토끼 전완부 요골 결손 부위에 자가 이식된 골모세포의 골형성능

(1)

외상, 종양의 수술, 골 질환 등으로 인하여 사지 골의 일부분을 잃게 되는 경우 그 환자의 여생에 있어서의 장 해는 대단히 커서, 정상적인 골격계의 기능을 재건하고

자 하는 많은 노력이 시행되어왔지만 많은 제한점과 문 제점들을 가지고 있다. 배양된 자가 세포를 골이식 대신 에 사용하는 경우에는, 일반적인 자가골 이식 시 생길

76

목 적: 골모세포를 해면골과 골수에서 분리한 후, 이를 다량으로 배양하여 골 결손부위에 이식하였을 때, 이 부위에 안정 성을 부여해 줄 수 있는 골조직을 형성하는가를 보고자 하였다.

대상 및 방법: 뉴질랜드 백색 토끼 20마리의 전완부의 요골 간부에 15 mm 정도의 골결손 부위를 만들었다. 실험군 10마 리는 토끼의 장골에서 해면골과 골수을 채취하여 여기서 골모세포를 분리한 후 배양하여, 이를 골결손을 만든 후 3주째 에 결손 부위에 주사기로 주입하였다. 대조군 10마리는 토끼의 장골에서 해면골을 얻어 이를 골결손 부위에 이식하였다.

실험 후 3주, 6주 및 9주에 방사선 촬영을 하였고, 9주에 토끼를 희생시켜 조직을 얻었다.

결 과: 실험군에서 정상 골조직의 형성을 보이고 있으며 방사선 검사상 골결손 부위에 골형성이 관찰되었다. 대조군과 비 교하여 비슷한 골형성의 시기 및 유합속도를 보였으며 조직 검사상 비슷한 정도의 골형성이 관찰되었다.

결 론: 골결손 부위에 자가 이식 된 골모세포는 골화를 유도함을 확인 하였다. 향후 골이식이 필요한 여러 상황에 적용할 수 있을 것이라 기대된다.

색인 단어: 골결손, 자가 골모세포 이식, 골형성

Purpose: To evaluate the osteogenic potential of an autologous cultured osteoblast transplant to the

bone defects.

Materials and Methods: Radial bone defects over 15 mm were made in 20 New Zealand white rabbits

using the anterior approach. There were 10 rabbits in the control group, which underwent an iliac bone graft to the preformed bone defect 3 weeks from the initial operation. There were 10 rabbits in the experi- mental group that underwent an autologous cultured osteoblasts injection. After 9 weeks, both groups were compared radiologically and histologically.

Results: The osteogenesis in both groups were progressed similarly and there was no difference in

terms of the amount of bone formation and the duration of the bone union.

Conclusion: An autologous cultured osteoblast transplant to the bone defect produces bone efficient-

ly. In addition, it can be applied to a wide field, which requires a bone grafting operation.

Key Words: Bone defect, Autologous cultured osteoblasts transplantation, Bone formation

Department of Orthopedic Surgery, Uijeongbu St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea, College of Medicine, Seoul;

Central Research Institute, Cellontech*, Seoul, Korea

Seok-Jung Kim, M.D., Cheong-Ho Chang, M.D., Jae-Deog Jang, Ph.D., Seung-Koo Lee, M.D., Won-Jong Bahk, M.D., Yong-In, M.D., and Hyung-Moon Yoon, M.D.

Bone Formation of Cultured Osteoblasts in Bone Defect of Radial Shaft of Rabbit

76

토끼 전완부 요골 결손 부위에 자가 이식된 골모세포의 골형성능

김석중ㆍ장정호*ㆍ장재덕*ㆍ이승구ㆍ박원종ㆍ인용ㆍ윤형문

가톨릭대학교 의과대학 의정부 성모병원 정형외과, 셀론텍*

76 76 통신저자 : 인 용

경기도 의정부시 금오동 65-1 가톨릭대학교 의정부성모병원 정형외과 TEL: 031-820-3066∙FAX: 031-847-3671 E-mail: [email protected]

Address reprint requests to Yong-In, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, Uijeongbu St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea, 65-1 Geumo-dong, Uijeongbu 480-130, Korea

Tel: +82.31-820-3066, Fax: +82.31-847-3671 E-mail: [email protected]

(2)

수 있는 공여부위의 문제점과 동종골 이식 시 생길 수 있 는 면역학적 문제점, 질병의 전파와 같은 문제점들이 해 결될 수 있으며, 빠른 회복을 도모할 수 있을 것이다⁶⁾. 실 험적으로 골수 기질세포는 주변 조직 환경에 따라 골모 세포, 연골모세포, 섬유모세포 또는 지방세포 등으로 분 화할 수 있는 능력을 갖고 있다고 알려져 있다^2,11,12). 그 러나 골수 기질세포는 골수 내 수효가 극히 적어^3,4), 이 를 실험에 이용하기 위해서는 세포 배양이 필수적이며, 이러한 잠재적 분화능력을 가진 골수 기질 세포가 골절 부위의 유합에 도움을 줄 것이라고 예상할 수 있다⁵⁾. 따 라서 본 실험의 목적에서는 골수 및 골에서 분리한 세포 가 골절부위의 안정성을 복원할 수 있는 정상 골조직으 로 분화할 수 있는 가를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

1. 실험 동물

암, 수 구별 없이 체중 약 3 kg 내외의 New Zealand 백색 토끼 20마리를 실험 일주일 전부터 동일 사료 및 동일 조건하의 사육장에서 사육하였다. 이 중 10마리는 골모세포이식을 위한 실험군으로 하였고, 나머지 10마 리는 자가골이식을 위한 대조군으로 하였다.

2. 골결손부위 형성

토끼를 ketamin 마취하에 앙와위로 놓은 후 토끼의 전완부를 Henry 도달법에 따라 종 절개하여 요골 간부 를 노출시켰다. 이후 줄톱을 이용하여 15 mm의 골결손 을 만들었다⁷⁾(Fig. 1). 이때 골결손 부위의 골막은 철저 히 제거하고 결손부위를 빈 공간으로 만들기 위해 조심

스럽게 피부 및 피하조직을 봉합하였다.

3. 골수 기질 간세포의 채취 및 골모세포 배양 결손부위를 만들고 난 후, 실험군 토끼의 후장골능에 서 채취한 골수가 포함된 골편을 30 mL의 10% FBS- MEM 배양액(M-0644, Sigma Chemical Company, St. Louis, USA)과 350 unit의 heparin이 든 용기에 넣어 실험실로 옮겼다. 이를 조심스럽게 흔들어 섞은 후 큰 골편은 제거하고, 4℃에서 3,000 rpm으로 10분간 원심분리를 하였고(RT6000B, Refrigerated Cen- trifuge, DuPONT Company, Newtown, CT, USA), 골편은 collagenase를 24시간 처리한 후 원심분리를 하여 상층액을 제거하고 남은 침전물에 20 mL의 배양 액을 첨가하였다. 여과기(No 2350, Falcon, Franklin lakes, NJ, USA)를 이용하여 여과시킨 후 이를 배양용 기(No 25020, Corning, NY, USA)에 10 mL씩 담아 서 배양을 시작하였으며 배양기(Model 3194, Auto- matic CO2 Incubator, Forma Scientific Inc, Ohio, USA)는 37℃, 5% CO² 환경으로 유지하였다. 다음날 부터 3일에 한번씩 L-ascorbic acid (A-4544, Sigma Chemical Company) 50 g을 첨가하여 세포들이 골 모세포(osteoblast)로 분화토록 하였다. 광학현미경으 로 세포 배양 정도를 평가하면서, 배양 5일째에 배양액 을 교환하여 주었고, 이후부터는 3일마다 배양액 교환 후에 L-ascorbic acid를 첨가하였다. 배양 14일째 alkaline phosphatase활성을 확인하는 조직화학 염

Fig. 1.The bone defect of a rabbit radial shaft was made by the complete removal of more than 15 mm of bone and periosteum.

Fig. 2.The stains were carried out during culture. (A) Alkaline phosphatase stains a dark blue color and is highly positive in the NBT-BCIP stain after approximately 2 weeks of culture. (B) Calcium stains in bright red and is highly positive in the Alizarin red stain after 4 weeks of culture.

A B

(3)

색(Fig. 2A)을 시행하고 배양 24일이 지난 후 세포 기질 내에 새로이 형성된 칼슘을 확인하는 Alizarin red 염색 (Fig. 2B)을 하여 골모세포들이 주로 배양되었음을 확 인하였다. 배양 20일째에 배양액을 제거한 후 trypsin- ETDA (No 25200-056, Gibco BRL, Gettysburg, USA) 5 mL로 씻어 냈으며 다시 trypsin-ETDA 3 mL 를 첨가하여 배양기에 5분간 두었다. 배양액 3 mL을 가 하여 trypsin-ETDA의 활성을 멈추게 한 뒤 배양용기 내의 모든 내용물을 원추 용기에 모았으며, 이를 4℃에

서 1,500 rpm으로 6분간 원심분리를 한 후, 상층액을 제거하고 나머지를 모아 세포수가 5,000,000/mL가 되게 한 후 이를 이식에 이용하였다.

4. 배양 중 조직학적 검사

배양 14일째 NBT-BCIP (nitro blue tetrazolium chloride (NBT) -5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)) 염색상 푸르게 염색되는 Alk-p양 성을 나타냈고(Fig. 2A), 배양 24일이 지난 후 시행한 Alizarin red 염색상 붉은색으로 염색되어 칼슘침착을 보여(Fig. 2B), 배양세포들이 골모세포의 성질을 나타 내었다.

5. 골모세포 및 자가골 이식

골결손을 만들었던 실험군의 토끼를 ketamin 마취하 에 앙와위로 놓은 후 골결손 부위에 경피적으로 배양한 골모세포를 1 mL 주사기로 주입하였다. 대조군의 토끼

Mid portion of SUM defect Distal

osteotomy area Proximal

osteotomy area Point

3 Union Union Union

2 Moderate bridge Moderate bridge Moderate bridge (>50%) (>50%) (>50%) 1 Mild bridge (<50) Mild bridge (<50) Mild bridge (<50)

0 Nonunion Nonunion Nonunion

Table 1.The method for measuring bone formation in the defect

C D

A B

Fig. 3.The radiographs of the experimental group at 9 weeks after the osteoblasts injection shows good bone formation of the defect.

(A-D) Each shows 9 points of bone formation according to Table 1.

(4)

는 미리 장골에서 해면골을 채취한 후, 3주 전 만들었던 골결손 부위에 다시 절개를 가한 후 골이식을 하였다.

동물들은 gentamicin (40 mg/day)을 이분하여 근주 하였고, 사육실에서 자유행동을 허용하였다.

6. 관찰 방법

실험 후 3주, 6주 및 9주에 방사선 촬영을 한 후, 상부 절골부, 하부절골부, 골 결손부의 골유합의 정도에 따라 각각 점수를 주어 이들의 합으로 실험의 효과를 평가하였 다(Table 1). 두 군간의 결과에서 통계적 처리는 Fisher

exact test를 사용하였으며 p<0.05일 때 유의한 것으로 보았다. 비교 9주에 토끼를 희생시켜 골결손이 있었던 부위와 상하 골간부의 일부를 함께 적출하여 formalin 에 고정하여 20% 수용성 formic acid와 10% sodium citrate 혼합액으로 3-4일간 탈석회화(decalcification) 시키고 paraffin에 포매하여 약 6 m 두께의 조직표본 을 만들었다. 이를 hematoxylin-eosin 염색을 시행하 여 조직을 관찰하였다. H-E 염색상 골양 조직을 관찰 하고자 하였다.

결 과

1. 방사선학적 검사

실험군(Fig. 3)의 경우, 실험 9주에 촬영한 방사선 소 견상 8예에서 excellent, 2예에서 good, 대조군(Fig. 4) 에서는 9예에서 excellent, 1예에서 good 소견을 보여 두 군간의 차이가 통계적으로 유의하지 않았다(p>0.05) (Table 2).

Experiment group Control group

Excellent (8-9) 9 8

Good (6-7) 1 2

Fair (4-5) - -

Poor (2-3) - -

No effect (0-1) - -

Table 2.The results of the two groups

C D

A B

Fig. 4.The radiographs of the control group 9 weeks after the iliac bone graft shows good bone formation. (A-C) Each shows 9 point of bone formation according to Table 1. (D) The remaining defect in the junction between the proximal osteotomy site and the injection site indicates 6 points of bone formation according to Table 1.

(5)

2. 조직 및 조직화학적 검사

대조군과 실험군에서 이식부위와 절골단 사이에 골형 성에 의한 연속성이 생겨 완전 유합의 상태를 보이고 있

으며, 혈행의 증가와 성숙한 층판골 형성 소견을 보였다 (Fig. 5). 실험군의 경우 이식한 부위에서 골모세포가 모여있는 부분과 유골의 형성부분, 성숙골의 형성부분

C D

A B

Fig. 7.The radiographs of the bone defect without the graft shows no continuity between the osteotomy sites. (A) immediate after making a bone defect, (B) 3 weeks, (C) 6 weeks, (D) 9 weeks.

Fig. 5.H-E stain of the experimental group at 9 weeks of osteoblasts injection shows continuity between the osteotomy site and the injection site. In addition, mature bone formation can be seen. A, Osteotomy site; B, Bone adjascent to ulna; C, Osteo- blasts injection area.

B

C

A

Fig. 6.High power field of the injection area of the experimental group 9 weeks after the osteoblasts injection shows many osteoblasts, osteoid, mature bone through the arrow, suggesting the progression of bone formation.

(6)

이 일직선상으로 보여, 세포에서 골형성이 진행되는 양 상을 보였다(Fig. 6).

고 찰

대부분의 의사들에게 선호되는 골이식의 방법은 자가 골 이식으로서, 이 경우, 환자의 신체 일부 특히 장골 능 에서 골을 채취하여 이식하게 되는데 자신의 골을 이식 하기 때문에 가장 자연스럽고 좋은 결과를 예측할 수 있 다. 그러나 자가골 이식은 매우 통증이 심한 술식이라는 단점을 가지고 있으며, 골이식에 따른 수술을 추가로 받 아야하므로, 오랜 입원기간과 회복기간이 필요하고, 이 에 따른 치료비의 상승을 가져와 여러가지 잠재된 문제 점들을 안고 있다¹⁾. 그리고 인체는 골이식을 위한 여분 의 뼈를 많이 가지고 있지 않아, 골이식의 공여부를 확 보하는데 어려움이 많은 제한점을 가지고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 실시되어온 동종골 이식의 경우 주로 사체에서 골을 얻어 사용하게 되는데 골이식을 위 한 추가적인 이차 수술이 필요하지 않다는 장점을 가지 고 있지만, 멸균과정 동안에 골의 강도가 약해지고, 거 부반응의 발생, 간염이나 AIDS와 같은 전염성 질환에 감염이 될 수 있다는 단점을 가지고 있다^6,8,10). Bruder 등⁴⁾은 세포를 배양한 후 이식하는 것이 이러한 문제를 해결할 수 있는 가장 가능성이 있는 방법이라고 생각하 여 매개체를 이용하여 서로 다른 종에 이식한 후 성공적 인 결과를 발표하였다. 그러나 본 실험은 자신의 혈종을 일종의 매개로 사용한 후 그 골형성능을 본 것으로 이전 의 발표보다 좀더 자연스러운 골격의 재형성을 이루어낸 것으로 그 의미가 있다 하겠다. 그러나 아직까지 이식을 위해 사용되는 세포의 기원과 형태학적 특징들에 대한 정보나 골형성과 재형성을 조절하는 요인들에 대한 지식 은 제한되어있다^2,3,13). 또한 효과를 얻기 위해 필요한 세 포 수, 배양법, 시술법 등에 대한 많은 임상적인 시도와 연구를 통해 효과적인 치료의 방법에 대한 어느 정도의 공통된 인식이 필요하다. 본 연구에서는 이식에 필요한 세포 수를 결정하는데 있어 기존의 자료를 통해 가설을 세웠는데, 새로 형성되는 골조직은 해면골 조직에 가깝 고 이러한 골조직에 포함되는 뼈세포의 수는 Vashishth 등에 의해, 뼈세포가 골조직에 균등하게 분포한다고 가 정하고 부피단위로 환산하면 뼈 1 cm³당 약 4.07×10⁵ 개의 뼈세포가 존재하는 것으로 계산이 된다¹⁴⁾. 따라서

500만개의 골모세포가 형성할 수 있는 뼈의 이론적인 부피 양은 약 12.5 cm³이 된다. 이 중 50% 정도가 재형 성으로 흡수된다 하더라도, 나머지는 골결손 부위를 채 우는 충분한 양이 된다⁹⁾. 본 실험에서는 골 형성이 자연 적으로 일어나지 않는 골 결손 부위의 크기를 15 mm로 하여, 추시 한 결과 양측 절골단 부위가 가늘고 얇아져 서 더 이상 골형성이 일어나지 않았다⁷⁾(Fig. 7). 따라서 이 이상 크기의 결손 부위에 골모세포들 이식한 후, 골 형성을 관찰하였기 때문에, 이는 이식한 골모세포에 의 해서 골형성이 일어난 것으로 생각된다. 만족할 만한 골 의 형성을 얻을 수 있었던 이유는 자가골이나 동종골을 이식하는 경우에는 이식을 위한 수술 시, 주변의 혈액공 급에 장애를 가져올 수 있고 또한 골 유합을 위해서 이식 골이 흡수되고 재형성되는 과정을 거쳐야 하지만, 골모 세포를 이식하는 경우에는 이러한 과정을 거치지 않고 골모세포에 의해 형성된 미성숙 골조직이 쉽게 주변의 조직과 연계되기 때문으로 생각된다. 골절의 유합을 위 해서 자가골 이식은 가장 빠르고 효과적인 방법임에는 틀림이 없지만, 수술로 인한 공여부위의 통증과 이식골 의 양적인 제한점, 그리고 이식을 위해 추가의 수술이 필요하다는 점들을 고려한다면, 골유합의 효과를 낼 수 있는 골모세포 이식술은 이러한 자가골 이식술의 대안이 될 수 있다고 생각된다.

결 론

골 결손 부위에 자가 이식 된 골모세포는 골화를 유도 함을 확인 하였다. 향후 골 이식이 필요한 여러 가지 상 황에 적용할 수 있을 것이라 기대된다.

참고문헌

1. Ahlmann E, Patzakis M, Roidis N, Shepherd L and Holtom P:Comparison of anterior and posterior iliac crest bone grafts in terms of harvest-site morbidity and functional outcomes. J Bone Joint Surg, 84-A: 716-720, 2002.

2. Ashton BA, Allen TD, Howlett CR, Eaglesom CC, Hattori A and Owen M:Formation of bone and cartilage by marrow stro- mal cells in diffusion chambers in vivo. Clin Orthop, 151: 294-307, 1980.

3. Bruder SP, Fink DJ and Caplan AI: Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair and skeletal regeneration thera-

(7)

py. J Cell Biochem, 56: 283-294, 1994.

4. Bruder SP, Jaiswal N, Ricalton NS, Mosca JD, Kraus KH and Kadiyala S:Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration. Clin Orthop, 355 (Suppl): 247-256, 1998.

5. Bruder SP, Kurth AA, Shea M, Hayes WC, Jaiswal N and Kadiyala S:Bone regeneration by implantation of purified, cul- ture-expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res, 16:

155-162, 1998.

6. Hao L, Cai Y and Niu X: Cancellous bone allograft in manage- ment of bone defect following tumor resection. Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 40: 665-668, 2002.

7. Herold HZ, Hurvitz A and Tadmor A: The effect of growth hormone on the healing of experimental bone defects. Acta Orthop Scand, 42: 377-384, 1971.

8. Jorgenson SS, Lowe TG, France J and Sabin J: A prospec- tive analysis of autograft versus allograft in posterolateral lumbar fusion in the same patient. A minimum of 1-year follow-up in 144 patients. Spine, 19: 2048-2053, 1994.

9. Kim KW, Ha KY, Moon MS, Kim YS, Kwon SY and Woo YK:Volumetric change of the graft bone after intertransverse fusion.

Spine, 24: 428-433, 1999.

10. Liu J, Wang Z, Hu Y, Liang G and Huang Y: Complications of massive allografts after segmental resection of malignant bone tumors. Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 38: 332-335, 2000.

11. Lu X, Li S and Cheng J: Bone marrow mesenchymal stem cells:

progress in bone/cartilage defect repair. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi, 19: 135-139, 2002.

12. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284:

143-147, 1999.

13. Schneider U: Autogenous bone cell transplantation. Orthopade, 27: 143-146, 1998.

14. Vashishth D, Gibson G, Kimura J, Schaffler MB and Fyhrie DP:Determination of bone volume by osteocyte population. Anat Rec, 267: 292-295, 2002.