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이학 박사학위 논문
인간 유래 중간엽줄기세포의 특성 및
면역조절 기능에 대한 연구
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
장 인 근
인간 유래 중간엽줄기세포의 특성 및
면역조절 기능에 대한 연구
지도교수 박 준 은
이 논문을 이학 박사학위 논문으로 제출함.
2010년 8월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
장 인 근
감사의 글
공학석사학위를 받고 회사에서 세포치료제 연구 개발을 하면서 부족한 부분이 많아 시 작한 공부가 주변의 많은 도움으로 이렇게 마무리하게 되었습니다. 그 동안 도움을 주셨 던 많은 분들께 지면을 통해 감사의 말씀을 전하고자 합니다. 먼저 학위를 시작하고자 했을 때 입학을 흔쾌히 허락해 주시면서 논문이 완성되기까지 세심한 지도를 해주신 박준은 교수님과 회사에 다니면서 학위과정 할 수 있도록 아낌없 는 지원과 격려해주신 김영진 소장님께 머리 숙여 감사드립니다. 또한 바쁘신 와중에도 학위 심사를 맡아 많은 도움을 주신 아주대학교 소아청소년과 배기수 교수님과 박문성 교수님, 논문의 방향에 대해 세세하게 지도해주신 연세대학교 송재진 교수님께 깊이 감사드립니다. 항상 함께하며 연구해 온 라이프리버 연구소의 연구원들, 늘 든든한 버팀목이 되어주 신 이두훈 박사님, 수원연구소의 안방마님 양말숙 팀장님, 이종은, 김효은씨와 지금은 함 께 하지 못하지만 엄영우 박사님과 문영준 박사, 인공간 개발에 바쁜 노정권, 정종갑, 장 은미씨 그리고 호탕하신 최수환 사장님께 감사의 말씀 전합니다. 함께 연구를 진행해 온 삼성서울병원 소아청소년과 구홍회 교수님과 항상 친형처럼 대 해주신 유건희 교수님, 끊임없는 토론과 논의를 하면서 함께 연구해 온 동생이지만 형 같은 이명우 박사와 소아청소년과 연구원 김대성, 노유헌, 김혜령 연구원께 진심으로 감 사드립니다. 석사 졸업 후에도 항상 도와주시고 챙겨주신 동국대학교 조직공학연구실 박정극 교수 님과 윤문영 박사님, 이제는 교수님이 되신 서영권 박사님과 윤희훈 박사님, 그리고 캐나 다에 계신 너무나도 보고 싶은 안재일 박사님, 유보영 박사, 박사가 될 신연호, 그리고 만식이, 희정이, 두희에게 감사의 인사 드립니다. 그리고 오랫동안 함께 하고 있는 아주대학교 종양혈액내과 김효철 교수님, 박준성 교 수님, 강석윤 교수님, 이현우 교수님, 정성현 교수님, 인공간 연구에 많은 도움을 주시는 삼성서울병원 외과 이석구 교수님, 이지현 박사님, 김혜정 선생님, 이영아 선생님, 함께 연구하고 있는 연세대학교 조성래 교수님, 항상 가족처럼 대해주시는 메타바이오 김문보 사장님과 박정구 이사님, 드림셀 김정대 사장님과 지원호 사장님, 형님들처럼 늘 좋은 말 씀 해 주시는 서울대학교 신준섭 박사님과 경북대 수의학과 권영삼 교수님께 감사의 마 음을 올립니다. 옆에서 늘 힘이 되는 인생의 동반자 사랑스러운 아내 박은정, 힘들고 지칠 때 웃게 만 드는 아들 승연이와 딸 서연이에게 사랑한다는 말 전하고 싶습니다. 저를 이 세상에 있 게 해 주신 존경하는 할아버지, 아버지, 어머니, 애들 봐 주시느라 늘 고생하시는 장인어 른, 장모님, 캐나다에 있지만 늘 함께 있는 듯한 처형, 형님, 예진이, 준영이, 화목한 가 정 이루고 있는 인숙이와 매제, 귀여운 조카 시은이, 현준이, 그리고 얼렁 장가가야할 막 내 인호에게 진심으로 감사드립니다. 오늘의 내가 있기까지 함께 해주신 모든 분들께 다시 한번 감사드립니다. 2010년 6월 장인근 올림- 국문요약 -
인간 유래 중간엽줄기세포의 특성 및 면역조절 기능에 대한
연구
중간엽줄기세포는 처음에는 골수 내에만 존재하는 것으로 알려져 왔으나 최근 많은 연구와 실험을 통해 그 외 다양한 성체조직에서도 분리배양이 가능하게 되었 다. 중간엽줄기세포는 연골세포, 지방세포, 골세포, 신경세포 등 다양한 조직으로 분 화할 수 있는 능력 외에도 면역조절 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 는 골수, 지방조직, 제대혈, 탯줄의 Wharton's jelly에서 유래된 중간엽줄기세포의 특성 및 면역조절능력을 비교하였고, 면역조절에 관여하는 인자의 기작을 확인하여 향후 면역질환의 치료에 있어서의 임상적 유용성을 가늠할 수 있는 기초 자료를 확 보하고자 하였다. 골수, 지방조직, 제대혈, 탯줄의 Wharton's jelly에서 모두 성공적으로 중간엽줄 기세포의 배양이 가능하였고, 중간엽줄기세포의 조건인 세포모양, 분화능력, 세포표 현형을 모두 만족하였다. 중간엽줄기세포가 분비하는 사이토카인, 케모카인, 성장인 자를 분석한 결과, 전체적으로 비슷하였으나, IL-12(p40), CCL5, CXCL8 PDGF-AA, VEGF의 분비가 다르게 나타났다. 중간엽줄기세포 자체는 면역반응을 유도하지 않았으며, 동종 말초혈액단핵구나 PHA를 이용한 면역세포 자극시 중간엽 줄기세포의 양이 많을수록 면역억제반응이 강하게 나타났고, 면역 반응시 배양 배 지내의 IFN-γ와 TNF-α의 양도 시간에 따라 중간엽줄기세포가 없는 대조군에 비해 증가폭이 감소하였다. 또한 transwell system을 이용하여 soluble factor가 면
역억제에 주요하게 관여한다는 사실을 알 수 있었다. 중간엽줄기세포에서 IFN-γ에 의해 발현되는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 T 세포 증식에 필수적인 tryptophan을 분해하여 면역 억제를 유도한다. 면역세포 증식 실험시 anti-IFN-γ 를 처리하거나, tryptophan을 첨가하여 면역세포의 증식이 회복되는 결과를 통해서 중간엽줄기세포의 T 세포 증식억제에 IFN-γ와 IDO가 관여한다는 사실을 증명하였
다. 또한 중간엽줄기세포에 IFN-γ를 처리하였을 때 세포내 신호전달물질을 확인한
결과 STAT1과 IRF-1이 IDO 발현과 밀접한 관계가 있었다. 중간엽줄기세포에서
IDO 발현을 위한 IFN-γ의 농도와 IDO 발현 시간 및 발현 유지 시간 등을 mRNA와 단백질 분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 IFN-γ 1 IU/ml를 24시간 동안 처리한 중간엽줄기세포와 처리하지 않은 세포를 이용하여 면역반응을 살펴본 결과, IFN-γ를 처리한 중간엽줄기세포의 면역세포 증식억제 효과가 더 강하게 나타 났다. 네 가지 조직 유래 중간엽줄기세포 모두 효과적으로 면역세포의 증식을 억제하 였으며, IDO의 발현 증가가 면역억제 기전에 공통적으로 관여하는 것을 확인하였 다. 향후 골수 채취에 비해 덜 침습적인 지방조직이나 비침습적인 방법으로 수득한 제대혈 또는 탯줄의 중간엽줄기세포를 면역질환 치료에 이용할 수 있을 것으로 기 대된다. 핵심어: 중간엽줄기세포, 골수, 지방조직, 제대혈, 탯줄, 면역조절, IFN-γ, IDO
차 례
국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· ⅲ 그림 차례 ··· ⅴ 표 차례 ··· ⅷ 약어 ··· ⅸ Ⅰ. 서론 ··· 1 A. 연구배경 ··· 1 1. 조혈모세포 이식 ··· 1 2. 중간엽줄기세포 ··· 23. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ··· 6
4. 줄기세포치료제 ··· 8 B. 연구목적 ··· 10 Ⅱ. 재료 및 방법 ··· 12 A. 검체 ··· 12 B. 중간엽줄기세포의 분리 및 배양 ··· 12 C. 중배엽성 조직으로 분화 ··· 14 D. 유세포분석 ··· 15
E. Multiple cytokine assay ··· 15
F. 혼합림프구반응 또는 PHA 유도 T 세포 증식반응 ··· 16 G. Transwell assay ··· 16 H RT-PCR ··· 17 I Western blotting ··· 18 Ⅲ. 결과 ··· 20 A. 중간엽줄기세포의 분리 배양 및 그 특성 ··· 20 B. 중간엽줄기세포의 면역세포증식 억제 ··· 25
C. 중간엽줄기세포에서 면역조절인자의 발현 및 그 기작 ··· 35
Ⅳ. 고찰 ··· 50
Ⅴ. 결론 ··· 57
참고문헌 ··· 58
그림 차례
Fig. 1. The kynurenine pathway of tryptophan degradation in mammalian cells ··· 7
Fig. 2. Differentiation potential of MSCs to connective tissue cells ··· 22
Fig. 3. Immunophenotypes of MSCs ··· 23
Fig. 4. Inhibitory effect of MSCs on immune cell proliferation induced by PHA or allogeneic stimulation ··· 28
Fig. 5. Immnuosuppressive effect of MSCs in direct contact or
transwell system ··· 29
Fig. 6. Allogeneic reaction of PBMC to MSCs ··· 30
Fig. 7. Immunophenotypes of lymphocyte on immune cell proliferation induced by PHA ··· 31
Fig. 8. Secretion levels of IFN-γ and TNF-α from T-cells activated
by PHA ··· 33
Fig. 9. RT-PCR analysis of HGF, IDO, IL-10, TGF-β1, and COX-1, 2 in MSCs after treatment with IFN-γ or TNF-α ··· 34
Fig. 10. Expression levels of IDO mRNA in MSCs after treatment
with IFN-γ and/or TNF-α ··· 38
Fig. 11. Expression levels of IDO mRNA in MSCs after treatment
with various concentration of IFN-γ ··· 39
Fig. 12. Expression time of IDO mRNA in MSCs after treatment
with IFN-γ ··· 40
Fig. 13. Expression of IDO protein in MSCs after treatment with
IFN-γ ··· 41
Fig. 14. Duration of IDO mRNA in MSC after 24hr treatment with
IFN-γ ··· 42
Fig. 15. Re-expression of IDO mRNA in MSC after repeated treatment with IFN-γ ··· 43
Fig. 16. Re-expression of IDO protein in MSC after repeated treatment with IFN-γ ··· 44
Fig. 17. Immunosuppressive effect of MSCs pre-treated with or without IFN-γ ··· 45
Fig. 18. Immunosuppressive effect of MSCs treated with or without
Fig. 19. Anti-immunosuppressive effect of methyl-L-tryptophan
additive ··· 47
Fig. 20. Immunosuppressive effect of the by-product of tryptophan
degradation ··· 48
표 차례
Table 1. Clinical trial status of stem cell therapy products in Korea ··· 11
Table 2. Sequences of primers employed for RT-PCR studies ··· 19
Table 3. Secretory factor levels of MSCs ··· 24
Table 4. Secretory factor levels at PHA-induced proliferation assay
약 어
BM, bone marrow
BrdU, 5-bromo 2'-deoxyuridine CB, cord blood
CCL, chemotactic cytokines ligands, CC chemokines COX-1, 2, cyclooxygenase-1, 2
CXCL, CXC chemokines EGF, epidermal growth factor FGF, fibroblast growth factor Flt, FMS-like tyrosine kinase
GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GM-CSF, granulocyte/macrophage colony-stimulating factor GvHD, Graft versus host disease
HGF, hepatocyte growth factor HLA, human leukocyte antigen IDO, indoleamine 2,3-dioxygenase IFN, interferon
IL, interleukin
JAK, Janus-activated kinase MLR, Mixed leukocyte reaction MSC, mesenchymal stem cell
PBMC, peripheral blood mononuclear cell PDGF, Platelet-derived growth factor PHA, phytohemagglutinin
STAT, signal transducers and activators of a transcription TGF, transforming growth factor
VEGF, vascular endothelial growth factor WJ, Wharton's jelly
I. 서 론
A. 연구배경
1. 조혈모세포 이식
조혈모세포 이식 (Hematopoietic stem cell transplantation)은 백혈병이 나 기타 혈액질환으로 인해 정상적인 기능을 하고 있지 못한 골수를 정상 기능 을 가지고 있는 골수로 바꿔주는 과정이다. 조혈모세포 이식은 화학요법과 방사선 치료를 한 후 조혈모세포를 환자에게 이식하는 것으로 이식된 조혈모세포들이 골수 에 잘 정착하여 자라게 되면 정상 혈액세포를 다시 만들어 골수기능을 정상으로 회 복시키는 치료법이다. 조혈모세포이식이 필요한 질환으로는 급성골수성백혈병, 만 성골수성백혈병, 급성임파구성백혈병, 만성임파구성백혈병과 같은 백혈병, 호지킨 스 병, 비호지킨스 병과 같은 악성 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군과 같 은 악성 혈액질환, 유방암, 전립선암, 소아의 고형암, 고환암, 뇌종양, 육종 같은 고 형암과 재생불량성빈혈, 철결핍성빈혈, 발작성야간혈색소뇨증, 면역 질환 등에도 적 용 시도되고 있다. 2009년 보건복지가족부 중앙암등록본부 암발생률 보고에 따르면 (2006년~ 2007년 암발생률), 14세 이하 소아의 경우 백혈병은 암 발생 수가 가장 높은 질환이고, 세 번째로 비호지킨스 림프종으로 조혈모세포이식 치료가 필요한 환 자가 매우 많다. 조혈모세포는 골수에 위치하고 있으며, 끊임없이 적혈구, 백혈구, 혈소판 을 만들어내는 역할을 하게 된다. 이러한 조혈모세포는 골수뿐만 아니라, 말초혈액, 제대혈 (Cord blood)에도 존재한다. 말초혈액에는 골수만큼 많은 조혈모세포가 있 지 않기 때문에 과립구를 증가시키는 촉진제를 투여한 후, 조혈모세포를 채집하고, 말초조혈모세포는 주로 자가 조혈모세포이식에 사용된다. 제대혈은 분만 직후 태반 에 남아 있는 혈액을 채취하여 저장해 놓은 것으로 미성숙세포가 많아 생착이 더디지만 HLA (human leukocyte antigen)가 완전히 일치하지 않아도 이식이 가능 하다는 장점이 있다. 최근 이러한 제대혈에 대한 효용가치가 알려지면서 제대혈 은
행의 증가와 더불어 제대혈 저장이 많이 이루어짐에 따라 제대혈을 이용한 조혈모세 포이식이 증가하고 있다. 하지만 제대혈 및 골수 이식과 같은 동종 조혈모세포이식 이 늘어남에 따라 이식편대숙주질환 (Graft versus host disease; GvHD)도 점차 늘어나고 있다. 조혈모세포이식에서 이식편대숙주질환의 발생은 환자의 가장 중요한 사망 원인이 되고 있다. 이식편대숙주질환은 Billingham에 의하여 처음으로 제시된 것 으로 기증자 유래의 면역세포가 수혜자의 세포를 이물질 (foreign/non-self)로 여겨 수혜자의 조직을 공격함으로써 나타난다. 이때 관여하는 세포는 주로 T 세 포이고, 위장관, 피부, 간 등의 장기들이 공격을 받는다. 이식편대숙주질환은 임상적으로 급성형과 만성형으로 분류된다. 급성 이 식편대숙주질환은 피부, 간, 위장관의 손상을 초래하고, 만성 이식편대숙주질환은 발현 양상이 더욱 다양하고 호산구성 근막염 (eosinophilic fasciitis), 피부경화 증 (scleroderma)과 유사한 피부증상, 침샘이나 눈물샘 증상 등 자가면역질환과 유사한 증상을 보일 수 있다. 역학적인 연구 목적으로 이식 후 100일을 전후로 급성과 만성 이식편대숙주질환으로 나누는데, 면역억제치료를 중단했을 경우와 같이 100일 후에도 급성 이식편대숙주질환에 해당하는 조직학적 소견이 보일 수 있으므로 병리학적 분류가 더 유용하게 여겨진다. 최근 나이 많은 사람과 혈연관계가 없는 사람간의 조혈모세포 이식이 증 가하여 이식편대숙주질환 환자의 수가 급증하고 있으며, 스테로이드, 면역글로부 린, 탈리도마이드 (thalidomide), 사이클로스포린 (cyclosporin) 등의 약제를 사 용하고 있으나 효과는 만족스럽지 못한 실정이다. 특히 스테로이드 불응성 중증 급성 이식편대숙주질환 (Severe acute steroid-refractory GvHD)의 경우 사망 률이 90%에 이른다.
2. 중간엽줄기세포
중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)는 Friedenstein 등에 의 해 골수의 기질 (stroma)에서 최초로 분리되었고, 당시에는 섬유모세포의 전구세포
(precursors for fibroblasts)로 명명되었다 (Friedenstein et al., 1968; Friedenstein et al., 1987). 이후 많은 연구들에 의해 중간엽줄기세포가 연골세포 (Caplan, 1991; Owen, 1998), 근세포 (Wakitani et al., 1995), 지방세포 (Dennis and Caplan, 1996), 골모세포 (Chen et al., 1998) 등 다양한 중간엽조직의 성숙한 세포로 분화하는 능력 뿐 아니라 골수의 조혈과정 (hematopoiesis)을 물리적으로 지지하는 “hematopoietic stem cell niche”의 요소임이 밝혀졌다 (Dexter and Testa, 1976; Friedrich et al., 1996). 중간엽줄기세포의 이러한 성질은 Noort 등 (2002)의 in vivo 실험에서 증명이 되었는데, 이들은 NOD/SCID 마우스에 제대혈의 CD34 양성세포와 중간엽줄기세포를 동시 이식하여 6주 후 골수 내 생착이 3-4배 증가되었다고 보고하였다. Angelopoulou 등(2003)은 NOD/SCID 마우스 모델을 통 해 중간엽줄기세포의 동시이식이 골수 조혈을 촉진하고 혈소판의 생성을 촉진시킴 을 증명하였다. 조혈모세포이식에 있어서 중간엽줄기세포가 생착 향상에 기여하는 기전은 조혈모세포를 물리적으로 지지하고 다양한 성장인자를 분비하는 것으로 이 해되고 있지만, 그 외에 T 세포의 증식을 억제하여 면역을 억제시키는 효과를 발휘 함으로써 조혈모세포가 체내에서 거부되지 않도록 하는 기전도 중요한 요소로 여겨 진다. 중간엽줄기세포의 면역조절 기전에 관련된 인자로 hepatocyte growth factor (HGF), prostaglandin E2 (PGE2), transforming growth factor-β1 (TGF-β1), indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), nitric oxide (NO), interleukin-10 (IL-10) 등의 역할이 보고되었다 (Djouad 등, 2003; Tse 등, 2003; Aggarwal and Pittenger, 2005; Beyth 등., 2005; Sato 등, 2007). 그러나, 아직 연구자 간의 의견 이 모두 일치하지는 않으며 아직도 그 기전에 대해서는 추가 연구가 필요한 현실이 다. 최근에는 중간엽줄기세포의 다양한 능력을 이용하여 인간을 대상으로 한 임 상연구들이 활발히 진행 중이다. Horwitz 등 (2002)은 중증의 골형성부전증 (osteogenesis imperfecta) 환자 6명에게 동종 골수 유래의 중간엽줄기세포를 이 식하여 이들이 뼈에 생착되어 성장 속도를 향상시켰음을 발표하였다. 비슷한 시기에 Lee 등 (2002)은 급성골수성백혈병 환자의 HLA 반일치 (haploidentical) 가족 공
여자의 조혈모세포와 중간엽줄기세포를 동시 이식하여 이식편대숙주질환 발생 없이 조기 생착이 유도되었음을 보고하였다. 조혈모세포의 생착 향상 외에도 중간엽줄기 세포의 면역억제능력을 이용하여 스테로이드 불응성 중증 급성 이식편대숙주질환을 치료한 제 2상의 연구결과가 최근 유럽 골수이식그룹에 의해 발표되었다 (Le Blanc et al., 2008). 대부분 HLA가 불일치하는 비혈연 공여자의 골수로부터 얻은 중간엽 줄기세포가 이용되었으나 반수가 넘는 환자에서 완전 반응을 보였으며, 중간엽줄기 세포로 인한 부작용은 없었다는 고무적인 결과를 보여주었다. 이러한 결과는 중간엽 줄기세포가 면역원성 (immunogenicity)이 낮아 HLA가 다르더라도 체내에서 면역 반응을 유도하지 않는다는 것을 임상 수준에서 입증한 것이라고 할 수 있으며, HLA 의 장벽에 대한 부담 없이 세포치료제로서 중간엽줄기세포를 안전하게 사용할 수 있 음을 시사하는 중대한 의미를 갖는 결과라고 할 수 있겠다. 기존의 연구결과들을 검토해 보면 중간엽줄기세포를 임상에 널리 이용하 기 위한 안전성은 어느 정도 확보가 되어 있다. 그러나, 아직까지도 중간엽줄기 세포의 공여원으로서 골수 이외의 다른 조직에 대한 연구는 상대적으로 부족한 현실 이다. 골수는 중간엽줄기세포가 최초로 연구된 조직이고 비교적 간단한 방법을 통해 높은 효율로 중간엽줄기세포를 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 채취 과정에 상당히 침습적인 방법이 불가피하다는 근본적 한계가 있다. 또한, 공여자의 나이에 따라 중 간엽줄기세포 증식률의 감소와 바이러스의 오염과 같은 문제를 가지고 있을 수 있다 (Rubinstein 등, 1993). 최근에는 거의 모든 성체 조직에서 중간엽줄기세포가 존재한다는 것이 증명 되었으나(da Silva 등, 2006) 다른 세포와의 혼동을 막기 위해 2006년
International Society for Cellular Therapy (ISCT)에서 표준을 만들었다. 그 기준 은 아래와 같다.
첫째, 중간엽줄기세포는 적절한 조건하에서 부착하여 자라는 세포여야 한 다. 둘째, 뼈, 지방, 연골세포로 분화하는 능력을 가지고 있어야한다. 셋째, CD73, CD90, CD105의 세포표현형을 발현하여야 한다. 넷째, 조혈모세포 계통의 세포표현형인 c-kit, CD14, CD11b, CD34, CD45, CD19, CD79, HLA-DR 은 발현
하지 않아야한다.
현실적으로 중간엽줄기세포를 임상에 이용할 수 있는 골수 이외의 실질적인 공급원으로는 제대혈, 지방조직, 탯줄 등을 꼽을 수 있다. 제대혈 (Yang 등, 2004) 및 탯줄 (Troyer and Weiss, 2008)은 분만된 태반 조직으로부터 전혀 인체에 침습 적이지 않은 방법으로 획득이 가능하다는 것이 가장 큰 장점이다. 지방조직 유래 중 간엽줄기세포 역시 다양한 조직으로 분화가 가능하며 골수 유래의 중간엽줄기세포 와 마찬가지로 면역조절능력을 가진다(Puissant 등, 2005). 지방조직의 경우 치료 목적으로 지방흡입술을 시행한 후 버려지는 것을 추가적인 침습적 방법 없이 얻을 수 있으며, 치료 목적이 아닌 경우라 하더라도 골수 채취에 비해 상대적으로 덜 침습 적인 방법을 통해 얻을 수 있다. 중간엽줄기세포를 임상에 이용하기 위해서는 이를 충분히 확보하고 배양 시키는 것이 일차적으로 중요한데, 중간엽줄기세포는 그 특성상 표현형이나 기능 의 손실 없이 체외에서 증폭이 가능하므로 이러한 임상적 요구에 부응할 수 있 는 것이다. 다만, 제대혈이나 탯줄, 지방세포와 같이 골수 채취와 같은 상당히 침 습적 방법을 통하지 않고도 확보할 수 있는 조직으로부터 배양한 중간엽줄기세 포가 골수 유래의 중간엽줄기세포와 견줄만한 능력을 가짐을 증명할 수 있다면, 향후 골수 이외의 다른 조직을 이용한 임상 연구가 더욱 활발해질 것으로 기대 할 수 있겠다. 중간엽줄기세포의 주된 임상 적용 분야 중에서 조혈모세포이식 분야, 자 가면역질환의 치료 등의 영역에서는 주로 면역조절능력을 이용하는 바, 각기 다 른 기원 조직에서 유래한 중간엽줄기세포의 면역조절능력에 대한 다각도의 비교가 필요하다. Keyser 등 (2007)은 쥐로부터 얻은 근육조직, 지방조직, 장간막, 뼈 등으 로부터 중간엽줄기세포를 배양하여 면역조절능력을 비교하였고, 이들 모두 일정 수 준의 면역억제능력을 가지고 있음을 보고하였다. 그러나, 쥐의 면역시스템은 사람의 그것과 차이가 있다. 현재까지 서로 다른 인체조직 유래 중간엽줄기세포의 면역억제 능력을 비교한 연구로는 인간 골수와 지방조직 유래 중간엽줄기세포가 유사한 면역 억제능력을 가지고 있다는 보고가 있다 (Puissant 등, 2005).
3. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)
IDO는 tryptophan을 kynurenine과 그 대사물로 분해하는 과정 중에서 첫 번째로 작용하는 효소이다. Fig. 1은 생체 내에서 tryptophan이 대사되는 과정을 나 타내고 있다. 이 효소는 1970년대에 보고되었으나 (Shimizu, 1978), 1998년 Munn 등에 의해서 발생단계에서 IDO가 급격하게 증가하는 것을 관찰하면서 면역조절능 력에 대한 보고가 이루어졌다. 그 이후 많은 in vitro, in vivo 연구에서 IDO가 림프 구의 반응을 조절하는 중요한 역할을 한다는 것이 증명되었는데, IDO가 T 세포 증 식에 필수 아미노산인 tryptophan을 kynurenine으로 바꿈으로써 T 세포 증식을 막 는 것으로 알려져 있다. 이러한 IDO는 많은 조직과 세포에서 분비되는 것으로 알려 져 있는데 주로 인터페론 (Interferon) (Koide 등, 1994), lipopolysaccharide (Jung 등, 2007), costimulatory molecules의 ligation (Munn 등, 2004)에 의해 유 도된다. 특히 수지상세포 (Dendritic cells; DCs)는 상기의 자극에 의해 IDO를 분비 하는 regulatory DCs로 분화되고, 이 세포는 regulatory T 세포를 유도하여 면역 관용을 일으키게 된다. 암세포에서도 IDO가 발현하는 것은 치료효과가 나쁜 것으로 밝혀지고 있다. 난소암 (ovarian cancer) (Okamoto 등, 2005), 자궁내막암 (endometrial cancer) (Ino 등, 2006), 대장암 (colon cancer) (Brandacher 등, 2006)에서 IDO가 발현하는 경우에는 나쁜 예후를 보였다. 이러한 암세포는 암세포 자체가 IDO를 발현하여 주변의 activated tumor-reactive T 세포의 증식을 막아 effect T 세포의 수를 감소시키기도 하고, Tumor-draining lymph node에서 IDO-expressing plasmacytoid DCs 를 유도하여 naive T 세포를 regulatory T 세 포로 유도하여 면역회피를 하는 것으로 알려져 있다 (Cook 등, 2008). 최근 Jasperson (2008)은 마우스 조혈모세포이식 모델에서 IDO가 이식편대숙주질환을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 보고하였는데, IDO-/- KO 마우스 모델이 대조군 에 비해 대장쪽에서의 이식편대숙주질환이 증가하였고, 생존률은 줄어들었다. 중간 엽줄기세포에서도 IFN-γ 처리 후에 IDO의 발현이 증가하는 것을 보고하였고 (Meisel, 2004), 동종 조혈모세포이식시 면역관용을 획득하기 위해 중간엽줄기세포 를 같이 이식하는 임상실험결과가 보고되고 있다(Le Blanc et al., 2008).
Fig. 1. The kynurenine pathway of tryptophan degradation in mammalian cells.
4. 줄기세포치료제
“세포치료제”란 세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 또는 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 생물학적 특성을 변화시키는 등으로 만든 의약품을 말한다. 세포 자 체를 약으로 활용하는 세포치료제는 환자에게서 분리한 세포를 원하는 특정 성 질을 갖도록 조작 및 배양하여 그 환자에게 다시 주입하는 경우가 많아, 불특정 다수를 대상으로 대량 생산되는 일반 의약품과 대비하여 “맞춤형 의약품”이라고 불리운다. 세포치료제는 사용되는 세포의 출처에 따라 크게 줄기세포 치료제와 체 세포 치료제로 나눌 수 있고 줄기세포 치료제는 다시 배아줄기세포치료제과 성 체줄기세포치료제, 역분화 줄기세포 치료제로 나눌 수 있다. 배아줄기세포치료제 는 인공수정 후 남은 잉여 배아 등에서 만들어 질 수 있으며, 모든 종류의 세포 로 분화될 수 있는 장점이 있으나, 암 발생의 가능성과 배아의 사용과 관련된 윤 리적 문제가 있는 반면, 제대혈, 골수, 지방 조직 등에서 얻을 수 있는 성체줄기 세포치료제는 안정성 및 반복성이 우수하고 윤리적인 문제가 없어 현재 연구의 주류를 이루고 있다. 역분화 줄기세포는 역분화 인자를 이용해 성체세포를 가지 고 만든 줄기세포를 말한다. 역분화 줄기세포는 분화된 성체세포를 가지고 제작 하므로 법적, 윤리적 문제가 전혀 없고, 자가 재생산 능력이 뛰어나 다량의 세포 를 공급할 수 있다는 장점이 있다. 또한 배아줄기세포와 유사하게 분화능력이 뛰 어날 것으로 기대되어 세포치료에 활용될 가능성이 높고, 자신에게서 추출한 세 포이므로 면역거부에 대한 문제가 전혀 없다. 하지만 현재까지 확립된 역분화 유 도 방법은 레트로바이러스나 렌티바이러스를 사용하므로 환자에 직접 적용하기 위해서는 바이러스를 사용하지 않는 새로운 역분화 방법을 개발해야 하고, 배아 줄기세포와 같은 분화 능력을 가질 것으로 예상되지만, 이에 대한 과학적인 검증 이 이루어져야 한다. 세계적으로 줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발에 박차를 가하고 있으 나, 아직 상품화된 것은 없다. 각국의 연구 진행상황을 간단히 살펴보면, 미국의
오바마 대통령의 배아 줄기세포의 규제 완화 방침이 발표된 상황에서 미국은 이 미 배아 줄기세포 분야에서 주도적 입장을 확보하고 있으며, 역분화 만능 줄기세 포 연구에 관해서도 미국과 일본은 선두를 달리고 있다. 2009년 1월 미국식품의 약국 (FDA) 은 벤처기업인 Geron사에 인간 배아 줄기세포 (human Embryonic Stem Cell, hESC)를 하반신마비 (Paraplegia) 환자 8 ~ 10명에 적용하는 세계 최초의 인간 배아 줄기세포 임상 시험을 승인하는가 하면, 글로벌 제약기업인 박 스터 (Baxter International)는 만성 (Chronic) 심장병 환자에게 자신의 성체 줄 기세포를 주사해 심장병을 치료하는 임상 시험 2단계를 진행 중에 있다. Osiris Therapeutics는 동종 골수유래 중간엽줄기세포를 이용하여 면역관련 질환과 조 직재생 관련 질환에 대해 임상을 진행중에 있다. 하지만 2009년 9월 스테로이드 불응성 중증 급성 이식편대숙주질환에 대해 임상 3상을 한 결과 위약 (placebo)과 비교했을 때, 전체적으로 별 차이를 보이지 않는다고 발표하였다. 영국의 줄기세포 연구 기업인 리뉴런 그룹 (ReNeuron Group)은 뇌졸중 (Stroke)환자에게 신경 재생이 가능한 배아 줄기세포를 뇌에 직접 투여하는 임 상 시험 1단계를 2009년 6월부터 시행 중에 있으며, Fairfield 병원은 2007년 4 월에 배아 줄기세포로 심장 일부를 배양하는데 성공한 이후 현재 동물실험을 거 쳐 임상시험을 계획 중이다. 일본은 2006년 Kyoto 대학에서 역분화 만능 줄기세포를 처음 만들어 낸 뒤, 2007년 말 인간 역분화 만능 줄기세포를 미국 Wisconsin 대학의 James Thomson 그룹과 거의 동시에 세계 처음으로 개발하는 등 줄기세포 연구에 박 차를 가하고 있으며, 세계 선도 그룹에 있는 역분화 만능 줄기세포의 장점을 최 대한 살리기 위해 대대적인 정부 예산이 투입되고 있다. 국내의 경우 배아줄기세포나 역분화 줄기세포보다는 성체줄기세포 연구에 치중해 왔으며, 현재 국내 줄기세포 치료제 임상현황을 살펴보면 12건의 임상시 험이 진행 중에 있으며, 12건 모두 성체줄기세포인 중간엽줄기세포를 이용한 것 이다 (Table 1). 자가세포를 이용한 경우가 9건, 동종세포를 이용한 경우가 3건 이고, 세포원을 기준으로 살펴보면 지방조직 유래 중간엽줄기세포가 6건, 골수
유래 중간엽줄기세포가 4건, 제대혈 유래 중간엽줄기세포가 2건으로 나타났다.
B. 연구목적
본 연구에서는 기존의 면역억제 요법으로 한계가 있는 질환들에 대해 치 료 목적으로 가장 적절한 중간엽줄기세포를 활용할 수 있도록 하는 것에 궁극적 목적을 두고, 임상적 이용이 가능한 다양한 인체 조직에서 유래된 중간엽줄기세 포의 특성 및 면역조절능력을 비교 평가하여 향후 다양한 면역질환의 치료에 있 어서의 임상적 유용성을 가늠할 수 있는 기초 자료를 확보하고자 하였다.Table 1. Clinical trials of stem cell therapy product in Korea(April, 2010).
No. Product (Company) Cells Target Disease Phase
1 Cerecellgram stoke
(FCB Pharmicell) Autologous BM-MSC Acute stoke 3
2 Heartcellgram AMI
(FCB Pharmicell) Autologous BM-MSC Acute Myocardial infarction 2/3 3 Cerecellgram spine(FCB Pharmicell) Autologous BM-MSC Spinal cord injury 2/3
4 Vascostem
(RNLBio) Autologous AT-MSC Buerger's Disease 1/2
5 Promostem
(Medipoost) Allogenic CB-MSC
Hematopoietic stem cell
transplantation 1/2
6 (RNLBio)Jointstem Autologous AT-MSC Cartilage defects 1/2
7 Cartistem
(Medipost) Allogenic CB-MSC Cartilage defects 3
8 GvHD medicine
(Homeotherapy) Allogenc BM-MSC Graft versus host disease 1/2a
9 (Anterogen)AdipoPlus Autologous AT-MSC Anal fistula 1
10 ANT-SM
(Anterogen) Autologous AT-MSC Fecal Incontinence 1
11 AstroStem
(RNLBio) Autologous AT-MSC Spinal cord injury 1
Ⅱ. 재료 및 방법
A. 검체
공여자 또는 보호자로부터 아주대학교병원 IRB (institutional review
board)에서 승인한 동의서를 받은 후 각 조직을 채취 확보하였다.
(AJIRB-GN3-07-208)
B. 중간엽줄기세포의 분리 및 배양
적출된 각 조직을 확보한 후 아래 기술된 방법에 따라 중간엽줄기세포를 분리한 후, 계대배양을 거쳐 충분한 세포수를 확보하고, 일부 세포를 바로 실험에 이 용하고 나머지는 10% DMSO (dimethylsulfoxide) (Sigma, St. Louis, MO, USA) 가 첨가된 fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen-Gibco, Rockville, MD, USA)을 냉동보존액으로 넣어 -196℃의 액체질소에 보관하고 필요 시 해동하여 사용하였 다.
1. 골수 유래 중간엽줄기세포의 분리/배양
채취한 골수를 PBS (phosphate buffered saline) (HyClone, Logan, UT, USA)와 혼합하여 희석한 후, 희석된 골수를 피콜-하이팩 용액 (Ficoll-Hypaque, 밀도 1.077 g/mL) (Sigma)에 중첩시켰다. 이때, 피콜-하이팩 용액은 사용 전에 실 온이 되도록 하였고, 희석된 골수의 부피가 피콜-하이팩 용액 부피의 3배가 넘지 않 도록 하였다. 이를 2,000 rpm의 속도로 상온에서 30분간 원심분리하여 적혈구층과, 단핵구층 및 혈청층을 분리하였다. 파스퇴르 피펫 (pasteur pipette) 등을 이용하여 단핵구층만을 새로운 튜브로 옮기고 PBS 등으로 세척하여 단핵구층 채취 시 혼입된 피콜-하이팩 용액이나 오염된 혈소판을 제거하였다. 분리된 골수 유래 단핵구로부 터 중간엽줄기세포를 분리 및 배양하기 위해, 단핵구를 10% FBS, 100 units/mL 페 니실린 (penicillin) (Invitrogen-Gibco), 100 μM/mL 스테렙토마이신
(streptomycin) (Invitrogen-Gibco)가 포함된 low glucose DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Invitrogen-Gibco) 세포배양 배지에 1 ~ 2 x105 세포
/cm2 농도로 접종하였다. 2-3일 후 비부착세포를 제거하고 2-3주간 단층 배양하여 중간엽줄기세포를 분리 배양하였다.
2. 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 분리/배양
지방조직을 PBS로 세척 후 0.075% collagenase A (Roche, Penzberg,
Germany)를 포함한 PBS 용액을 첨가하여 37℃, CO2 incubator에서 60분간 지방
조직이 분해되도록 하였다. Incubation 후 동량의 low glucose DMEM을 첨가하여 10분 동안 2,000 rpm으로 원심분리 하여 뜨는 지방층을 제거하고 유핵세포를 수집 한 후 PBS 용액을 이용하여 세척하고, 100 μm 나일론 그물망에 여과시켜 추출하였 다. 분리된 유핵세포는 low glucose DMEM 배지를 넣고 24시간 동안 배양한 후 뜨 는 세포들을 제거하기 위해서 배지를 갈아주고 이후 3-4일에 한 번씩 배지를 갈아 주면서 붙어 자라는 세포가 70-80% 포화상태가 될 때까지 배양하였다. 3. 제대혈 유래 중간엽줄기세포의 분리/배양 채취한 제대혈을 PBS와 혼합하여 희석한 후, 희석된 제대혈을 피콜-하 이팩 용액에 중첩시켰다. 이때, 피콜-하이팩 용액은 사용 전에 실온이 되도록 하 였고, 희석된 제대혈의 부피가 피콜-하이팩 용액 부피의 3배가 넘지 않도록 하였다. 이를 2,000 rpm의 속도로 상온에서 30분간 원심분리하여 적혈구층과, 단핵구층 및 혈청층을 분리하였다. 파스퇴르 피펫 등을 이용하여 단핵구층만을 새로운 튜브로 옮 기고 PBS 등으로 세척하여 단핵구층 채취 시 혼입된 피콜-하이팩 용액이나 오염된 혈소판을 제거하였다. 분리된 제대혈 유래 단핵구로부터 중간엽줄기세포를 분리 및 배양하기 위해, 단핵구를 low glucose DMEM 배지에 적당한 농도로 접종하였다. 일주일 후 비부착세포를 제거하고 2-4주간 단층 배양하여 중간엽줄기세포를 분리 배양하였다.
4. 탯줄의 Wharton's jelly 유래 중간엽줄기세포의 분리/배양
로 잘라서 100 mm dish (Nalge Nunc, Naperville, IL, USA)에 올려놓고 조직이 dish에 부착되도록 incubator에 30분간 방치한 후 low glucose DMEM 배지를 첨 가하여 1주일간 배양하였다. 배양 후 세포가 Wharton's jelly 조직으로부터 dish로 자라나오면 남아있는 조직은 제거하고 세포가 70% 포화상태가 될 때까지 계속 배 양하였다. 이후 0.05% trypsin-EDTA (Invitrogen-Gibco)로 세포를 떼어낸 후 1x103 세포/cm2의 농도로 계대배양 하였다.
C. 중배엽성 조직으로 분화
1. 골모세포 (osteoblast) 분화 세포에 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 배양용기로부터 분리하여 배지 내에 부유시킨 후 6-well 배양용기에 2×104 세포/well의 농도로 접종하고 1주일 후, 10% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 μM/mL 스테렙토마이신 등이 포함된 high glucose-DMEM에 0.1 μM 덱사메타손 (dexamethason) (Invitrogen-Gibco), 100 μM 2-인산 아스코르브산 (ascorbate-2-phosphate) (Sigma)및 10 mM 베타 -글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate) (Sigma)를 처리한 골모세포 분화 유도배지를 각 well에 첨가하여 2주간 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 분
화 유도배지는 3-4일에 한번 씩 새로운 것으로 갈아주었다. 골모세포로의 분화를 확인하기 위하여 골모세포를 특이적으로 염색하는 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase, ALP) 염색시약을 사용하여 관찰하였다.
2. 지방세포 (adipocyte) 분화
6-well 배양용기에 2×104 세포/well의 농도로 접종하고 7일정도 후 과증식
(over-confluent)이 되었을 때, high glucose-DMEM에 10% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스테렙토마이신, 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 메틸이소부틸잔
틴 (methy-isobuthylxanthine) (Sigma), 10 μg/mL 인슐린 (insulin)
(Invitrogen-Gibco), 100 μM 인도메타신 (indomethacin) (Sigma) 등이 포함된 배 지에서 3일간 배양하여 지방세포로의 분화를 유도시킨 후, 유지배지 (high
glucose-DMEM, 10% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스테렙토마이신, 10 μg/mL 인슐린)를 사용하여 1일간 더 배양하여 유지하였다. 위 과정을 3회반복 한 후 마지막 과정에서 유지 배지로 7일간 더 배양한 후, 지방조직의 지방소포 (lipid vacuole)의 발현 양상을 확인하기 위해 oil-red O 조직화학염색을 시행하여 관찰하 였다. 3. 연골세포 (chondrocyte) 분화 세포를 분리한 후 2×105 의 세포를 15 mL 튜브에 10% FBS가 포함된 high glucose-DMEM 배지와 혼합하여 1,000 rpm으로 5분간 원심분리 후 배지를 버리고 연골세포 분화를 위한 배지 (high glucose-DMEM, 0.1 μM 덱사메타손, 39.7 μg/mL 2-인산 아스코르브산, 10 ng/mL TGF-β1, 100 nM 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate) (Invitrogen-Gibco), 10 μg/mL 인슐린, 5.5 μg/mL 트랜스페린 (transferrin) (Invitrogen-Gibco), 6.7 μg/mL 소듐 셀레나이트 (sodium selenite) (Invitrogen-Gibco) 500 μL를 넣어 펠렛 배양 (pellet culture)을 하여 분화를 유도 하였다. 3일에 한 번씩 배양액을 교체하여 2-3주간 배양한 후, 연골조직의 세포외 기질 (extracellular matrix)의 발현 양상을 확인하기 위해 조직화학염색을 시행하 여 관찰하였다. 펠렛배양을 통해 연골분화유도 시킨 연골조직을 에탄올로 고정한 후 파라핀에 포매시키어 3-5 μm 두께로 펠렛 조직을 슬라이드에 고정시킨 후 톨루이 딘 블루 (toluidine blue)로 조직화학염색을 시행하고 그 결과를 관찰하였다.
D. 유세포분석
세포를 5x105 세포/200 μL의 농도로 PBS에 부유시킨 후 각 항체를 10 μ L씩 첨가하고 15분간 암실에서 반응시켰다. 그 후 유세포분석용 PBS (Beckman Coulter, USA)로 세포를 2회 세척하고, 동일한 PBS를 500 μL 첨가한 후 유세포분 석기 (FC 500; Beckman Coulter, USA)로 측정하였다. 데이터 분석은 CXP 소프트 웨어 (Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.E. Multiple cytokine assay
배양된 세포의 상층액을 모아 세포로부터 분비된 싸이토카인 (cytokine), 케 모카인 (chemokine), 성장인자 (growth factor) 등을 Luminex 2000 system (Luminex, Austin, TX, USA)을 이용하여 정량하였다. 1 x bead suspension과 세 포 배양액을 빛이 없는 상온에서 2시간 동안 섞어준 뒤 vacuum filtration으로 배양 액을 제거하고, 50 μL 의 assay buffer로 2회 세척하고, 1 x Beadlyte Biotinylated Reporter를 넣고 같은 방법으로 1시간 incubation 후 reporter를 제거하였다. Beadlyte Streptavidin-Phycoerythrin (Strep-PE)을 넣고 15분 뒤에 buffer를 첨 가하고, 다시 15분간 두었다가 vacuum filtration으로 두 buffer를 모두 제거하였 다. 100 μL의 Beadlyte Assay Buffer를 넣고 잘 섞어준 뒤 Luminex 200 system 을 이용하여 결과를 측정하고, MasterPlex CT와 MasterPlex QT (MiraiBio, Alameda, CA, USA) 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
F. 혼합림프구반응 또는 PHA 유도 T 세포 증식반응
96-well 배양용기에 중간엽줄기세포 6.25×103 세포/well의 농도로 접종하
고, 다음날 10 ㎍/mL mitomycin C (Sigma)를 2시간동안 처리한 후 PBS로 3회 세
척하였다. 말초혈액단핵구 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는
HLA-type이 다른 정상인 2명으로부터 혈액을 채취하여 분리하였다. 중간엽줄기세 포가 배양된 96-well plate에 (1) 각 조직 유래 중간엽줄기세포를 PBMC와 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16 등으로 다른 농도가 되게 넣고, HLA-type 다른 사람의 PBMC를 넣은 것 (mixed lymphocyte reaction, MLR)과, (2) 같은 방법에 다른 PBMC 대신 1 μ
g/mL PHA (phytohemagglutinin) (Invitrogen-Gibco)를 처리한 것
(PHA-induced T-cell proliferation)을 각각 3-5일간 37°C에서 배양시켰다. 중간 엽줄기세포를 섞지 않은 경우의 PBMC 증식을 대조군으로 하여 중간엽줄기세포를
다른 농도로 섞어주었을 때 PBMC 증식이 억제되는 정도를 BrdU
(5-bromo-2'-deoxyuridine) assay로 분석하였다. BrdU assay 실험은 Cell proliferation ELISA (Roche)을 이용하여 측정하였다. 20 μL의 BrdU를 넣은 후 18
시간 더 배양시킨 다음, 고정액을 넣어 60분간 상온에서 기다린 후 plate에 100 μL 의 anti-BrdU 용액을 넣고 실온에서 120분간 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척한 후 발색 기질을 넣어 반응 시켰다. ELISA 측정기 (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 370 nm의 파장에서 세포의 증식 정도를 측정하였다. 측정값은 대조군 을 기준으로 상대값으로 표현하였다.
G. Transwell assay
PHA-induced T cell proliferation 실험 시 중간엽줄기세포를 접종하여 바 닥에 부착시킨 후 PBMC를 함께 배양할 때, transwell chamber (Corning, NY, USA)를 설치하고 그 안에 PBMC를 접종하여 중간엽줄기세포와 PBMC와의 직접적 접촉이 없는 상황 하에서 배양하였다. 중간엽줄기세포 : PBMC의 비율은 1 : 16으 로 하여 위와 같은 방법 BrdU assay법으로 측정하였다.
H. RT-PCR
준비된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후, 5ⅹ106 cells 당 1 mL의
TRIZOL reagent (Invitrogen-Gibco)를 첨가하였다. Cell scraper로 세포를 모아 튜브에 옮겨 상온에 5분간 두었다가 chloroform 200 μL를 넣고 5분 뒤 12,000 g로 5분간 원심분리 하여 RNA가 포함된 최상층만을 새로운 tube에 옮겼다. 각 tube 당 500 μL의 isopropanol을 첨가하고 10분 뒤 12,000 g에서 5분간 원심분리 하여 RNA pellet 을 얻고, 20 μL의 RNase free H2O를 넣고 녹여 spectrophotometer에 서 RNA 양을 확인하였다. 준비된 RNA를 주형으로 OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 50℃에서 30분간 역전사 반응을 수행하고, PCR을 25-40회 반복하여 얻은 PCR 결과물은 0.5 μg/mL 농도의 ethidium bromide 가 포 함된 1% agarose gel에 전기영동 하여 Gel documentation system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 UV 상에서 확인하였다. 중간엽줄기세포의 면역억 제기전과 관련된 각 특정 유전자의 발현을 확인하기 위하여 Table 2에 열거된 primer를 사용하였다.
I. Western blotting
준비된 세포를 PBS로 세척한 후, 300μL의 Protease inhibitor cocktail (Sigma)을 포함한 RIPA buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% Triton X-100,
150mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% sodium
deoxycholate)를 넣어 scraper를 이용하여 세포를 용해하였다. 용해된 세포를 13,000g 로 10분간 4℃에서 원심분리 한 후 상등액을 모아 단백질 함량을 BCA
protein assay kit (Pierce, USA)로 측정하였다. Sample buffer (60mM
Tris-HCl, pH 6.8, 14.4mM β-mercaptoethanol, 25% glycerol, 2% SDS,
0.1% bromophenol blue)에 단백질 30㎍을 넣고, 5분간 끓인 후, 10%
SDS-PAGE gel을 이용하여 단백질을 분리하였다. Trans-blot 시스템
(Invitrogen)을 이용하여 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) memebrane (Amersham Biosciences, UK)으로 옮겼다. Blot을 1시간동안 실온 에서 5% non-fat dry milk (Becton Dickinson)가 포함된 Tris-buffered saline (TBS) (10mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl)을 이용하여 block한 후, TBS 로 3회 세척하였다. 그리고 3% non-fat dry milk가 포함된 TBST (10mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.02% Tween 20)에 일차항체를 1:1000으 로 희석한 후 4℃에서 15시간 정도 반응시킨 후, TBST로 3회 세척하고, 3% non-fat dry milk가 포함된 TBST에 horseradish peroxidase-conjugated 이차 항체를 1 : 2000으로 희석한 후 실온에서 1시간 반응하였다. TBST로 3회 세척 한 후 ECL detection system (Amersham Biosciences)을 이용하여 항체반응
을 확인하였다. 일차항체는 IDO, β-actin (Santacruse, USA), pJAK1/2,
pTyk2, pSTAT1, STAT1, pSTAT3, STAT3, pSTAT5, STAT5, IRF-1 (Cell Signaling, USA)을 사용하였다.
Table 2. Sequences of primers employed for RT-PCR studies.
Target Primer sequencea Product size (bp)
HGF F 5'-ATGCATCCAAGGTCAAGGAG-3' 349 R 5'-TTCCATGTTCTTTTGTCCCACA-3' IDO F 5'-CGCTGTTGGAAATAGCTTC-3' 234 R 5'-CAGGACGTCAAAGCACTGAA-3' IL-10 F 5'-ATCCAAGACAACACTACTAA-3' 588 R 5'-TAAATATCCTCAAAGTTCC-3' TGF-β1 F 5'-CAGATCCTGTCCAAGCTG-3' 270 R 5'-TCGGAGCTCTGATGTGTT-3' COX-1 F 5'-GAGTTTGTCAATGCCACCT-3' 215 R 5'-CAACTGCTTCTTCCCTTTG-3' COX-2 F 5'-TCCTTGCTGTTCCCACCCATG-3' 847 R 5'-CATCATCAGACCAGGCACCAG-3' GAPDH F 5'-ATCACCATCTTCCA-GGAGCG-3' 573 R 5'-GTTCTTCCACCACTTCGTCC-3' a
Forward (F) and reverse (R) primers were used to detect mRNA expression for the targets.
HGF, hepatocyte growth factor; IDO, indoleamine 2,3-dioxygenase; IL-10,
interleukin-10; TGF-β1, transforming growth factor-β1 COX-1, 2,
Ⅲ. 결 과
A. 중간엽줄기세포의 분리 배양 및 그 특성
골수와 제대혈은 피콜을 이용하여 단핵세포를 얻은 후 부착세포를 분리하 여 중간엽줄기세포를 얻었고, 지방조직은 주사기를 이용하여 뽑아낸 연조직 (soft tissue)으로 collagenase를 이용하여 단핵세포를 얻은 후 부착세포를 분리 하여 중간엽줄기세포를 얻었다. 탯줄은 완전한 모습을 갖춘 견조직으로 동맥과 정맥 혈관을 제거한 후 Wharton's jelly 만을 분리한 후 outgrowth 방법을 이용 하여 중간엽줄기세포를 얻었다. Wharton's jelly의 경우 collagenase를 이용하여 분리 할 경우 세포의 수가 너무 적어 증식에 어려움이 있었다. 분리된 중간엽줄 기세포는 배양용기에 부착하여 증식 가능한 세포로 방추형 (spindle shape)으로 자라는 전형적인 중간엽줄기세포의 형태를 보였다. 중간엽줄기세포의 특성인 중 배엽성 조직으로의 분화능을 확인 한 결과, 제대혈 유래 중간엽줄기세포가 지방 세포로의 분화 효율이 저조하였고, 지방조직 유래의 중간엽줄기세포가 연골로의 분화 효율이 저조하긴 하였으나 네 가지 중간엽줄기세포 모두 골, 연골, 지방세 포로 분화 가능하였다 (Fig. 2). 네 가지 중간엽줄기세포의 세포표현형을 확인한 결과, CD14, CD34, CD45와 같은 조혈계통의 세포표면항원은 음성을 보였으며, CD73 (SH3, SH4), CD90 (Thy-1), CD105 (SH2)와 같은 중간엽줄기세포의 특 성을 나타내는 세포표면항원은 양성을 나타내었다(Fig. 3). 네 가지 중간엽줄기세포에서 어떤 사이토카인, 케모카인, 성장인자 등이 분비되는지를 확인하기 위하여 자극을 주지 않은 상태로 72시간 세포 배양한 후 상층액 (low glucose DMEM / 10%FBS)을 취하여 multiple cytokine assay 방 법으로 정량적으로 평가를 시행하였다. 각 조직에서 분리된 중간엽줄기세포간의 차이를 확인하기 위해 조직별로 3가지씩 사용하여 실험하였다. 그 결과 네 가지 조직 유래 중간엽줄기세포는 조사된 32가지 종류의 분비인자 중 대부분 유사한 분비 양상을 나타내었다. IL-6, CCL2 (MCP-1), CXCL8 (IL-8)는 분비가 많았 고, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, GM-CSF, TNF-α, TNF-β, IFN-γ, IFN-α2의 사이토카인 분비는 거의
없었고, CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL11 (Eotaxin), CXCL10 (IP-10)의 chmokine의 분비도 거의 없었다. 또한 FGF, PDGF-BB, EGF, Flt-3 의 성장인자의 분비도 거의 없었다. 하지만 IL-12(p40), IL-15, PDGF-AA가 제
대혈과 Wharton's jelly 유래 중간엽줄기세포에서 분비가 많았고, CCL5
(RANTES)는 Wharton's jelly 유래 중간엽줄기세포에서만 분비가 되었다. VEGF는 골수, 지방조직, 제대혈 유래 중간엽줄기세포에서는 분비가 되었으나, Wharton's jelly 유래 중간엽줄기세포에서는 분비가 되지 않았다(Table 3).
Fig. 2. Differentiation potential of MSCs to connective tissue cells. Four types of MSCs differentiated into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes under
appropriate conditions. Osteogenic, adipogenic and chondrogenic
differentiation was evaluated by alkaline phosphatase staining, oil-red O staining and toluidine blue staining, respectively.
Fig. 3. Immunophenotypes of MSCs. Cells were labeled with FITC- and PE-conjugated antibodies and examined by flow cytometry. Histograms demonstrating the expression of surface molecules were plotted against control (anti-IgG). MSCs from different tissues were proven to have similar immunophenotypes. CD14, monocyte; CD45, leukocyte common antigen; CD73, SH-3 and SH-4; CD90, Thy-1; CD105, endoglin (SH-2).
Table 3. Secretory factor levels of MSCs. BM-MSC AT-MSC CB-MSC WJ-MSC (pg/ml) 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 IL-1a - - - -IL-1b - - - -IL-2 + + + + + + + + + + + + IL-3 - - - -IL-4 - - - -IL-5 - - - -IL-6 ++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ IL-7 - - - -IL-9 - - - -IL-10 - - - -IL-12(p40) - - - + ― + + + ++ IL-12(p70) - - - -IL-13 - - - -IL-15 - - - + + + + + + TNF-α - - - + + - - - + TNF-β - - - -IFN-γ - - - + IFN-α2 - - - -GM-CSF - - - + CCL2 ++ + ++ + ++ + ++ +++ +++ +++ ++ ++ CCL3 - - - -CCL4 - + + - - - + + + - + + CCL5 - - - ++ + ++ CCL11 - - - -CXCL8 + + + + + + + + + +++ ++ +++ CXCL10 - - - + + -FGF - - + + - - + + - - + -PDGF-AA - - - ++ + + + + + PDGF-BB - - - -EGF - - - -Flt-3 - - - -VEGF ++ ++ +++ ++ + + ++ ++ ++ - - --, value < 50 pg/mL; +50 pg/mL ≤ value < 500 pg/mL; ++, 500 pg/mL ≤ value < 5,000 pg/mL; +++, value ≥ 5,000 pg/mL.
B. 중간엽줄기세포의 면역세포증식 억제
조혈모세포 이식시 HLA가 일치하지 않으면 면역세포가 서로를 공격하여 면역반응이 강하게 일어나게 된다. In vitro에서 이러한 실험을 확인할 수 있는 데, HLA가 다른 단핵세포를 섞어주면 증식이 일어나는 백혈구혼합반응 (Mixed leukocyte reaction; MLR)이 있고, 단핵세포의 증식을 유도하는 PHA를 처리하 여 면역세포를 증식시키는 방법이 있다. 중간엽줄기세포의 면역억제능력을 확인 하기 위해 상기 두 가지 방법을 모두 사용하였다. 먼저 MLR에서는 6.25×103 세포의 중간엽줄기세포를 배양한 후 세포증식을 억제하기 위해 mitomycin C를 처리하고 HLA가 서로 다른 단핵세포를 중간엽줄기세포 : 단핵세포 비율이 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16이 되도록 하여 3일간 배양한 후 BrdU를 이용하여 증식된 세 포의 수를 측정하였다. 각 조직에서 분리된 중간엽줄기세포간의 차이를 확인하기 위해 조직별로 3가지씩 사용하여 실험하였으며, 모든 실험 결과는 3회 이상 반 복실험하였다. PHA를 이용한 실험에서도 동일한 방법을 이용하여 실험하였다. 실험 결과는 중간엽줄기세포 없이 단핵구만을 이용한 실험을 기준으로 상대적인 수치를 이용하였다. MLR에서 모든 중간엽줄기세포가 면역세포 증식을 억제하였 고, 특히 중간엽줄기세포가 많을수록 면역세포의 증식이 줄어드는 양상을 보였 다. 조직간에는 중간엽줄기세포와 단핵세포의 비율이 1 : 16 일 경우 제대혈 유 래 중간엽줄기세포의 면역억제능력이 상대적으로 떨어지는 것 같았고, 이후 모든 실험은 1 : 8을 기준으로 실험을 진행하였다. 또한 PHA를 이용한 실험에서도 MLR과 같은 결과를 얻을 수 있었으며, 이후 모든 실험은 PHA를 이용한 실험으 로 진행하였으며, 각 조직의 첫 번째 것을 이용하였다 (Fig. 4). 중간엽줄기세포와 면역세포간의 물리적 격리가 세포증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 transwell chamber system을 사용하였다. Well plate에 중간엽줄 기세포를 배양하고 insert에 면역세포를 넣어 세포를 분리한 후 PHA 자극을 주 어 면역세포의 증식능력을 비교하였다. 그 결과 네 가지 중간엽줄기세포 모두 물 리적 격리를 시행하지 않은 경우에 비해 증식 억제 정도가 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 중간엽줄기세포와 면역세포의 직접 혼합 배양한 경우에 비
해서는 억제 정도가 줄어드는 것을 확인하였다 (Fig. 5). 면역반응에서는 자가세포가 아닌 경우 동종면역반응 (alloreactivity)이 일 어나게 된다. 중간엽줄기세포가 이러한 동종면역반응이 일어나는지 확인하기 위 해 중간엽줄기세포와 HLA가 다른 면역세포와의 혼합배양을 하였다. 그 결과 네 가지 중간엽줄기세포 모두 면역세포의 증식반응이 일어나지 않았다(Fig. 6). PHA를 이용하여 면역세포를 자극할 경우 증식하는 세포의 형태를 알아보 기 위해 flow cytometry를 이용하여 세포 표현형을 확인하였다. PHA를 자극하 였을 경우 CD3+CD4+ T 세포와 CD3+CD8+ T 세포의 수가 증가하는 것을 관찰 할 수 있었고, 중간엽줄기세포와 배양했을 경우에는 PHA 자극이 없는 경우와 유사한 분포를 보여 T세포 증식이 억제되었음을 확인하였다(Fig. 7).
PHA를 이용하여 면역세포를 자극할 때 네 가지 중간엽줄기세포와의 혼합 배양시 사이토카인, 케모카인, 성장인자 분비의 변화 양상을 확인하기 위해 72시 간 세포 배양한 후 상층액 (High glucose DMEM / 10%FBS)을 취하여 multiple cytokine assay 방법으로 정량적 평가를 시행하였다 (Table. 4). 실험 은 네 가지 중간엽줄기세포에 대해 각각 중간엽줄기세포만 배양한 경우, 중간엽 줄기세포와 단핵구세포를 배양한 경우, 중간엽줄기세포와 단핵구세포 배양시 PHA로 자극한 경우와 대조군으로 중간엽줄기세포 없이 단핵구만 배양한 것과, PHA로 자극한 단핵구 배양 상층액을 사용하였다. 그 결과를 살펴보면, 먼저 Table 3.에서 나타난 차이 외에는 중간엽줄기세포간의 차이는 없었다. PHA를 자극한 경우에는 중간엽줄기세포와 상관없이 IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-13, GM-CSF, FGF, PDGF-AA, PDGF-BB가 증가하였다. 또한 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL8, CXCL10과 같은 케모카인은 PHA 자극 없이도 발현되고, PHA로 자극할 경우에는 증가하는 것을 알 수 있었고, 중간엽 줄기세포와 혼합배양과는 상관없는 양상을 나타내었다. 하지만 IFN-γ, TNF-α, TNF-β는 중간엽줄기세포와 함께 배양한 경우에는 분비량이 줄었다. 중간엽줄기세포와 혼합배양시 IFN-γ와 TNF-α가 시간에 따라 어떻게 분 비되는지 확인하기 위해 동일한 방법으로 측정하였다 (Fig. 8). IFN-γ의 경우 중
간엽줄기세포가 없는 대조군의 경우 매일 증가하여 72시간이후에는 지속적으로 높은 농도를 유지하였으나, 중간엽줄기세포와 혼합 배양한 경우에는 48시간 이 후에는 IFN-γ의 농도가 증가하지 않은 상태를 유지하였다. 네 가지 중간엽줄기 세포간의 차이는 크지 않았다. TNF-α의 경우에도 대조군의 경우 지속적으로 증 가하는 경향을 나타내었으나, 중간엽줄기세포와 혼합 배양한 경우에는 24시간 이후 증가하지 않은 상태를 유지하였다. 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 경우에는 상대적으로 높은 값을 유지하였으나 대조군에 비해서는 낮은 값을 유지하였다. IFN-γ와 TNF-α가 면역조절에 관여하는 중개자 역할을 수행하는지 확인 하기 위해 네 가지 중간엽줄기세포에 IFN-γ와 TNF-α를 각각 처리 한 후 면역 억제에 관여하는 것으로 알려진 HGF, IDO, IL-10, TGF-β, COX-1, 2의 유전 자 발현을 확인하였다 (Fig. 9). 2,000 IU/mL IFN-γ와 10 ng/mL TNF-α를 처 리하고 48시간 후에 RT-PCR을 시행하였다. HGF, IL-10, TGF-β, COX-1, 2 는 네 가지 중간엽줄기세포 모두 발현하고 있었다. 하지만 IDO의 경우에는 IFN-γ를 처리했을 때 발현이 급격히 증가하였고, TNF-α의 경우에는 발현 정도 가 미약하게 증가하였다.
Fig. 4. Inhibitory effect of MSCs on immune cell proliferation induced by PHA or allogeneic stimulation. Proliferation of immune cells in PBMC (peripheral blood mononuclear cells) induced by phytohemagglutinin (PHA) in the absence or presence of different numbers of MSCs was evaluated at day 3 as the percentage of BrdU+ cells (upper panel). Proliferation of immune cells in PBMC induced by allogeneic stimulation in the absence or presence of different numbers of MSCs was evaluated at day 5 as the percentage of BrdU+ cells (lower panel). MSCs from all sources suppressed immune cell proliferation in a dose-dependent manner. The results are means±SD from four independent experiments.
Fig. 5. Immnuosuppressive effect of MSCs in direct contact or transwell system. PBMC proliferation was partially reduced but not abolished in the transwell system. It suggests that the inhibition of immune cell proliferation induced by PHA is partially mediated by soluble factors. The results are means±SD from four independent experiments.
Fig. 6. Allogeneic reaction of PBMC to MSCs. Coculture of PBMCs with human BM-MSC, AT-MSC, CB-MSC, and WJ-MSC did not trigger the immune cell proliferation in the absence of additional allogeneic stimuli to immune cells. The results are means±SD from four independent experiments.
Fig. 7. Immunophenotypes of lymphocyte on immune cell proliferation induced by PHA. PBMC induced by PHA with or without MSCs cultured for 3 days. Negative control did not stimulated by PHA. Positive control stimulated by PHA without MSCs. Cells were labeled with FITC- and PE- conjugated antibodies and examined by flow cytometry. CD3/CD4 and CD3/CD8 positive portion of PBMC induced by PHA with MSC had smaller than portion of positive control.
Table 4. Secretory factor levels at PHA-induced proliferation assay. BM-MSC AT-MSC CB-MSC WJ-MSC No-MSC PBMC - + + - + + - + + - + + + + PHA - - + - - + - - + - - + - + IL-1a - - + - - + - - + - - + - + IL-1b - - - + - - - + - + IL-2 + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + ++ IL-3 - - + - - + - - + - - + - + IL-4 - - +/++ - - +/++ - - +/++ - - +/++ - + IL-5 - - + - - + - - + - - + - + IL-6 ++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ IL-7 - - + - - + - - + - - - - -/+ IL-9 - - + - - + - - + - - + - +/++ IL-10 - - ++ - - ++ - - ++ - - ++ - ++ IL-12(p40) - ++ ++ - ++ ++ - ++ ++ + ++ ++ ++ ++ IL-12(p70) - - - + IL-13 - - ++ - - +/++ - - ++ - - ++ - +/++ IL-15 - - -/+ - - -/+ + - -/+ + - -/+ - -/+ TNF-α - - -/+ - - -/+ - - +/++ - - -/+ - ++ TNF-β - - -/+ - - -/+ - - -/+ - - - - +/++ IFN-γ - - ++ - - ++ - - ++ - - ++ - ++/+++ IFN-α2 - - - -GM-CSF -/+ + +/++ - + ++ -/+ + +/++ + + +/++ + +/++ CCL2 + ++ +++ + ++ ++/+++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++/+++ CCL3 -/+ + ++/+++ -/+ + ++/+++ -/+ + +++ -/+ ++ ++/+++ +/++ ++/+++ CCL4 + +/++ +++ -/+ ++ +++ + ++ +++ + ++ +++ ++ +++ CCL5 - ++ ++/+++ - ++ ++ - + ++ + ++ ++ ++ ++ CCL11 ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + + + CXCL8 + ++ +++ +/++ ++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ CXCL10 -/+ + +++ -/+ ++ +++ -/+ ++ +++ + + +++ ++ +++ FGF + + +/++ + + +/++ + + +/++ + + +/++ + + PDGF-AA -/+ + +/++ -/+ + + ++ ++ ++ + +/++ +/++ + +/++ PDGF-BB - - + - -/+ + - + + - + + + +/++ EGF -/+ + + -/+ + + -/+ + + -/+ + + + + Flt-3 - - - -VEGF +/++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ - - - - --, value < 50 pg/mL; +50 pg/mL ≤ value < 500 pg/mL; ++, 500 pg/mL ≤ value < 5,000 pg/mL; +++, value ≥ 5,000 pg/mL.
Fig. 8. Secretion levels of IFN-γ and TNF-α from T-cells activated by PHA. The secretion levels of IFN-γ and TNF-α from activated T-cell in the absence or presence of MSCs were measured at different time points by multiplex luminex system. The secretion levels of IFN-γ and TNF-α from activated T-cells increased, while significantly decreased along with reaction time when cocultured with MSCs. The results are means±SD from three independent experiments.
Fig. 9. RT-PCR analysis of HGF, IDO, IL-10, TGF-β1, and COX-1, 2 in MSCs after treatment with IFN-γ or TNF-α. cDNA prepared from the total RNA of MSCs treated with IFN-γ or TNF-α for 48 hours were put into PCR reactions together with primers corresponding to HGF, IDO, IL-10, TGF-β1, and COX-1, 2. The expression level of IDO increased in MSCs by treatment with IFN-γ or TNF-α while HGF, IL-10, TGF-β1, and COX-1, 2 were not changed.
HGF, hepatocyte growth factor; IDO, indoleamine 2,3-dioxygenase; IL-10,
interleukin-10; TGF-β1, transforming growth factor-β1 COX-1,
cyclooxygenase-1; COX-2, cyclooxygenase-2; GAPDH,
