Volume 9, Number 2,October, 2006
가토의 장관골 골결손 부위에 이식한 골막 유래 간엽줄기세포와 지지체
부산대학교 의과대학 정형외과학교실, 고신대학교 의학부 병리학교실*
김휘택∙강동준∙강정한∙이종서∙장희경*∙박순미∙유총일
= Abstract =
Periosteum-Derived Mesenchymal Stem Cells and Scaffolds Transplanted into Long-Bone Defects of Rabbit
Hui Taek Kim, M.D., Dong Joon Kang, M.D., Jeong Han Kang, M.D., Jong Seo Lee, M.D., Hee Kyung Chang, M.D.*, Soon Mi Park, R.N., Chong Il Yoo, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, College of Medicine, Pusan National University, Busan, Korea Department of Pathology, Medical College, Kosin University, Busan, Korea*
Purpose: To observe the changes in periosteum-derived mesenchymal stem cells and different scaffold materials transplanted into rabbit long-bone defects.
Materials and Methods: Thirty-five white rabbits were grouped according to the material transplanted into their tibial bone defects: Group 1 (control group); Group 2-A (agar plus mesenchymal stem cells); Group 2-B (agar only); Group 3-A (Biocompatible Osteoconductive Polymer plus mesenchymal stem cells); Group 3-B (BOP�only); Group 4-A (xenograft plus mesenchymal stem cells); Group 4-B (xenograft only). After surgery, radiologic and microscopic observation were performed weekly for 8 weeks.
Results: Rabbits transplanted with mesenchymal stem cells showed better bone formation than those with- out. Mesenchymal stem cells transplanted with agar had better results than mesenchymal stem cells plus BOP�. Rabbits receiving xenografts showed severe inflammatory reactions.
Conclusion: Further research is needed on rigid scaffold materials which minimize immune reaction, and on how to ensure uniform distribution of mesenchymal stem cells within such materials.
Key Words: Bone formation, Mesenchymal stem cell, Scaffold
※ 통신저자: 김 휘 택
부산광역시 서구 아미동 1가 10 부산대학교병원 정형외과
TEL: 051) 240-7248 FAX: 051) 247-8395 E-mail: [email protected]
� 본 논문은 2005년도 부산대학교병원 의학연구소 학술연구 지원을 받아 이루어 졌음.
서 론
정형외과 영역에 있어 골 결손은 치료하기 힘든 병변중의 하나이다. 골 결손의 치료에는 크게 자 가 골이나 동종 골의 이식, 골 대체물의 이식 등 이 많이 사용되고 있으나 각각의 장단점들이 있 다. 최근 세포 단위의 치료법으로 줄기세포를 이 용한 연구가 활발히 진행되고 있으나 실제로 임상 에 적용하기에는 아직 많은 연구가 필요하다. 그 러나 향후 줄기세포의 이용은 정형외과 영역에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
골 결손부에 줄기세포를 이식할 경우의 지지체 로 수산화인회석 등의 세라믹에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다1,4,10,11,18,20)
. 지지체는 특히 골수 물질이 완전히 제거되어 면역학적 거부반응이 최 소화되면서 무기물과 콜라겐의 구조가 잘 보존되 어야 골 형성에 필요한 신생혈관이 촉진되고 골형 성 세포의 군집과 함께 점차 살아있는 뼈로 대치 될 수 있다2,6). 본 연구는 골막으로부터 배양된 미 분화 간엽줄기세포를 서로 다른 지지체들과 함께 가토 장관골 결손부에 이식한 후 그 변화를 분석 하였다.
연구 대상 및 방법
성에 관계없이 체중이 3.0~3.5 Kg의 성숙한 New Zealand 계 백색 가토 총 35 마리를 대상 으로 하였다. 경골 간부에 부분 절제술 후 이식한 물질에 따라 제 1군[아무것도 이식하지 않은 군], 제 2-A군[agar와 간엽줄기세포를 함께 이식한 군], 제 2-B군[agar만 이식한 군], 제 3-A군 [BOP� (Biocompatible Osteoconductive Orthopedic Polymer, Diversified Tech International S.A., Brussels, Belgium)와 간엽줄기세포를 함께 이식한 군], 제 3-B군[BOP
�만 이식한 군], 제 4-A군[이종골(Lubboc�- sterile heterologous bone graft of bovine origin, OST DEVELOPPMENT, Clermont- Ferrand, France)과 간엽줄기세포를 함께 이식 한 군], 제 4-B군[이종골만 이식한 군]으로 각각 5마리씩 나누어 변화를 비교 분석하였다.
1. 골막 유래 간엽줄기세포의 분리 및 배양
체중이 1,200 gm 내외의 성장 중인 New Zealand 백색 가토의 전 경골부에서 골막을 채취 한 후, 무균 조작 하에 2% 항생제(200 units/mL penicillin과 200 g/mL streptomycin)를 첨가한 PBS (phosphate buffered saline, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)로 3회 세척하 였다. 세척한 골막을 잘게 자른 다음 0.25% col- lagenase (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처 리하여 37�C 배양기에서 30분 간격으로 교반하며 2시간 동안 방치시켰다. 세포 부유액에 동량의 15% 우태 혈청(fetal bovine serum, Gibco BRP, Grand Island, NY, USA)이 든 배지를 넣어 수차례 혼합하여 원심 분리(2,500 rpm, 10 분)하였다. 상층 액을 버리고 얻은 침전된 세포를 두 차례 우태 혈청이 첨가된 배양 배지로 세척한 후, 세포수를 hemocytometer로 측정하였다. 우 태 혈청과 1% 항생제(100 units/mL penicillin 과 100 μg/mL streptomycin)가 첨가된 α-MEM (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배양 액이 든 75 mm3 배양 용기에 세포를 넣고 37�C, 5% CO2배양기에서 일차 배양을 시작하였다. 4일 후 부유하는 세포는 배양액을 교환하면서 버리고 이후 2일 간격으로 배지를 교환하며 세포를 유지하 였다. 일주일 후 배양 용기 바닥에 세포가 가득 차 면 0.25% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 처리하여 세포를 분리하여 계대 배양하였다.
2. 배양된 간엽줄기세포의 골세포 및 지방세포 로의 분화 능력 검사
15% 우태 혈청과 1% 항생제(100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin)가 첨가된 α-MEM (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배양 용액이 들어 있는 6-well(10 cm2) tissue culture plate에 3×103 cells/cm3의 농도 로 24시간 배양한 후 골 형성을 유도할 간엽줄기세 포가 들어있는 조직 배양용기에는 0.1 mM dex- amethasone (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 μM β-glycerophosphate (Sigma, St. Louis,
MO, USA)과 50 μg/mL ascorbic acid (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)으로 구성된 골 형성 유도 용액을 추가하였다. 또한 분리된 세포군 이 단순히 골아 세포 혹은 그 전구세포일 가능성이 있어 1 μM dexamethasone (Sigma, St. Louis, MO, USA), 100 μg/mL 3-isobutyl-1- methylxanthine, 5 μg/mL insulin, 60 μM indomethacin (이상 Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)의 지방 유도 용액을 추가하여 배양하여 분리된 세포군이 지방 세포로 분화를 유 도되는 것을 확인하여 간엽줄기세포임을 증명할 수 있었다. 3일 간격으로 배양액을 교환하며 총 4주간 배양하였다. 본 연구에 사용될 간엽줄기세포에서 골세포로의 분화 정도를 관찰하기 위해 1형 교원질 이 풍부한 세포외 기질의 석회화를 alizarin red로 염색하여 관찰하였다(Fig. 1).
3. 가토의 경골 부분절제술
수술 전 합성한 마취제(ketamine 5 mg/kg, xylazine 0.25 mg/kg, acepromazine 0.75 mg/kg을 배합) 2 mL를 복강 내에 주사하여 전 신 마취한 후 하퇴부의 털을 제거하고 골절제술을 우측 경골에 시행하였다. 먼저 0.062 inch 직경의 K-강선 4개를 경골의 장축에 수직으로 골수강의 중심을 통과하도록 외측에서 내측으로 삽입 후 내 측과 외측에서 각각 외고정 기구(Dyna-Exter�- (ST): dynamic external fixator for finger, BK Meditech, Seoul, Korea)로 고정하였다.
그 다음 두 번째와 세 번째 강선의 중간에 약 2 cm의 피부 절개를 가하여 종으로 근육 층을 분리 하여 절제할 경골을 노출시킨 뒤 골막을 포함하여 1.5 cm의 골 절제술을 시행하였다. 이후 전기 소 작기를 이용하여 골수 강을 제외한 주위 연부조직 의 완전한 지혈을 확인하였다. 절제된 골을 제거할 때 간혹 경골 뒤쪽에 근육 층과 붙어 남아있는 골 막도 세심하게 근육을 포함하여 함께 제거하였다.
4. 동종 간엽줄기세포와 지지체의 혼합 및 이식
실험에 사용된 간엽줄기세포는 같은 개체에서 유 래된 2~4세대의 세포를 사용하였다. 얻어진 간엽 줄기세포는 0.35% agar gel, BOP�, Lubboc�등 과 혼합하여 중합유도 하였다. Agar gel은 1%
agar를 autoclave시킨 뒤 agar가 굳지 않도록 40~50�C water-bath에 꽂아 두고, 24well plate에 작게 접어 미리 autoclave 해둔 거즈를 핀셋을 이용하여 각 well 당 넣었다. 이 후 1%
agar를 미리 예열해 둔 media와 섞어 0.5%로 만 들어 2 ml씩 넣어 well이 바깥공기에 노출이 되지 않도록 잘 싸서 4�C 냉장에서 굳혔다. 마리당 2×
107개/100 μl의 세포(300~500 μl/마리)를 준비하 고 tripsin으로 처리하여 media에 풀어 0.7%
agar와 반반 섞어서 세포가 포함된 0.35%의 agar 를 만들어 거즈를 깐 agar위에 300~500 μl 씩 seeding 하여 편평한 곳에서 20~30분간 굳혔다.
가토에 주입 시에는 거즈 속에 세포가 포함된 agar 부분만 스푼으로 떠서 주입하였다. Lubboc�과 BOP�에도 2×107개/0.35% agar 100 μL에 해당 하는 숫자의 세포를 이식하였다. Lubboc�과 BOP
�은 각각 1.5 cm의 길이로 준비한 후 10% FBS가 포함된 media에 1시간 동안 안정화 시켰다. 그리 고 2×107/100 μl개의 세포를 Lubboc�과 BOP�위 에 흘러내리지 않도록 조심스럽게 분주하였다.
Lubboc�과 BOP�에 분주한 세포를 고정시키기 위 해 37�C incubator에서 3~5시간 배양하였다.
5. 방사선학적 검사
수술 후 1주마다 총 8주간 경골 전후면 사진을 촬영하여 신생골 형성과 성숙 과정을 관찰하였다.
Fig. 1. Differentiation of periosteum-derived stem cells into osteoblast. The calcified areas appear red (×
200, alizarin red stain).
6. 조직학적 검사(광학 현미경 검사)
관찰 도중 사망한 경우와 자연사가 없는 경우 수 술 후 2주, 3~4주, 5~6주, 7~8주 사이의 간격 으로 각 군의 가토를 희생시켜 조직학적 검사를 시 행하였다. 신생 골의 골절이나 변형을 방지하기 위 하여 외고정 장치를 착용한 채로 경골 검체를 채취 하여 4% 중성 formalin에 고정하였다. 표본 제 작은 절골 면과 신생 골을 함께 볼 수 있는 부위를 포함하였다. 골 조직을 4% 중성 formalin에 고 정시킨 후 10% nitric acid에 1주일간 탈회시켜 2시간 세척하였다. 이후 95% ethyl alcohol로 탈 수한 후 청명 과정과 paraffin 침투 후에 포매하 여 4 μm로 박절하여 hematoxylin-eosin 염색으 로 100배의 광학 현미경하에서 관찰하였다.
7. 신생골 형성의 상대 정량 분석
수술 후 7~8주 사이 얻은 가토의 골 조직을 hematoxylin-eosin으로 염색한 후 현미경 표본 에서 먼저 결손의 중앙부에서 40배 배율로 골 형 성이 많은 두 군데를 관찰하였다. 이후 다시 400 배 배율로 가장 신생골 형성이 많이 일어난 부위 를 중심으로 5곳을 선택하여 현미경 영상 분석 프
로그램인 Image-proplus 5.1을 이용하여 골형성 부위/절단면 넓이의 비율을 구하였다. 결과의 통 계학적 분석은 paired t-test를 이용하여 각 군내 에서 간엽 줄기세포 주입군과 대조군 간의 또 각 군 간의 골 형성 정도를 비교하였다. p값이 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
결 과
총 35마리의 가토에서 경골 원위부 핀 고정 부위 골절과 심한 핀 이완으로 절제부의 단축과 가골의 골절이 동반된 7마리를 제외한 총 28마리(각 군 마 다 4마리)에서 1주마다 시행한 방사선학적 검사와 골 결손 부위에 이식한 골막 유래 간엽줄기세포와 지지체에서 수술 후 2주, 3~4주, 5~6주, 7~8주 사이의 간격으로 얻은 골 조직을 분석하였다.
1. 방사선학적 검사
1군에서 수술 후 3주경 방사선적으로 신생골 형 성이 보였으며 6주경에 경화되는 소견을 보였다.
그러나 신생골의 형성은 골결손부의 외측에 치우 쳐지고 경골 간부 직경의 25%에 미치지 못하였
A B
D E
Fig. 2. Serial roentgenograms for groups 1 through 4: In group 1 (A), diffuse bone formation was seen at 3 weeks and consolidation was complete after 6 weeks, but only in the lateral portion of the defect. In groups 2-A (B), 2-B (C), 3-A (D) and 3-B (E), bone formation and consolidation were seen as time passed. More abundant bone formation is seen in the groups transplanted with mesenchymal stem cells. In group 4-A (F), bone formation was not seen until 6 weeks and the xenograft material is still remained.
C
F
다(Fig. 2A). 2-A군에서 수술 후 1주경 신생골 형성이 관찰되기 시작하였으며 3주경 경화되는 소 견이 관찰되었으며, 골결손부의 근위부에서 특히 골형성이 풍부하여 경골 간부의 직경에 해당하는 골형성을 보였으며 원위부로 갈수록 가늘어지는 소견을 보였다(Fig. 2B). 2-B군에서 수술 후 3 주경 신생골 형성이 약하게 보이며 8주경 어느 정 도 경화를 보였다(Fig. 2C). 3-A군에서 수술 후 1주경 신생골 형성이 보이며 3주경 어느 정도 경 화가 이루어지는 양상을 보이나 2-A군보다 균일 하지 못한 양상을 보였고(Fig. 2D), 3-B군에서 수술 후 3주경 미만성의 신생골 형성이 관찰되었
다(Fig. 2E). 4-A군에서 수술 후 삽입한 이종 골편의 음영이 수술 6주 후에도 지속되는 양상을 보이나 골형성의 소견은 보이지 않았다(Fig.
2F). 이러한 소견은 4-B군에서도 유사하였다.
2. 조직학적 검사 - 광학 현미경 검사
1군과 2-B군의 경우 이식 3주경에 주로 골 결 손부의 변연부에만 다수의 연골 세포 및 골 모세 포가 관찰되었고, 6주째는 연골내 골화 현상이 광 범위하게 관찰되었다(Fig. 3). 2-A군 및 3-A군 에서 골 형성의 특징은 전체적으로 연골 형성이
Fig. 3. Group 1: Six weeks after transplantation, carti- laginous components were predominant in the defect (H-E, ×100).
Fig. 4. Group 2-A: Six weeks after transplantation, well- formed lamellar bone were observed (H-E, × 100).
Fig. 5. Group 3-A: Six weeks after transplantation, mostly loose connective tissue is seen and woven and lamellar bone is detected in scant amounts (H-E, ×100).
Fig. 6. Group 4-A: Six weeks following transplantation, the defect was nearly filled with inflammatory cells, with inconspicuous bone formation (H-E,
×100).
적고 간엽줄기세포로 추정되는 미분화 세포로부터 골 모세포가 직접 분화되는 양상을 보였고, 골 모 세포로의 분화는 이식 1주경부터 관찰되었으며 6 주째는 층판 골이 형성되었다(Fig. 4, 5). 3-B군 에서도 2-A군, 3-A군과 주수의 차이가 있으나 유사한 형태의 골 형성 소견이 관찰되었다. 4-A 군과 4-B군에서는 이식한 이종 골편이 존재하며 주위로 심한 염증세포의 침윤이 보이는 이물 반 응이 관찰되었으며, 뚜렷한 골소주는 관찰되지 않 았으나, 극히 미세한 현미경적 신생골 형성이 관 찰되었다(Fig. 6).
3. 신생골 형성의 상대 정량 분석 결과
시술 후 7~8주째의 골형성 비교에서 골형성 부 위 /절 단 면 넓 이 평 균 치 가 2-A군 은 0.6253(±0.0033)이었고, 2-B 군은 0.3210(±
0.0001)로 2군이 다른 군에 비하여 가장 신생골 형 성 이 많 았 으 며 (p=0.0001), 3-A 군 은 0.3227(±0.0001), 3-B군은 0.2941(±0.0003) 이었고, 4-A 군은 0.0125(±0.0006), 4-B 군은 0.0097(±0.0001)로, 4군이 가장 적은 골 형성 을 보였다(p=0.0001). 각 군마다 줄기세포가 이 식된 A 군이 대조군이 B 군보다 신생골 형성이 많았으며, 특히 2군에서는 A군이 B군 보다 의미 있게 많은 신생골 형성을 보였다 (p=0.0001).
고 찰
다양한 분화 능력을 가진 줄기 세포를 이용하여 골 유합을 유도하는 실험적 연구가 최근 활발히 진 행되고 있다1,3,8,15,16,19)
. 배양된 줄기세포를 사용할 경우 자가 골이식에서 생길 수 있는 공여 부위의 문제점과 동종골 이식 시 생길 수 있는 면역학적 문제점들이 상당히 해결될 수 있으며 생리적인 골 의 재생을 유도할 수 있다1). 현재 이러한 줄기세포 를 생체 외에서 골형성 세포로 배양 및 분화시킨 후 다양한 지지체를 이용하여 생체 내의 골 결손부 에 이식하여 골유합을 유도하는 연구가 활발히 진 행되고 있다1,5,21). 조직공학의 발전으로 삼차원적인 다양한 구조의 지지체에 대한 연구가 진행되어 왔 으며 최근에는 전자섬유로 만들어진 지지체(elec-
trospun silk fibroin-based scaffold)가 줄기세 포연구와 관련된 지지체로 사용되어 주목을 받고
있다14,17,22). 또한 여러 골형성 단백질을 지속적으로
생산하기 위해 줄기세포의 유전자에 골형성 단백 질 유전자를 삽입시키는 방법도 연구 중이다7,8,12).
본 연구에서는 골막으로부터 간엽줄기세포를 배 양하였다. 배양된 세포를 대상으로 분화 능력 검 사를 시행하여 골 조직으로 분화됨을 통해 알 수 있었다. 본 연구에서는 2주간의 계대 배양을 통해 다량 증식된 골막유래 간엽줄기세포를 골 세포로 분화 시키지 않은 채 골 결손부에 이식시켜 골 형 성 정도를 알아보았다. 이 경우 김13) 등은 이식 세포에 표식한 형광표식을 이용하여 새로 형성된 뼈가 줄기세포에서 유래되었음을 간접적으로 밝힌 바 있다. 본 연구에서는 골절제술과 함께 골막 제 거 시 전기 소작기를 이용하여 골수강을 제외한 주위 연부조직의 출혈을 완전히 지혈시키고 지지 체와 함께 배양된 간엽줄기세포를 중합 이식하여 혈종형성을 방지함으로서 골 형성의 초기 신생 혈 관화의 실패를 방지하고자 노력하였다19).
본 연구에서 선택된 지지체로는 이식된 간엽줄 기세포의 분산을 억제하는 동시에 균일한 분포를 유지하기 위하여 고형 agar를 이용하였으며, 다른 종류로는 골전도 기능이 좋지 않은 것으로 알려져 있는 이종골(xenograft)과 BOP�을 사용하였다.
그 결과 간엽줄기세포를 함께 이식한 군에서 간엽 줄기세포를 이식하지 않았던 군에 비하여 단순 방 사선 사진 상 가골 형성 및 골경화가 촉진되었으며 조직학적으로도 골 형성이 우수함을 알 수 있었고, 이를 현미경 영상 프로그램을 이용한 객관적인 상 대 분석에서 확인할 수 있었다. 간엽줄기세포와 함 께 삽입하였던 지지체 간의 비교 시에는 agar의 경우가 골형성 부위/절단면 넓이가 0.6253(±
0.0033)으로 가장 골 형성이 잘 되었으며, BOP� 의 경우도 0.3227(±0.0001)로 지연되는 양상을 보이나 골 형성이 이루어지는 것을 볼 수 있었다.
특히 agar 이식 군의 경우 다른 군에 비하여 엑스 선상 균질의 골 형성 음영을 보이는바 이는 타 군 에 비해 줄기세포의 고른 분포를 유지 할 수 있었 기 때문으로 생각되었다. 또한 조직학적 검사 상 술 후 7일에 이식된 간엽줄기세포군의 변연부 즉 골 결손부의 골수와 인접한 부위에 섬유 세포 모양
의 간엽 세포가 관찰되었고 그 변연부에서는 골을 형성하는 골 형성 세포가 관찰되었다. 그러나 이종 골을 삽입한 경우는 거의 골 형성이 되지 않았다.
경골 절제술 후 아무것도 이식하지 않은 1군 및 모든 군에서 경골 후 외측부에 골 형성이 먼저 일 어났다. 이는 경골 절제술 시 전 내측의 골막은 비 교적 노출이 용이하여 완전 제거가 되었으나 골 절 제술을 시행한 뒤 노출되는 후 외측의 골막은 주위 의 근육과 구별이 용이하지 않아 완벽한 제거가 어 려웠고, 또한 경골 후 외측의 두꺼운 근육 층에 따 른 혈류 공급이 원활하여 생긴 것으로 짐작된다.
동종 간엽줄기세포 이식 시 거부 면역 반응은 발생하지 않는 것으로 알려져 있다1). 이는 간엽줄 기세포에서 면역 감작에 필요한 세포 표면 항원이 발현되지 않기 때문이다. 본 연구에서 agar와 BOP�를 지지체로 사용한 경우 조직학적 검사 상 림프구등의 염증세포의 침윤이 현저하지 않아 이 식 거부 면역 반응이 현저하지 않음을 알 수 있었 다. 그러나 이종골을 이식한 군에서는 심한 염증 세포의 침윤을 보였다.
본 연구 결과를 볼 때 골 형성 세포로 유도 하 지 않은 단순 간엽줄기세포도 향후 실제 임상 상 황에서 자가골 또는 동종골 이식을 대치하여 적용 가능할 것으로 생각된다. 또한 우수한 골 전도성 과 골 유도성을 가지는 지지체의 개발과 선택은 간엽줄기세포의 실제 임상적 적용을 가속화 시킬 수 있을 것으로 생각된다.
결 론
골형성 세포로 유도 하지 않은 단순 간엽줄기세 포에 의한 골형성 능력은 지지체로 삽입한 이식물 의 종류에 따라 골 형성 정도가 촉진될 수 있다.
향후 간엽줄기세포의 연구와 함께 골 형성을 촉진 시킬 적절한 지지체의 개발이 동시에 필요할 것으 로 생각된다.
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