서울의과학 연구소 • 서울임상병리검사센터 • 고려병원 임상병리과*

(1)

대한임상병리사회지 : 제 26 권 제 1 호

1994.

B형 간염바이러스 표면항원 양성 혈청에서 B형간염 바이러스의 e항원 및 DNA 측정에 관한 분석

서울의과학 연구소 • 서울임상병리검사센터 • 고려병원 임상병리과*

최철석·김은아·홍창식·이경옥·박창봉*

Kèy words : HBsAg, HBeAg, Hybridization with DNA probe, Polymerase chain reaction.

1 •

서 폰 counter로 측정한다. 이 방법에 의한 측정 감

도는

HBV

DNA 의 약

3

X 10⁴

에 서 3

X

10

⁵

copy 수에 해당하는 1 -- 10-

¹

pg 정도까지 측정할 수 있으나， 그 특이성이 다소 떨어지고 있다6) 그 러나 최근 유전자 1 개 copy 에 해당하는 량 (1 fg) 까지도 측정할 수 있는 고도의 감도와 특 이성을 지닌， 일명 중합효소 연쇄반웅 (PCR;

polymerase chain reaction) 법 이 개 발 되 어 HBV를 확진하고， 또 치료 경과를 관찰하는데 보다 유용하게 되었다.

본 저자들은 HBV 표면항원 (HBsAg) 의 혈청 학적 양성을 나타낸 혈청 검체를 대상으로 하 여 혈청학적 방법의 HBeAg 측정과， DNA probe 법 에 의 한 DNA 측 정 및 DNA poyme-

rase 측정을 하고 이에 대한 결과를 확인하기

위한 수단으로 PCR을 이용한 DNA 증폭을 시 도하여 그 결과를 분석하였다.

B형 간염 바이 러스 (hepatits B virus;HBV) 는 아직도 전세계적으로 중요한 보건학적 문제 의 하나로 남아있다. 특히 남부 아프리카나 동 남아시아 지역에서는 주민의 50 % 정도가 혈 청학적 항체 양성을 나타내고 있다 1) 우리 나 라도 다른 선진국의 감염 양성률 1--2 %에 비 하면 약 6% 로서 높은 감염률을 나타내고 있 는 실정이다1). B 형 간염을 진단하기 위하여 대 체로 혈청학적 측정법을 이용하여 질병의 진행 과정을 예측하고 있는데， 이 과정에서 확진을 하기에는 다소 문제점이 있었던 것도 사실이 다. 비록 B형 간염 바이러스를 측정하는 데 있 어 혈청학적 marker가 예민하고 편리한 방법 이라 할지라도 이것이 항상 바이러스의 활동성 을 의미하는 훌륭한 지표가 되지는 못한다2) 이런 관점에서 볼 때 바이러스의 DNA 라든가

DNA를 중합하는 DNA 중합효소 (DNA poly- II . 재료 및 방법 merase) 를 측정하는 것이 혈중의 바이러스 존

재를 나타내는 데 보다 정확한 신뢰성과 증거

1.

재료

를 줄 수 있다2-6)

DNA를 측정하기 위하여 현재 이용되고 있

1)

대상 검체

는 방법으로 혈청 중에 존재하는 HBV DNA를 의뢰된 임상혈청 검체 중 면역 혈청학적 방 추출하여 filter paper나 nylon membrane 에 옮 법 (radioimmunoassay; RIA) 에 서 HBsAg 양성 겨 고정한 후 특이한

:J:-JA

probe 로 hybridi- 으로 판명된 17 예를 선별하여 시험 대상으로 zation해 서 autora diography 혹은 scintilla tion 하였으며

,

이 과정 에 서 단지 HBsAb, HBcAb만

m ω

(2)

혈청학적 양성을 나타낸 검체는 대상에서 제외 하였다.

2) DNA probe hybridization법

DNA probe hybridization 법 에 의 한 HBV DNA 측정은 시판 kit(Abbott Laboratories

,

USA) 를 이용하였으며 1251 표지 probe를 DNA hy bridiza tion 에 이 용하였다.

3) DN A polymerase측정

DNA 합성 을 위 한 이igomer deoxynucleotides

는

poly(dA). poly(dT) 12-18(Pharmacia ,

USA) 를

사용하였으며 양성대조에 사용한 DNA 중합효

소는

T

4

DNA polymerase(Pharmacia ,

USA) 를

사용하였다.

본 시험에 대상으로한 검체 17 예 중 9 예만

DNA probe법에 의한 HBV DNA 측정올 하였 으며 측정 방법은 kit 내에 동봉된 안내서의 지시에 따라 수행하였다. 즉 간단하게 서술하 면 다음과 같다. 우선 주 실험에 들어가기 전 에 sepharose column을 수직 rack에 걸고 24

시간 정도 방치하여 column내에 충전되어 있 는 sepharose gel 이 완전히 충전되도록 하였다.

이어， 음성， 양성 및 검체 시험올 위해 멸균 된

1.

5 ml microfuge tube를 준비하고 각 용기 에 NaCl 완충액 100μl 넣은 후 음성， 양성대 조액 및 검체 혈청을 각각 100μl씩 넣었다.

희석된 각 반웅 용기에 바이러스 단백올 분 해 하기 위 하여 10 μl 단백 분해 효소( proteinase

K) 를 첨가하여 혼합하고 간단하게 micro-fuge

한 후 실온에 1 시간 동안 방치하였다. 방치후

4) 중합효소 연쇄반응의 oligonucleotides 20μ1 NaOH 완충액으로 실온에서 30분간 처리

primer 하여 바이러스 외부 단백질올 완전히 소화시켰

사용된 primer는 HBV genome 의 core 부분을 다. 용기 내의 용액중에 방출된 HBV DNA 에 암호화한 유전자8) 로 각각 1763 번과 2032 번 위 이 바이러스 DNA 에 특이한 l젠 표지 probe

치에서 시작되는 유전자， 5' - GCTTTGGGGC 70μl를 각 반웅 용기에 첨가한 후 65

⁰

C 에서

ATGGACATTGACCCGACTATAA-3 과 5 - 약 18 시 간 동안 방치 하여 hybri-dization 시 켰

CTGACTACTAATTCCCTGGATGCTGGGTCT 다. 이 어 hybridization 된 반웅물을 sepharose -3 의 한쌍을 외측 primer(primer 1) 로 사용 column으로 분리 용출하여 용출액을 감마 하고 270 base pair를 증폭하도록 합성하여 사 counter로 10분동안 측정하였다.

용하였다. 또， 이에 대한 내측

primer (primer

2) 로서 1778 번 위치에서 시작되는 유전자， 5

- GACGAATTCCATTGACCCGTATAAAGA

ATT-3 ’와 2017 번 위치에서 시작되는 유천자，

5

’ -

A TGGG A TCCCTGG A TGCTGGGTCTTC CAAA-3 의 한쌍을 선 정 하고 258 base pair

증폭을 목표로 하였다.

2.

방법

1) HBeAg

측정

시험 대상으로 한 검체 17 예 중 9 예만 HBeAg을 통위 원소 면 역 분석 법 (radioimmun- oassay ;

RIA) 으로 측정하고 그 측정값에 따라

음성， weakly 양성， 양성으로 표시하였다.

2) DNA

probe 법

3)

HBV의

DN A polymerse

측정

시험 검체 100μl를 동량의 세포 용해 완충

액

(25 mM Tris-HCl, pH '7.5, 5 mM dithiothreitol , 50 mM KCI 50 % glycerol , 2.5

% Triton X -100) 으로 처리하여 세포 단백올 파괴 하였다. 0.5 ml micro tube 에 양성， 음성 대조 및 검체를 표시한 후 각 tube 에 template -pnmer 용액 [0.5% Triton X-100 , 50mM KC 1 , 0.5 % BSA , 1

μ1

poly(dA) -oligo(dT)

12-18J 를 50μl 씩 넣었다. 양성 대조에 2μl

T4 DNA polymerase(New England Biolab ,

England) 를 음성대조에는 증류수， 그리고 검체

용기에는 혈청 검체를 각각 5μl 씩 넣고 잘 혼

합한 후 얼음에 15 분간 방치하였다. 다음에 반

응 혼합액 [1M Tris- HCl

,

pH 7.5

,

10 mM

DTT

, 1.

0M MgCb

,

50 mM dNTP(ATP

,

CTP

,

(3)

GTP)

,

5 μ1 3H-TTP

(1

mci/m

l),

D.W. 58.5 μIJ 를 85μe 씩 넣고 혼합한 후 37

⁰

C 에서 1 시간 동안 반웅 시킨 다음 얼음에 10분간 정치하였 다.

반웅 검체 100 띠를 glass fiber filter(GFF) 에 spot하고 200 띠의 cold 10 % trichloroacetic acid/

O

.l

M sod. pyrophosphate(TCA

-5PP) 를 가하

여 polynucleotide를 침 전 시 켰 다. 이 어 cold 5

% TCA-5PP 용액으로 세척하고 다시 냉 알

콜로 세척하였다. GFF를 건조한 다음 liquid scintillation vial에 넣고 cocktail (PPO 5g , bis - M5P 0.5g

,

toluene 11 ml)을 넣고 scintilla- tion counter로 방사능을 측 정 하 였다.

4) 중합효소연쇄반응 (PCR) 에 의한 HBV DNA 측정

HBV DNA 추출은 일반적으로 실시되고 있

는 단백 분해효소( proteinase K) 처리 및 유기 용매에 의한 방법으로 추출하였다9)

(1)

1 차 PCR

사전에 제조하여 분주된 PCR 반웅 완충액

(1

0 mM Tris-HCI pH 8.8 ,

1.

5 mM MgCb , O.

1 % Triton X -100 , 10 pmole primer 1 , O.

2 mM dNTP

,

50 mM KCI) 에 음성대조에 증류

수， 양성대조에

HBV DNA

, 검체 용기에는 각

시험검체 DNA를 2μl 씩， 그리고 2.5 unit 의

Taq DNA polymerase를 각 반응 용기에 가하 고 최종 반웅액의 량은 20μl가 되도록 하였다.

반웅 용기를 thermal cycler로 옮기고 94

⁰

C 1

분간 denaturation

,

55 Oc 광1. 5 분간 annealing

,

72

⁰

C 3 분간 extension을 한 주기로 하여 전체 40 회 실시하였다.

(2) 2 차

PCR 반응 종료된 1 차 PCR 산물 중 음성을 나타낸 검체는 반응 산물 2μl를 1 차 PCR 에

사용 된 pnmer에 대 한 내 측

primer(primer 2)

를 사용하여 2 차 PCR을 하였다. 이 때 pnmer

를 제외한 모든 반응액 성분과 증폭 조건은

1

차 증폭과 같게 하였고 전체 증폭 회수는 30

회 실시하였다.

(3)

PCR산물 확인

최종 반웅이 종료된 반응액의 일부를 gel loading 완충액에 혼합하고 l μg/ml ethidium

bromide가 함유된 2 % agarose gel 상에서 전기 영동을 하였다. 전기 영동이 완료되면 자외선 투사기 (ultra violet transilluminator) 상에 서 원 하는 크기의 band 를 확인하였다.

III.

결 과

이번 조사에서는 측정된 HBeAg 의 결과는 9

예 중 3 예 (52， 53

,

55) 가 양성을， HBV DNA

probe는 51

,

52

,

54

,

59 의 4 예가 양성을 보였 다. 반면 이 들 9 예 중에 DNA polymerase는 1

예 (52) ， PCR은 3 예 (51 ， 52

,

55) 가 양성을 나 타냈다(표 1). PCR 측정은 양성 대조는 원하 는 크기의 DNA 단편이 증폭되었고 음성 대조

Table 1. Detection of HBeAg , HBV DNA probe , DNA polymerase and PCR in 17 HBsAg pos-

ltI

ve sera.

No. tested HBeAg HBV DNA probe DNA polymerase PCR

nu

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CU

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-2

3 4 5 6 7 8 9

U

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ε

S S

E E

S S

+ +

+w

+

+ + +

+w

+w +

+

ND ND

ND ND + +

ND ND

ND ND + +

ND ND

+w : weakly positive.

ND : assay not done.

-72 -

(4)

에는 DNA 증폭은 발견되지 않아 본 시험에서 는 외부 DNA 혼입은 인정되지 않았다(그림

1.

2). 또， 17 예의 PCR 대상 검체 중 1 차 PCR

에서 5 예가， 2 차 PCR 에서 3 예가 각각 증폭되 어 전체적으로 8 예 (47.9 %)가 양성을 보였다.

HBeAg를 사용하는데 이는 체내 감염된 바이 러스 활성 기전을 이해함에서 비롯된 것으로 생각된다2). HBeAg 이 과거에는 바이러스의 증 식 및 감염력과 밀접한 관계가 있는 것으로 생 각되어 왔었다. 그러나 일률적으로 생각하여 S3는 HBeAg

,

S4와 S9 는 HBV DNA probe 임상적 소견을 판단하는 것은 곤란하다 12 ， 13) 에서만 각각 양성을 나타내 서로 상반된 결과 HBeAg는 바이러스의 증식이 없어도 간세포 를 보였다. 반면， S5 는 PCR 에서도 양성을 나 유전자에 삽입된 HBV DNA 에 의해서 생성이 타내어 혈청내 DNA 가 존재함이 증병되었다. 가능할 수 있으므로 체내 바이러스 증식을 정

한편， 모든 방법에서 양성을 보인 겸 제는

S2

확하게 의미 한다고는 할 수 없으며 14 ， 15) 실제

뿐이였다. DNA polymerase와 PCR만 측정한 HBeAg 양성인 검체에서 HBV DNA가 검출되 나머지 S10--S17 까지의 8 검체는 두 방볍의 지 않았던 연구 보고도 있다 16) 이는 측정 방 결과가 100 % 일치하였다. 이 검체는 간 기능 법의 감도상에서 비롯된 것이 아니라 HBeAg

효소 활성치가 급격히 상승(자료 별도로 제시 에서 anti-HBeAb 까지의 혈청 전환기 동안은 되지 않음)된 것으로서 이는 체내 바이러스의 바이러스 간기 (intermitant) 로서 17) 이 기간 동 증식이 활발하게 이루어 지고 있음을 입증하여 안에 혈청내에 HBV DNA는 측정되지 않지만 여전히 HBeAg는 양성을 타나내는 것으로 알 려졌다. 따라서 HBeAg 의 역가나 임상 경과와 는 밀접한 상관 관계가 없는 것으로 보고되었 다. 한편， HBV 의 활성 지표로서 DNA poly-

간염의 진행 과정을 관찰하기 위한 수단으로 merase를 측정하여 판단하려는 시도도 15) 있어

HBsAg

,

anti - HBc 를 측정하여 사용하여 왔는 왔지만 방법상의 예민도가 문제가 제기되었다.

데 이는 실제 임상과 상당한 차이가 있는 것으 본 연구에서 대상으로한 17 예의 HBsAg 양 로 알려졌다. 이런 이유에서 또 다른 지표로 성 검체에 대해서 HBeAg 양성인 겸체는 3 예

주었다.

N. 고 찰

M l 2 3

270 bp

A

M 1 2 3

• 258 bp

B

Fig. 1 PCR amplification of hepatitis B virus DNA. PCR product was electrophoresed through 2 %

agarose gel and detedted by UV -transilluminator after staining with ethidium bromide.

A is result of first PCR products , 270 bp DNA fragment was amplified for positive of HBV DNA.

B is 2nd PCR products which shown 258 bp for positive of HBV DNA.

M; molecular marker

,

Lane 1 through 3; negative control

,

positive control

,

sample

,

respectively.

(5)

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Detection of Hepatitis B e Antigen and Hepatitis B Viral DNA in Sera of Hepatitis Surface Antigen Positive

Choi, C. S., Kim, U. A;, Hong, C. S., ^Lee, K. 0., Park, C. P.*

Seoul Medical Science Institute, Seoul Clinical Laboratory Dept. of Clinical Pathology, Korea Hospital, Seoul Korea.*

ABSTRACT were HBeAg positive but DNA probe-results was negative. And the other was HBeAg Sera from 17 patients with hepatitis B sur- negative, however DNA was positive in probe face antigen(HBsAg) positive were tested for or PCR. And all 5 was DNA polymerase hepatitis B e antigen(HBeAg) by radioimmu- negative. Four(44.4) of 9 were hepatitis B e noassay, hepatitis B virus(HBV) DNA by antigen negative. Of these, one was DNA hibridization with DNA probe. and polymerase positive both DNA probe, polymerase and chian reaction(PCR) method, and hepatitis B PCR method. However three were shown the virus DNA polymerase. In this study there negative results in all method. Eight of 17 were considerable discordance among their samples were tested for DNA polymerase and results in 5(55.6

^%)

of 9 samples which were PCR without the test for HBeAg and HBV hepatitis surface antigen positive. Of 5, two DNA probe. These results showed 100 % cor-

-74-

(6)

relation each other. Conclusively as above our by PCR should be useful method for the di- rusults, serological test with amplified DNA agnosis of hepatitis B virus infection.

REFERENCES

1. Murray RP, Kobayashi GS, Pfaller MA, Resenthal KS : Hepatitis B viruses. p 702 -718. Medical microbiology 2nd ed., Mosby- Year Book, Inc., London, 1994.

2. Bonino F, Hoyer B, Nelson J, Engle R, Verme G, Gerin J : Hepatitis B virus DNA in the sera of HBsAg carrier : A marker of active hepatitis B virus replica- tion in the liver. Hepatology 1 : 386-391, 1981.

3. Brechot C, Pourcel C, Hadchoure M, Dejean A, Louise A, Scotto J, Tiollais P : State of hepatitis B virus DNA in liver disease. Hepatology 2 :·27s-34s, 1982.

4. Liberman HM, Labrecque DR, Kew MC, Hadziyannis SJ, Shafritz DA : Detection of hepatitis B virus DNA directly in human serum a simplified molecular hyb- ridization test : Comparison to HBeAg/

anti- HBe status m HBsAg earner.

Hepatology 3: 285-291, 1983.

5. Scotto J, Hadchouel M, · Hery C, Yvart J, Tiollais P : Detection of hepatitis B virus DNA in serum by a simple spot hybridi- zation technique : comparison with results for other viral marker. Hepatology 3 : 271-284, 1983.

6. Shih LN, Sheu JC, Wang JT, Hung GT : Detection of hepatitis B viral DNA by polymerase chain reaction in patients with hepatitis B surface antigen. J Med Virol 30 : 159-162. 1990.

7. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, et a! : Primer-directed enzymatic am- plification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 : 487-491, 1988.

8. Kaneko S, Feinstone SM, Miller RH : Rapid and sensitive method for the detec- tion of serum hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction tech- nique. J clin Microbial : 1 930-193, 1989.

9. ~ ~ ~, ~ ~ C}, C 1 ~ ~ : ~ AJ 7}~ ~ oJ1 -"l

~~~~~:}]l ~%g_

⁰

1%~ ~~if ~B-

9.1 Jia 7}. ~ ~ n1 ).~ ~~~ A-1 28(5) : 381- 389, 1993.

10. Hoofnagle J'H, Duseiko GM, et al : Seroconversion from hepatitis B e antigen to antibody in chronic type B hepatitis.

Ann Intern Med 94 : 744-748, 1981.

11. Fattovich SV, Rugge M, et al : Clinical, virologic and histologic outcome fallowing seroconversion from HBeAg to anti- HBe in chronic hepatitis B. Hepatol 4 : 1052 (abstract), 1984.

12. Shikada T, Karasawa T, Abe TK : Hepa- titis B e antigen infectivity of hepatitis B virus. J infect Dis 136 : 571-576, 1977.

13. LaBrecque DR, Muhs TM, et a! :The risk of hepatitis B virus transmission from health care workers to patients in hospi- tal-setting- A prospective study. Hepa- tolo 6 : 205-208, 1986.

14. Alter HJ, Seeff LB, et a! : The infectivity of blood positive for e antigen and DNA polymerase after accidental needle stick exposure. N Engl J Med 295: 900-913, 1976.

15. Fagan EA, Williams R : Serological res- ponse to HBV infection. GUT 27 : 858- 867, 1986.

16. Scott JS, Pan PE, Pace RA, Scott TP,

Cooksley WG : The absence of hepatitis B

virus DNA in hepatitis B e antigen posi-

(7)