Measurement of PT, aPTT, and Fibrinogen by Automatic Coagulation Analyzer, ACL9000

전자동혈액응고분석기 ACL9000을 이용한 PT, aPTT, 섬유소원의 측정

김영아․선영규

국민건강보험공단 일산병원 진단검사의학과

Measurement of PT, aPTT, and Fibrinogen by Automatic Coagulation Analyzer, ACL9000

Young Ah Kim and Young Kyu Sun

Department of Laboratory Medicine, National Health Insurance Medical Center, Goyang, Korea

Background：Newly developed ACL9000 automatic coagulation analyzer was evaluated in measurement of prothrombin time(PT), activated partial thromboplastin time(aPTT) and fibrinogen.

Methods：We studied precision including withtin-run and between-day precision. Normal reference ranges for PT, aPTT and fibrinogen were obtained in 60 healthy normal controls. The heparin sensitivity for aPTT and heparin interference for PT and fibrinogen were also determined.

Lastly ACL9000 was compared with another coagulation analyzer, MLA Electra 1600.

Results：Precision of PT, aPTT and fibrinogen were acceptable, mostly. The normal reference ranges were as followings: 10.7-12.4 sec for PT, 28.7-40.8 sec for aPTT and 165-468 mg/dL for fibrinogen. The ranges of aPTT were from 49.8 sec to 84.7 sec in therapeutic heparin concentration(0.2-0.4 IU/mL) and heparin interfered determination of PT and fibrinogen in high concentrations. The comparability between ACL9000 and MLA Electra 1600 was good in determinations of PT and fibrinogen but not in determination of aPTT.

Conclusions：We concluded that the performance of ACL9000 was acceptable and ACL9000 would be a useful analyzer for routine coagulation tests.

Key Words：ACL9000, Automatic coagulation analyzer, Prothrombin time, Activated partial thromboplastin time, Fibrinogen

교신저자：김영아

우) 411-719 경기도 고양시 일산구 백석동 1232번지 건강보험국민공단 일산병원 진단검사의학과

전화：031-900-0908, FAX：031-900-0925 E-mail：[email protected]

서 론

최근 검체 분주부터 시약의 잔량까지 자동 측정되는 완 전 자동화된 혈액응고자동분석기가 소개되고 있다[1]. 새로 운 혈액응고자동분석기의 도입을 고려할 때는 기능적인 면 을 평가하는 것이 필요하다. 특히 혈액응고기기는 기기, 시 약 등 여러 가지 요인에 의해 결과값이 영향을 받으므로 기 존 장비와의 상관성 및 참고치의 설정이 매우 중요하고 기

본적인 사항이다[2].

저자들은 새로 소개된 ACL9000 기기(Werfen Medical

IL, Barcelona, Spain)를 평가하기 위해, 가장 많이 의뢰

되는 기본적인 응고검사인 prothrombin time(PT), acti-

vated partial thromboplastin time(aPTT) 및 섬유소

원(fibrinogen) 측정의 정밀도, 검사실 참고치 설정, aPTT

의 헤파린에 대한 민감도(heparin sensitivity), PT와 섬

유소원 측정에 대한 헤파린의 영향 및 시약의 안정성을 알

아보았다. 또한 기존 장비인 MLA Electra 1600(Werfen

Medical IL, Barcelona, Spain)과의 상관성을 비교하고

자 하였다.

Table 1. Precision of PT, aPTT and fibrinogen measured by ACL9000

Control level Mean Precision(CV, %)

Within-run Between-run Between-day

PT(sec) NPP 11.2 1.1 1.0 1.6

ANPP 14.7 0.9 1.7 1.4

NC 12.2 0.6 1.8 1.2

ANC I 23.2 2.0 1.9 4.1

ANC II 42.9 2.9

aPTT(sec) NPP 32.7 0.6 7.5 1.5

ANPP 47.0 1.3 1.1 2.0

NC 29.1 1.8 1.4 1.8

ANC I 55 0.5 0.6 4.8

ANC II 81.9 0.7

Fibrinogen NPP I 313 3.8 9.4 3.7

(mg/dL) NPP II 436 4.8 3.6 4.1

NC I 285 3.7 3.8 4.1

NC II 316 3.6 3.3 2.4

Abbreviations: ANC I, abnormal control plasma level I; ANC II, abnormal control plasma level II; ANPP, abnormal pooled plasma; NC, Normal control plasma; NPP, normal pooled plasma; PT, prothrombin time; aPTT, activated partial thromboplastin time.

대상 및 방법 1. 기기 및 시약

ACL9000의 검사 항목은 응고(nephelometry), 비색분 석(chromogenic method), 면역분석(immunological me- thod)의 다양한 원리를 사용하고 있다. 응고법은 660 nm LED 광원을 사용, 90도 light scattering을 측정하여 PT, aPTT, thrombin time, 혈액응고인자, protein C 및 protein S를 검사한다. 비색분석법은 할로겐 램프 광원 405 nm를 사용, 180도 light absorbance를 측정하여 antithrombin III, plasminogen, plasmin inhibitor, heparin Xa, protein C를 검사한다. 면역분석법은 405 nm 할로겐 램프 광원을 사용, 180도 turbidimetry 측정 으로 D-dimer, FDP, von Willebrand factor 및 free protein S를 검사한다. 특히 ACL9000은 섬유소원 측정에 PT 유도법(PT-derived method)을 사용하고 있는데, PT 를 측정하는 과정 중에 생기는 응고산물의 생성 전 후의 흡 광도의 변화로 섬유소원을 측정하는 방법이다[3, 4].

ACL9000 시약은 IL Test PT-Fibrinogen HS(IL, Lexington, MA, ISI=1.41)를 사용하여 PT와 섬유소원을 측정하였고, aPTT 측정에는 IL test aPTT Lyophilized Silica(IL, Lexington, MA)를 사용하였다.

기존장비와의 상관성 평가를 위해서 MLA Electra 1600 에는 Ortho Recombiplastin PT(Hemoliance IL, Lex- ington, MA, ISI=1.03), Ortho Synth Asil aPTT (He- moliance IL, Lexington, MA), Ortho Fibrinogen (Hemoliance IL, Lexington, MA) 시약을 사용하였다.

기존의 MLA Electra 1600에서는 섬유소원 전용시약에 의한 직접측정을 한다.

2. 측정대상 및 검체 보관

혼주혈장(pooled plasma)은 환자 검체를 사용하였고 의뢰된 검체 중 용혈이나 lipemia가 있는 검체는 제외하고 정상 및 비정상 검체로 나누어 모은 후 충분히 섞어 주고 1.5 mL microtube에 분주하여 -70℃에 보관하였다. 검 사 시 37℃에서 녹인 후 얼음에 넣고 사용하였다.

2001년 10월 한 달간 건강검진을 위해 일산병원에 내원 한 성인 중 특이 소견이 없는 건강한 사람 60명의 혈장으 로 PT, aPTT, 섬유소원의 정상참고범위를 구하였다.

같은 기간 내 PT, aPTT 및 섬유소원 검사가 의뢰된 환

자 중 정상과 비정상 결과가 고루 포함되도록 50명을 선별

하여 상관성 검사를 시행하였다. 검체는 먼저 MLA Electra

1600에서 측정하였고, 되도록 1시간 내에 ACL9000에서

측정하였으나 부득이하게 지연되는 경우 냉장보관(2-4 ℃)

Table 4. The changes of PT, aPTT and fibrinogen concentration measured using reagents on board for 5 days

Control level Mean CV(%)

PT(sec) NPP 11.7 1.4

ANPP 14.8 3.0

aPTT(sec) NPP 36.0 1.1

ANPP 47.8 0.4

Fibrinogen(mg/dL) NPP 285 3.1

Abbreviations: same as table 1.

Table 3. The percent changes of PT and fibrinogen concentration after in vitro addition of heparin Heparin

(IU/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

PT(sec) 10.6 10.7 10.9 11.3 11.6 12.0 11.6 11.7 12.0 12.4 12.7

% change 0.9 2.8 6.6 9.4 13.2 9.4 10.4 13.2 17.0 19.8

Fibrinogen (mg/dL) 383 387 390 380 389 394 426 411 435 422 420

% change 1.0 1.8 -0.8 1.6 2.9 11.2 7.3 13.6 10.2 9.7

Table 2. In vitro heparin sensitivity of aPTT measurement by ACL9000

Heparin (IU/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

aPTT(sec) 34.1 37.0 49.8 68.3 84.7 106.2 >110

하여 4시간 내에 검사하였다.

3. 평가 항목 1) 정밀도 평가

ACL9000의 PT, aPTT, 섬유소원 검사의 정밀도를 평 가하기 위해 정상혼주혈장, 비정상혼주혈장, 정상정도관리 물질, 비정상정도관리물질 level I 및 II(IL, Lexington, MA)를 이용하였다.

검사차례내(within-run) 정밀도는 20회 반복 측정으로 구하였다. 검사차례간(between- run) 정밀도는 오전 오후 2회, 정상정도관리물질-비정상정도관리물질 level 1-정상혼 주혈장 - 비정상혼주혈장 순으로 각각 10번씩 2일간 반복 측정하였다. 일간(between-day) 정밀도는 14일간 2회 반 복 측정하여 구하였다.

2) PT, aPTT 및 섬유소원의 검사실 참고치 설정

건강한 성인 남녀 각 30명씩 총 60명의 혈장으로 PT, aPTT, 섬유소원의 정상참고범위를 구하였다. 측정치의 하 한 2.5%와 상한 2.5%를 제외한 값으로 참고범위를 정하 였으며, Microsoft Excel 프로그램을 사용하였다.

3) 헤파린에 대한 aPTT 의 민감도

헤파린 농도 범위가 0-1 IU/mL(0.1 IU/mL 간격)가 되도록 정상혼주혈장에 헤파린을 첨가한 후 각 농도에서

aPTT를 4회 반복 측정하여 평균을 구하였다.

4) PT와 섬유소원 측정시 헤파린의 영향

PT와 섬유소원 측정시 헤파린에 영향을 받는지를 평가 하기 위해 헤파린 농도 범위가 0-1 IU/mL(0.1 IU/mL 간격)가 되도록 정상혼주혈장에 헤파린을 첨가한 후 각 농 도에서 PT와 섬유소원을 4회 반복 측정하여 증감을 %로 환산하였다.

5) 시약 안정성 평가

제조사에서 추천하는 대로 ACL9000 기기 내에 시약을 장착하여 사용하여도 시약이 5일간 안정한지를 평가하기 위 하여, 시약을 기기에 장착한 상태에서 정상혼주혈장과 비정 상혼주혈장을 5일간 2회 반복 측정하였다.

6) MLA Electra 1600과의 상관성 비교

PT, aPTT 및 섬유소원 검사가 의뢰된 검체 중 정상과 비정상 결과가 고루 포함되도록 50 검체를 선별하여 ACL9000과 MLA Electra 1600에서 동시 측정하였다.

결 과 1. 정밀도

정밀도는 대부분 변이계수(CV) 5% 이내의 양호한 결과

Fig. 1. Correlation of prothrombin time(PT) values between ACL9000 and MLA Electra 1600 y = 0.5491x + 6.0403

R

= 0.8852

0 5 10 15 20 25 30 35

0 10 20 30 40 50

PT(sec;MLA1600)

P T (s e c ;A C L 9 0 0 0 )

Fig. 2. Correlation of fibrinogen values between ACL9000 and MLA Electra 1600.

y = 1.7668x - 72.62 R

= 0.9438

0 200 400 600 800 1000

0 200 400 600

Fibrinogen(m g/dL;MLA 1600) F ib ri n o g e n (m g /d L ;A C L 9 0 0 0 )

를 보였으나, 정상혼주혈장을 사용하여 평가한 aPTT와 섬 유소원은 변이계수 5% 이상의 검사차례간 정밀도를 보였다 (Table 1).

2. PT, aPTT 및 섬유소원의 검사실 참고치 설정 정상인 60명을 대상으로 측정한 참고치는 PT 10.7- 12.4초, 71-109%, aPTT 28.7-40.8초와 섬유소원 165- 468 mg/dL이었다.

3. 헤파린에 대한 aPTT 의 민감도

치료범위로 간주되는 헤파린 농도 0.2-0.4 IU/mL의 범 위일 때 aPTT는 49.8초에서 84.7초로 측정되었다(Table 2).

4. PT와 섬유소원 측정시 헤파린의 영향

PT와 섬유소원 측정시 헤파린의 영향을 알아본 결과 PT 의 경우 헤파린 농도 0.2 IU/mL까지 변이계수 5% 이내 의 변화를 보였고, 0.4 IU/mL까지 변이계수 10% 이내의 변화를 보였다. 섬유소원의 경우 헤파린 농도 0.5 IU/mL

까지 변이계수 5% 이내의 변화를 보였다(Table 3).

5. 시약 안정성의 평가

5일간 시약을 기기에 장착 후 사용하여도 PT, aPTT 및 섬유소원 측정값은 변이계수 5% 이하의 변화를 보였다 (Table 4).

6. ACL9000과 MLA Electra 1600의 상관성 비교 PT와 섬유소원 측정에서는 좋은 상관성을 보였으나 (Fig. 1, 2), aPTT 측정의 상관성이 좋지 않았으며, 특히 결과값이 연장된(40초 이상) 경우 더욱 좋지 않았다(Fig.

3A, 3B, 3C).

고 찰

최근에는 혈액응고자동분석기는 검체 분주부터 시약의

잔량까지 자동 측정되는 완전 자동화된 장비들이 많이 소개

되고 있다. 이들 기기들은 photo-optical 법을 이용한 것

으로 가용성의 섬유소원이 녹지않는 섬유소가 될 때 light

Fig. 3A. Correlation of activated partial thromboplastin time(aPTT) values between ACL9000 and MLA Electra 1600(all samples).

Fig. 3B. Correlation of activated partial thromboplastin time(aPTT) values between ACL9000 and MLA Electra 1600: samples which show aPTT shorter than 40 sec in MLA1600.

Fig. 3C. Correlation of activated partial thromboplastin time(aPTT) values between ACL9000 and MLA Electra 1600: samples which show aPTT longer than 40 sec in MLA1600.

y = 0.4626x + 25.209 R

= 0.2215

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80

aPTT(sec;MLA1600)

aPTT(sec;ACL9000)

y = 1.884x - 22.693 R

= 0.5328

0 20 40 60 80 100

0 10 20 30 40 50

aPTT(sec;MLA1600)

aPTT(sec;ACL9000)

scattering이 증가하는 것을 측정하는 것으로 응고 검사의 재현성은 이전의 electromechanical coagulyzer에 비해 더욱 정밀한 것으로 보고되어 있다[5].

현재 개발된 대부분의 기기는 응고 검사뿐만 아니라 비

색분석이나 면역분석의 다양한 검사 방법이 가능하다. 또한 데이터 관리을 위한 컴퓨터 프로그램이 다양하게 제공되는 기기가 많아 정도관리나 시약관리에 유용하다.

새로운 혈액응고자동분석기의 도입을 고려할 때는 정밀

도 및 민감도 등의 기능적인 면을 평가하는 것이 필요하다.

특히 혈액응고분석기는 기기, 시약 등 여러 가지 요인에 의 해 결과값이 영향을 받으므로 기존 장비와의 상관성 및 참 고치의 설정도 매우 중요하고 기본적인 사항이다. 또한 반 응 쿠벳(reaction cuvette)의 특성, 시약의 사용 양, 시약 의 안정성 등의 검토하여 검사 비용 등의 경제적인 면을 고 려해야 한다. 또 전산화가 이루어진 검사실에서는 기존의 전산화 시스템에 쉽게 적용할 수 있는지의 고려도 필요하다.

저자들은 새로 소개된 ACL9000(Werfen Medical IL, Barcelona, Spain) 기기를 평가하기 위해, 가장 많이 의 뢰되는 기본적인 응고검사인 PT, aPTT 및 섬유소원 측정 의 정밀도, 검사실 참고치 설정, aPTT측정의 헤파린에 대 한 민감도, PT와 섬유소원 측정에 대한 헤파린의 영향 및 시약의 안정성을 알아보았다. 또한 기존 장비인 MLA electra 1600, 1400과의 상관성을 비교하고자 하였다.

PT, aPTT, 섬유소원에 대한 정밀도 평가에서 4-5 종의 평가 혈장을 사용한 결과 대부분 5% 이내의 우수한 결과를 보였으나, 정상혼주혈장을 사용한 aPTT의 검사차례간 정 밀도는 7.5%이었고 정상혼주혈장을 사용한 섬유소원의 검 사차례간 정밀도는 9.4%로 약간 높게 나타났다. NCCLS 에서는 PT, aPTT 검사는 변이계수 5% 미만을, 섬유소원 검사는 저농도 물질을 사용했을 때 변이계수가 7% 미만일 것을 권장하고 있다[6,7].

aPTT의 연장에 필요한 헤파린 농도가 사용하는 시약의 민감도에 따라 차이가 있으므로, 헤파린에 대한 aPTT의 민감도는 헤파린 치료 환자의 투여량을 설정하기 위해 각 검사실마다 기본적으로 평가되어야 할 항목이다[8]. 본 연 구에서는 치료범위로 간주되는 헤파린 농도 0.2-0.4 IU/mL 의 범위일 때 aPTT는 49.8초에서 84.7초로 측정되었다.

이는 정상인 60명을 대상으로 측정한 aPTT의 참고치 28.7-40.8초를 기준으로 상한치의 1.2-2.0배 연장된 결과 이다. 이는 통상적으로 선택하는 헤파린의 적정 치료 범위 인 정상평균값의 1.5-2.5배 연장과 비슷한 값이었다. 다른 문헌에 의하면 저자들 같이 정상 혈장에 일정 농도가 되도 록 헤파린을 in vitro로 첨가하여 헤파린 민감도를 구하는 것은 측정되는 치료 범위의 aPTT가 일반적으로 약간 높으 나, 평가법이 간단하므로 검사실에서 이용하기 적당한 방법 이라 하였다[6].

헤파린 투여가 PT와 섬유소원에 미치는 영향을 평가하 기 위해, 헤파린 농도가 0-1 IU/mL 농도에서의 결과치 증 감을 알아보았다. PT 측정의 경우 헤파린 농도 0.2 IU/mL 까지 변이계수 5% 이내의 변화를 보였고, 0.4 IU/mL까 지 변이계수 10% 이내의 변화를 보였다. 섬유소원의 경우 헤파린 농도 0.5 IU/mL까지 변이계수 5% 이내의 변화를 보였다. 따라서 치료 농도 이상의 헤파린 투여 환자의 PT 와 섬유소원 측정시 헤파린에 의해 결과값이 영향을 받을 수 있음을 주의해야 하겠다.

시약 안정성의 평가에서는 5일간 시약을 기기에 장착 후 사용하여도 PT, aPTT 및 섬유소원 측정에 별다른 영향이 없음을 확인 할 수 있었다.

ACL9000과 MLA Electra 1600의 상관성 비교 시험 에서는 PT는 연장된 비정상 범위에서 기존의 장비의 결과 치에 비해 낮은 경향이 있었으나 상관성은 좋았다. 섬유소 원도 상관성은 좋았으나, 고농도에서 기존의 장비로 측정한 결과보다 높은 경향이 있었다. 이는 두 장비의 섬유소원 측 정방법의 차이 때문으로 생각된다. ACL9000에서 이용하 고 있는 PT 유도법은 기존의 트롬빈에 의한 응고법인 Clauss 법[9]과 달리 PT를 측정할 때 섬유소원 농도에 따 라 응괴 형성 전후의 흡광도 변화율의 차이를 이용한 방법 으로 별도의 섬유소원 측정 시약 없이 PT 측정 시 동시에 측정하는 간편하고 경제적인 방법이다. 하지만 측정치가 매 우 높거나 낮은 경우 다소 부정확한 것으로 보고되어 있다 [10]. 따라서 섬유소원이 높은 경우 필요하다면 섬유소원 직접측정법으로 재검이 필요할 수도 있겠다. aPTT 의 경 우 일부 검체에서 기존 장비와 결과치가 산발적으로 차이가 나는 경우가 있어 만족할 만한 상관성을 얻지 못했다. 기존 장비로 측정한 결과 40초를 기준으로 두 군으로 나누어 상 관성을 비교해 보면 검사 값이 연장된 경우 상관성이 더 좋 지 않았는데 그 변화가 일관성이 없으므로 검체 상태의 보 관이나 측정 가능 범위의 차이는 아닌 것으로 생각된다. 결 론을 내리기에는 추가적인 자료가 필요하겠지만 검사상의 무작위 오류(random error)를 방지하기 위해 aPTT 측정 시는 delta/panic 시스템 및 환자의 임상정보를 활용하는 것이 필요하리라 생각된다.

ACL9000은 데이터 관리를 위한 컴퓨터 프로그램이 다 양하게 제공되고 있어 환자의 결과값 관리, 정도관리 및 시 약관리에 유용하게 사용할 수 있어 편리하였다. 특히 반응 곡선이 저장되므로 응괴(clot)에 의한 비정상적 연장을 쉽 게 판단할 수 있었다. 또한 표준화된 판정규칙을 적용하는 반사 검사(reflex test)를 이용하여 비정상 및 예상치 못한 검사 결과를 평가하며 정확한 결과보고에 도움이 되었다.

다만 결과 값의 uproad가 검체 단위가 아닌 항목 단위로 되어 있어 turn around time(TAT)이 연장되는 단점이 있었다. 따라서 stat mode가 가능한 장비였지만 응급 검사 용으로 사용하기에는 불편하였다. 또한 batch test의 경우 에도 한 종목의 검사를 완료하고 다음 항목의 검사를 시행 하는 방식이어서 TAT가 연장되므로 검사 실시 방식과 전 산적인 보완이 필요할 것으로 생각되었다.

요 약

배경：기본적인 응고 검사인 prothrombin time(PT),

activated partial thromboplastin time(aPTT) 및 섬

유소원 항목에 대해 새로 소개된 ACL9000 기기를 평가하

였다.

방법：각 항목의 정밀도 평가를 위해 검사차례내(within -run), 검사차례간(between-run) 및 일간(between-day) 정밀도를 구하였다. 정상인 60명을 대상으로 참고치를 구하 고, aPTT의 헤파린에 대한 민감도(heparin sensitivity) 와 PT와 섬유소원 측정시 헤파린의 영향을 알아보았다. 그 외에도 기존 장비인 MLA Electra 1600과의 상관성을 비 교하였다.

결과：정밀도는 대부분 상관계수 5% 이내의 양호한 결 과를 보였다. 참고치는 PT 10.7-12.4초, aPTT 28.7- 40.8초, 섬유소원 165-468 mg/dL이었다. 치료범위 헤파 린 농도(0.2-0.4 IU/mL)에서 aPTT는 49.8-84.7초이었 다. PT와 섬유소원 측정시 헤파린 농도가 높아지면 어느 정도 영향을 받았다. 기존장비 MLA Electra 1600와 상 관성 비교 결과 PT와 섬유소원 측정에서는 좋은 영향을 보 였으나, aPTT 측정의 상관성은 좋지 않았다.

결론：ACL9000의 기능은 대부분 만족할 만 했으며, 통 상적인 혈액응고 검사를 수행시 기존의 장비를 대체하기에 적당한 장비로 생각되었다.

참 고 문 헌

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Procedure for the determination of fibrinogen in plasma;

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National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1996.

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