐 100 ㎍인 혼합액 0.1

㎖을 천천히 주입함으로써 1차 유발을 하였다. 1차 유발 후

2주 후에 1차 시기와 동일하게 CFA 대신에 incomplete

Freund’s adjuvant (IFA)와 혼합하고 오른쪽 발바닥에

주사하여 CIA-mouse를 유발하였다. 실험은 6마리씩 정

상군, 대조군, 양성대조군, 실험군 등 총 4개의 군으로 나

누었다. 정상군은 실험 기간 동안 무처치하였으며 양성 대

조군에는 indomethacin (이하, Indo)을 200 ㎕ (200 ㎎

/㎏)씩 경구투여하였고, 대조군인 증류수 실시군과 ECP군

은 각각 50 ㎕를 인체의 足三里에 상응하는 혈위에 시행하

였다. 실험은 5주간 이틀에 한 번씩 진행하였으며, 진행하 는 동안 자유 식이를 하였다.

2)Rheumatoid Arthritis Index (AI)측정

2차 주사 이후에 Rheumatoid Arthritis index score 확인을 위하여 DBA/1 생쥐에서 각 4개의 발 (paw)을 관 찰해 발마다 0 ∼ 4점 (총점 0 ∼ 16점)의 임상점수, 발목 의 두께 변화, 발생률 등을 측정하였다. 측정은 9주차부 터 13주차까지 매주마다 기록하였고 기준은 다음과 같다 (Table 2).

3)혈액내면역세포측정

실험 종료 후에 DBA/1 생쥐로부터 심장 천자법을 이용 하여 채혈하고 전혈과 20분간 6,500 rpm에서 원심분리한 혈청을 통해 서울의과학연구소(Seoul, Korea)에 백혈구 와 호중구, 림프구, 단핵구의 함량을 분석 의뢰하였다.

4)혈청내cytokine,chemokine 및면역 글로불린생성량측정

실험을 종료한 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장 천자법으로 채혈한 다음 20분간 6,500 rpm에서 원심분리 해서 혈청을 분리하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α농도를 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이 용해서 다음과 같이 측정하였다. 50배 희석한 혈청 25 ㎕ 씩 각 well에 분주하고 matrix buffer, assay buffer 및 antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕ 가해 혼합하 여 2시간 동안 실온에서 반응시키고 2회에 걸쳐 washing 완충 용액을 이용해 세척하였다. 이에 다시 25 ㎕의 de- tection antibody를 가해 1시간 동안 실온에서 암소 반응 시켰고, 추가로 25 ㎕의 Streptavidin-Phycoerythrin 을 가해 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 washing 완충 용액을 이용해 2회 세척하였다. 세척 후 PBS를 150 ㎕ 넣 어 5분간 shaking한 후 Luminex를 이용해 측정하였다.

ELISA kit를 이용하여 IL-17, GM-CSF를 다음과 같

이 측정하였다. Microwell에 coatingbuffer100 ㎕를 분 주시킨 후 4 ℃에서 overnight하고 washing 완충 용액으 로 3회 세척하였다. Block buffer를 well당 200 ㎕씩 분 주하고 1시간 동안 실온에 놓아둔 후 washing 완충 용액 으로 세척하여 50배 희석한 혈청을 각 100 ㎕씩 분주하였 다. 이를 실온에서 2시간 놓아둔 후 다시 세척하였다. 그 후 100 ㎕씩의 detection antibody를 처리하고 1시간 후 세 척하였다. Avidin-HRP를 100 ㎕ 가해 30분간 실온에서 반응시킨 후 washing 완충 용액으로 7회 세척하였다.

Substrate Solution을 100 ㎕ 가하고 15분 후에 50 ㎕ Stop solution을 넣고 ELISA reader 450 ㎚로 흡광도를 측정하였다.

ELISA kit를 이용하여 Immunoglobulin M (IgM)과 Immunoglobulin G (IgG) 생성량을 다음과 같이 측정하 였다. 항체를 coating 완충 용액에 희석하고 microwell 에 coating한 후 4 ℃에서 overnight했다. 각 well은 washing 완충 용액으로 3회 세척한 후 50배로 희석한 혈 청을 100 ㎕씩 분주했다. 이를 1시간 동안 실온에서 반응 시키고 2회 washing 완충 용액으로 세척한 후, avidin- HRP conjugated antibody 100 ㎕로 처리하고 실온에서 1시간 반응 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100

㎕씩 분주해 암소에서 30분간 반응시킨 다음 50 ㎕로 Stop solution을 처리하였다. ELISA reader 450 ㎚로 흡광도를 측정하였다.

4.방사선검사및Structural Parameter 측정

5주간 실험 종료 후 동물을 희생해서 각 그룹별로 후 족부를 분리하였다. 분리한 후족부의 시편에서 사후 경 직이 일어나기 전 (5분 내)에 최대한 발가락을 편 후, 10 % 포름알데히드 용액에 고정하였다. Micro-CT 촬영과 Structural Parameter를 ㈜라온바이오 (Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하였다. 후족부 전체를 Micro-CT로 촬영 한 후 3D 작업을 실시하였고, Structural Parameter 측 정 시 가운뎃발가락을 기준으로 해서 BV (bone volume) 및 BS (bone surface)에 대한 ratio를 산출해 관절의 염 증 정도를 나타내었다.

5.조직염색관찰

에틸에테르 (C2H5OC2H5)로 마취하고 후족부를 잘라 Table 2. StandardofRheumatoidArthritisIndexScore

Rheumatoid Arthritis

index Inflammation-induced degree

0 no arthritis

1 small degree of arthritis

2 light swelling

3 medium swelling

4 severe swelling

내고 각 실험군별로 적출한 조직을 48시간 동안 10 % 중성 포르말린에 고정하여 고정이 완료된 조직들을 12시간 흐르 는 수돗물에서 수세한 후 조직 내의 고정액을 완전 제거하 였다. 조직의 탈수를 위하여 60 ~ 100 % 알코올까지 농도 상승순으로 탈수하였고, xylene에 투명 과정을 거친 후 파 라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블럭은 박편절단기 (mi- crotome)를 이용하여 3 ∼ 4 ㎛ 두께로 절편을 만들고 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 후 hematoxyline과 eosin (H&E) 염색 및 masson trichrome stain 염색을 각각 실 시해 광학현미경상으로 관찰 및 사진을 촬영하였다.

6.통계처리

실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's t－

test와 ANOVA를 사용하여 통계 처리하였고 p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.

Ⅲ. 결과

1.안전성검사

AST를 측정한 결과 정상군은 135.0 ± 11.2 IU/L, ECP 군은 135.0 ± 14.7 IU/L로 나타났으며, ALT를 측정하여 정상군은 28.0 ± 1.5 IU/L, ECP군은 25.5 ± 6.8 IU/L 로 정상군에 비해 통계적으로 유의한 차이가 없었다.

Creatinine 농도를 측정한 결과, 정상군은 1.6 ± 0.3

㎎/㎗, ECP군은 1.4 ± 0.4 ㎎/㎗로 나타났으며, BUN 농 도를 측정하여 정상군은 35.0 ± 5.0 ㎎/㎗, ECP군은 37.0 ± 4.9 ㎎/㎗로 나타나 정상군과 비교하여 통계적으 로 유의한 차이가 없었다.

2. In vivo

1)DBA/1생쥐의육안적관찰및AI 측정

CIA-mouse에서 실험이 진행되는 5주 동안 육안적으 로 관찰한 결과, 대조군에서는 발 (paw)과 발목 및 마디 등 의 부종이 점차 심해지는 반면, 양성 대조군과 ECP군은 부 종과 관절의 변형이 대조군에 비하여 진행이 많이 이루어

지지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). AI 지수는 대조 군이 9주차에서 8.7 ± 0.3, 10주차에서 10.5 ± 0.4, 11주 차에서 12.5 ± 0.3, 12주차에서 14.5 ± 0.4, 13주차에서 14.8 ± 0.3의 결과가 나타난 반면에 양성 대조군은 9주차 에서 7.9 ± 0.1, 10주차에서 9.0 ± 0.4, 11주차에서는 8.7 ± 0.3, 12주차에서는 9.4 ± 0.5, 13주차에서 9.9 ± 0.4의 결과를 나타냈다. ECP군은 9주차에서 9.0 ± 0.4, 10주차에서 9.5 ± 0.3, 11주차에서 10.3 ± 0.3, 12주차에 서 10.5 ± 0.3, 13주차에서 10.6 ± 0.1로 대조군에 비하 여 모두 유의성 있게 감소를 나타내었다(Fig. 2).

2)혈액내면역세포에미치는영향

실험 종료 후 혈액 내 백혈구를 측정한 결과, 대조군은 5.3 ± 0.4 × 10

cells/㎕로 나타난 반면, 양성 대조군은 3.3 ± 0.8 × 10

cells/㎕, ECP군은 3.6 ± 1.2 × 10

cells/㎕로 나타났다. 혈액 내 호중구를 측정한 결과, 대조 군은 7.8 ± 3.3 %로 나타난 반면, 양성 대조군은 5.6 ± 2.1 %, ECP군은 7.0 ± 1.8 %로 나타났다. 혈액 내의 림프 구를 측정한 결과, 대조군은 4.4 ± 0.4 %로 나타난 반면, 양성 대조군은 3.8 ± 0.5 %, ECP군은 3.9 ± 0.6 %로 나 타났다. 혈액 내 단핵구를 측정한 결과, 대조군에서는 0.7 ± 0.1 %로 나타난 반면, 양성 대조군은 0.3 ± 0.1 %, ECP군은 0.4 ± 0.1 %로 나타나 모두 대조군에 비하여 감 소하였으나 유의성 있는 차이는 없었다.

3)혈청내면역글로불린생성량에미치는영향

(Fig. 3) (1) IgM

실험 종료 후 혈청 내 IgM을 측정한 결과, 대조군은 49.7 ± 7.6 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 32.7 ± 6.3 pg/㎖, ECP군은 35.8 ± 4.2 pg/㎖로 나타나 대조군 에 비해 유의성 있게 감소하였다.

(2) IgG

실험 종료 후 혈청 내의 IgG를 측정한 결과, 대조군은 134.9 ± 10.5 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 99.1 ± 7.8 pg/㎖, ECP군은 120.6 ± 8.4 pg/㎖로 나타 나 대조군에 비하여 감소하였다.

4)혈청내cytokine 및chemokine 생성량 에미치는영향 (Fig. 4)

(1) IL-1β

실험 종료 후 혈청 내의 IL-1βcytokine을 측정한 결과,

대조군은 675.9 ± 58.4 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조

군은 472.9 ± 34.9 pg/㎖, ECP군은 462.3 ± 33.8 pg/

㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다.

(2) IL-6

실험 종료 후 혈청 내 IL-6 cytokine을 측정한 결과, 대 조군은 755.0 ± 214.3 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군 은 375.3 ± 144.1 pg/㎖, ECP군은 423.4 ± 114.7 pg/

㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다.

(3) IL-17

실험 종료 후 혈청 내의 IL-17 cytokine을 측정한 결과,

대조군은 13.4 ± 1.3 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군 은 10.3 ± 0.3 pg/㎖, ECP 투여군은 10.1 ± 0.4 pg/㎖

로 나타나 대조군에 비해서 감소하였으나 유의성 있는 차 이는 없었다.

(4) TNF-α

실험 종료 후 혈청 내 TNF-αcytokine을 측정한 결과, 대조군은 2,774.4 ± 123.5 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대 조군은 2,004.8 ± 165.7 pg/㎖, ECP 투여군은 1,887.6

± 199.6 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감 소하였다.

Fig.1.ComparisonofRheumatoidArthritismanifestationinDBA/1micebetweencontrolandexperimentalgroup

*: W : Weeks

Control : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

Indo : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

ECP : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

Control Indo ECP

9 W*

11 W

13

W

(5) GM-CSF

실험 종료 후 혈청 내 GM-CSF chemokine을 측정한 결과, 대조군은 288.9 ± 87.5 pg/㎖로 나타난 반면, 양 성 대조군은 124.5 ± 21.9 pg/㎖, ECP군은 168.8 ± 21.8 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소 하였다.

4.관절에미치는영향 1)관절상태

실험을 종료한 후 micro-CT로 후족부를 촬영하여 3D 로 변환하였다. 대조군에서는 관절의 변형과 파괴가 크게 일어났으며(Fig. 5-B), ECP군에서는 관절의 변형은 일어

Fig.3.EffectofECPonthelevelofImmunoglobulinsintheserumofCIA-inducedRheumatoidArthritismodelof DBA/1mice

The results were represent the mean ± standard deviation. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.01, †: p＜0.05).

(A) Immunoglobulin M (B) Immunoglobulin G.

Normal : Non treated DBA/1 mice.

Control : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

Indo : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

ECP : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

†

* *

(A) (B)

Fig.2.EffectsofECPonRheumatoidArthritisindexscoreinCIA-inducedDBA/1mice

Rheumatoid Arthritis index was defined as the sum of the individual scores graded as 0 (no arthritis), 1 (small degree of arthritis), 2 (light swelling), 3 (medium swelling), 4 (severe swelling). The results represent the mean ± standard deviation. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.001, †: p＜0.01).

Control : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

Indo : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

ECP : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

†

*

났으나 대조군에 비하여 관절 마디의 부식 및 파괴가 적게 나타났다(Fig. 5-D).

2)골밀도및관절염증정도

실험을 종료한 후 3D micro CT로 후족부를 분석하고 bone volume에 대한 ratio를 산출해 골밀도를 측정한 결 Fig.4.EffectofECPonthelevelofCytokinesandChemokinesintheserumofCIA-inducedRheumatoidArthritis modelofDBA/1mice

The results were represent the mean ± standard deviation. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.001, †: p＜0.01, ‡: p＜0.05).

(A) Interleukin 1β (B) Interleukin 6 (C) Interleukin 17.

(D) Tumor Necrosis Factor-α (E) Granulocyte-macrophage Stimulating Factor.

Normal : Non treated DBA/1 mice

Control : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

Indo : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

ECP : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

†

*

(E)

(C) (D)

(A) (B)

‡ ‡

‡

‡

‡

†

과, 대조군은 0.17 ± 0.05 (U^3)로 나타난 반면, 양성 대 조군은 0.33 ± 0.04 (U^3), ECP군은 0.31 ± 0.03 (U^3) 으로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 증가하였다.

또한 Bone surface와 bone volume에 대한 ratio를 산 출해 관절의 염증 정도를 측정하였으며, 대조군은 28.40

± 1.15 (1/U)로 나타난 반면, 양성 대조군은 20.40 ± 0.68 (1/U), ECP군은 21.20 ± 0.83 (1/U)로 나타나 대조

군에 비해 유의성 있게 감소하였다(Fig. 6).

5.조직변화에미치는영향

생쥐의 후족부에 H&E와 M-T 염색을 해서 25×로 측 정한 결과, 대조군에서는 면역세포의 침투 및 활막세포의 Fig.5.EffectsofECPonimagingofcartilagedegenerationusingmicroCT-arthrographyinpawhindofCIA-in- ducedRheumatoidArthritismodelofDBA/1mice

A : Non treated DBA/1 mice.

B : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

C : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

D : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

Fig.6.EffectsofECPonboneusing3DMicro-CTofCIA-inducedRheumatoidArthritismodelofDBA/1mice The results were expressed as mean ± standard deviation. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.01, †: p＜0.05).

(A) Bone volume ratio (B) Bone surface / bone volume ratio.

A : Non treated DBA/1 mice.

B : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

C : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

D : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

† †

* *

(A) (B)

손상, 연골의 침하, 관절의 부식이 심하게 일어난 반면(Fig.

7-B), ECP군은 대조군에 비해 면역세포의 침투나 활막세 포의 손상, 연골의 침하, 그리고 관절의 부식이 상대적으로 적게 나타났다(Fig. 7-D).

Ⅳ. 고찰

류마티스 관절염은 가동 관절 내의 활막에 염증이 발생 하는 전신성 질환으로

40~60대에 가장 흔하게 발생하며 연령이 증가할수록 남성보다 여성 환자가 증가하는 경향성 을 갖는다

. 환경적인 요인과 유전적인 요인에 모두 영향 을 받는 자가면역질환

이라는 학설이 대표적이며, 다양 한 감염성 질환에 의한 지속적인 관절 조직의 손상으로부 터 비롯되었다는 설 또한 존재한다

. 이 외에도 비타민 결핍, 호르몬 부조화 등으로 류마티스 관절염이 초래된다 는 연구 가설이 있다

.

류마티스 관절염의 증상은 크게 3가지의 단계로 볼 수

있다. 첫 번째 단계에서는 관절에 활막염이 발생하여 통증, 뻣뻣함, 열감, 부종을 초래하고, 두 번째 단계에서는 활막 의 여러 세포들이 급속히 분열, 성장하여 형성된 pannus 라는 특징적인 침윤성 조직이 연골과 뼈, 인대에까지 침범 하여 파괴된다. 이로 인해 연속적인 관절 변형이 일어나 세 번째 단계에서는 움직임에 제한이 발생하며, 통증이 더욱 심해진다

. 관절 외에도 전신적인 증상이 나타나며 류마 티스성 결절, 맥관염, 안병증, 신경기능 장애, 심폐기능 장 애, 흉선기능 저하 등이 발생된다

.

조직학적으로 기전을 살펴보면, 활막층에 거대세포와 림 프구의 집합체 침윤이 시작되며

, T 림프구에서 발현된 T- helper (Th) 1, Th2, Th17 등은 Interferon (IFN)-γ, Interleukin 등의 cytokine 분비를 일으킨다

. 특히 IFN-γ는 단백분해효소를 조절하는 TNF-α, IL-1β의 형 성을 초래한다

. TNF-α는 IL-1β, IL-17 등의 cytokine 과 함께 pannus에 풍부하게 관찰되는 대식세포를 파골세 포로 분화시켜 관절 손상을 유발하고, 단핵구성 식세포로 하여금 단백분해효소를 생성하게 하여 조직 파괴를 일으킨 다

. 또한 활막세포를 자극하여 GM-CSF의 분비와 프로 스타글란딘의 생성을 증가시켜 활막 염증 반응의 기전에 Fig.7.EffectsofECPhistopathologicexaminationanalysisofCIA-inducedRheumatoidArthritismodelofDBA/1mice A : Non treated DBA/1 mice.

B : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated with Normal Saline pharmacopuncture (every two days).

C : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

D : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group were treated with Erycibae Caulis and Corydalis Tuber pharmacopuncture (200 ㎎/㎏/every two days).

주요한 역할을 담당한다

. GM-CSF는 자가항원을 au- toreactive T cell에 전달함으로써 T 세포를 자극해 관절 에 염증 반응을 초래한다

. IL-6는 TNF-α의 하위염증매 개물질로서 염증을 증폭시키는 역할을 한다

. IL-17은 TNF-α와 IL-1의 생성을 조절해 활막세포, 단핵구, 대식 세포, 연골세포 등에 다양한 cytokine을 분비하게 하여 관 절의 염증 상태를 유도하며

, T 림프구가 질병 초기에 다 량 분비한다

.

B 림프구에 의한 면역글로불린도 관찰되는데, 이 IgG에 대한 자가항체인 항CCP 항체는 비교적 특이적이어서 류 마티스 관절염의 진단과 병인에 중요하다고 알려져 있다

. 면역글로불린은 바이러스나 세균 등의 항원을 비활성화시 키고 항체의 역할을 하는 당단백질이다

. 류마티스가 발생 하면 RF로 인해 IgG-IgM 복합체가 형성되어 관절에 침 착하고

, 이 IgG는 호중구와 함께 탐식 작용을 일으킨다

36)

. 또한 대식세포로 분화해 탐식 작용을 하는 단핵구와 이 를 촉진하는 림프구 등 백혈구의 작용으로 인해 염증 반응 이 일어난다

.

류마티스 관절염의 임상적인 양상은 개인차가 클 뿐 아 니라 같은 환자에서도 질환의 경과에 따라 다양하고, 삶의 질에 상당한 영향을 미치며 예후가 좋지 않은 편이다

.

최근에는 초기부터 적극적인 DMARDs 처방의 중요성 이 대두되었으며

, 비특이적 면역조절을 목적으로 하기보 다는 류마티스를 유발하는 특정 물질을 차단하는 방법이 사용되고 있다

. 면역세포의 염증성 cytokine을 표적으 로 하는 치료로 류마티스 관절염의 서양의학적 의술이 크 게 향상되었지만, 여전히 그에 불완전한 반응을 보이거나 전혀 반응하지 않는 환자들도 상당 비율을 차지하며, 실질 적 치료는 경험적 치료에 입각한 면역기능의 균형과 염증 상태 완화 목적의 대증적, 복합적 처치가 중심을 이루고 있 다

.

현재의 이러한 한계점은 앞으로도 더욱 심도 있는 류마 티스 관절염의 기전 연구와 치료법 개발이 꾸준히 필요하 다는 점을 시사하며, 한의학적으로도 치료의 새로운 지평 을 열 수 있다는 가능성을 제시한다

. 그러나 고전 문헌에 서 류마티스 관절염과 유사한 범주의 질환에 대해서는 임 상과 실험적 연구를 토대로 한 기초 자료가 많지 않아

이 를 보완하여 한의학적 치료 근거를 마련하기 위한 토대가 필요한 실정이다.

류마티스 관절염을 한의학에서는 痺症과 歷節風의 범주 에 포함시킬 수 있다

. 痺는 저리면서 순환이 안 되는 상 황을 일컫고, 歷節風은 痺로 인해 관절이 붓고 심한 疼痛 과 함께 屈伸不利하며 紅腫, 下肢腫痛, 脚腫如脫, 手指變 曲, 夜間痛甚하는 증상을 일컬어 단순한 관절의 염증에서

확대된 전신질환으로 보고 있다

.

최근 류마티스 관절염에 대한 한의학계의 CIA-mouse 모델을 사용한 연구가 2007년부터 2015년까지의 29편 논 문 중 20편으로 나타났다

. CIA 모델은 collagen으로써 관절염을 유발하여 인간의 류마티스 관절염과 병리, 조직, 면역학적으로 유사하게 발현하는 장점이 있으며, 체액성 면역과 세포성 면역을 동시에 활성화하는 기전으로 만성 활막염을 유발한다

.

藥鍼療法은 經絡論에 기반한 鍼灸療法과 氣味論에 기 반한 藥物療法을 결합한 新鍼療法

중 하나로 한약제를 정제, 추출하여 다양한 방법으로 제조된 약침액을 질환과 관련된 혈위에 주입함으로써 자침과 약물의 복합적인 효과 를 얻을 수 있는 한의학의 독특한 치료법이며, 사용하는 약 제의 특성과 조제법에 따라 응용 가능한 질환의 다양성, 빠 른 약효와 투약량의 정확성, 약의 내복이 어려운 환자에게 적용 가능한 편의성 등의 장점이 있다

.

본 연구에서는 丁公藤, 玄胡索으로 구성된 藥鍼을 CIA- mouse의 足三里 (Joksamli, ST36)에 실시하였다. 丁公 藤은 메꽃과의 덩굴성줄기로 기존 연구에서 조골세포 증식 과 파골세포 활성을 유발하는 tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) 활성 억제와 진통의 효과를 보고하 여 류마티스 관절염에서의 활용 가능성을 제시하였다

. 玄胡索은 양귀비과의 다년생 초본인 玄胡索 및 同屬 近緣 植物의 塊莖을 건조한 것으로 玄胡索 추출물은 cyclooxy- genase-2 (COX-2)의 활성이 억제되게 하여 프로스타글 란딘, cytokine을 억제함으로써 염증 매개 물질을 조절하 는 결과를 나타냈다

. Yoon 등

은 玄胡索과 紅花, 赤芍 藥 복합 추출물을 사용하여 관절염 병태 모델에서의 부종 감소, WBC 감소를 통한 항염증 효과를 보고하였다. 丁公 藤과 玄胡索은 이렇듯 각각의 류마티스 관절염에 대한 치 료 효과는 알려져 있으나 그 복합 추출물에 대한 효과는 아 직 보고되지 않았다.

본 연구에서는 In vivo에서 CIA-mouse의 발을 관찰하 여 AI를 측정하였고, 혈액 내 백혈구, 호중구, 림프구, 단 핵구 등 면역세포의 함량, 혈청 내 cytokine과 chemokine 및 면역 글로불린을 측정하였다. 실험 종료 후 관절에 미치 는 영향을 확인하고자 동물 후족부의 3D micro CT 촬영 및 Structural Parameter를 측정하였고, 병리조직학적 검사를 시행하였다.

ECP의 5주간 투여 후 간과 신 독성 검사를 실시해 혈청 내의 AST, ALT, creatinine, BUN 농도를 측정한 결과 정상군과 큰 차이를 나타내지 않아 안전성을 확인하였다.

CIA-mouse를 사용한 In vivo 실험에서 대조군에서는

발, 발목 관절에 육안적으로 부종이 점차 진행되었으나, 양

성 대조군과 ECP군은 대조군에 비하여 부종과 관절의 변 형이 대조군에 비하여 진행이 많이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 류마티스 관절염 유발 후 9주차 부터 13주차까지 측정한 AI 지수에서 양성 대조군과 ECP 군 모두 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다 (Fig. 2). 이와 같이 류마티스 관절염 증상에 ECP 투여가 호전 반응을 보인 것을 확인하였다.

ECP 투여 종료 후 혈액 내 면역세포에 미친 영향을 보기 위해 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구를 측정하였으며 모두 대조군에 비해 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다.

또한 ECP 실시로 인해 혈청 내 IgM, IgG의 생성량에 미 치는 영향을 확인하였다. 측정 결과 IgM과 IgG 모두 대조 군에 비하여 감소를 나타내었으며, 특히 IgM은 유의성 있 게 감소하였다(Fig. 3).

류마티스 관절염이 발현되었을 때 증가되어 관찰되는 cytokine 및 chemokine을 관찰하였다. 그 결과, IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-CSF 생성량은 대조군에 비하여 유 의성 있게 감소하였다(Fig. 4).

실험 종료 후 후족부를 촬영한 3D micro CT를 통해 ECP 투여가 관절에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 대 조군에서는 관절의 변형과 파괴가 크게 일어났으나(Fig. 5- B), ECP군에서는 대조군에 비하여 관절의 변형은 일어났 지만 관절 마디의 부식 및 파괴가 적었음을 확인할 수 있었 다(Fig. 5-D). 골밀도를 측정한 결과, 대조군에 비하여 유 의성 있는 증가를 나타내었고, 관절의 염증 정도를 측정한 결과, 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 6).

조직 변화에 미치는 영향을 확인하기 위한 병리조직학적 검사에서 대조군은 면역세포의 침투와 활막세포의 손상, 연골의 침하 및 관절의 부식이 심하게 일어난 반면(Fig. 7- B), ECP 투여군은 그 정도가 상대적으로 적게 나타났다 (Fig. 7-D). 이러한 결과로 볼때 ECP 투여가 관절의 부식, 파괴, 염증을 억제하고 활막세포의 손상을 방지하며 골밀 도를 증가시키는 효능이 있다고 추정할 수 있다.

본 연구에서 in vivo의 양성대조군으로 indomethacin 200 ㎕ (200 ㎎/㎏) 경구투여군을 설정하였다. Indo- methacin은 NSAIDs의 한 종류로 류마티스 관절염에서 의 통증과 염증을 줄이는 작용으로 널리 쓰이는 약물이다.

그러나 장기 복용하는 경우 위장관계에서 궤양 유발, 장 출 혈 등 부작용을 초래할 수 있고, 낮은 수용성으로 인해 경 구투여 시의 생물학적 가용능이 낮아 보다 안전하고 효율 적인 치료법 개발이 필요한 것으로 사료된다

. 본 연구 결 과, 양성대조군이 ECP군에 비해 AI 지수와 혈액 내 면역 세포, 혈청 내 면역글로불린, cytokine 및 chemokine 중 IL-6와 GM-CSF 생성량, 골밀도와 관절 염증에서 비교

적 우수한 효능을 보였다. 반면 혈청 내 IL-1β, IL-17, TNF-α의 생성량은 ECP군에서 더욱 우수한 효능이 나타 났다. 그러므로 류마티스 관절염 치료의 효율을 증가시키 고 부작용의 위험을 감소시키기 위해 기존에 사용하는 In- domethacin과 본 藥鍼을 병행 투여하는 가능성을 제시할 수 있을 것으로 사료된다.

이상의 연구 결과를 종합하여 보면, ECP의 足三里 투여 가 collagen-induced arthritis mouse에서 항염증 작용 을 하여 관절염의 증상을 억제하고 관절을 보강하여 진행 을 억제하는 치료 효과를 확인하였다. 이는 추후 ECP의 활 용 가능성을 보여주며, 향후 보다 적극적인 임상 응용을 위 한 초석이 될 수 있을 것으로 기대하는 바이다.

Ⅴ. 결론

丁公藤玄胡索 藥鍼(ECP) 투여가 류마티스 관절염에서 갖는 치료 효과를 규명하기 위해 Collagen-induced arthritis mouse의 足三里에 ECP 투여 후 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. In vivo

1) 육안적 관찰 결과 부종이 대조군에 비해 감소하였으 며, AI 또한 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.

2) 혈액 내 면역세포인 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 모두 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다.

3) 혈청 내 면역 글로불린인 IgM은 유의성 있게 감소하 였고, IgG는 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다.

4) IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-CSF 생성량은 대조군 에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IL-17 생성량은 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다.

2. 관절 상태를 확인한 결과 대조군에 비해 관절 마디의 부식 및 파괴가 적었으며, 골밀도는 대조군에 비해 유 의성 있게 증가하였고, 관절 염증 정도는 대조군에 비 해 유의성 있게 감소하였다.

3. H&E와 M-T 염색 후 25×로 관찰한 결과 면역세포

의 침투와 활막세포의 손상, 연골의 침하 및 관절의

부식이 감소하였다.

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