Oligonucleotide의 합성과 이용 <생명공학의 약학적 응용>

(1)

DNA

합성과 이용

S -

9

Oligonucleotide 의 합성과 이용

나 도 선

(한국과학기술원 유전공학센터

)

서 ^■론

O lig o n u c le o tid e

합성 방법은 이십년 전에 이 미 확립되었으나 그 과정이 매우 복잡하여 몇 년전만 해도 전 세계의 몇 군데의 실험실에서만 이 가능하였다

.111

또한 합성된

o lig o n u c le o tid e

의 이용 가치가 적어

D N A

합성은 유기 화학자

의 연구 목적에 국한되어 있었다

.

근래에는 유 전자 재조합 기술등 분자 생물학의 발달과 함 께 합성

olig o nu cle o tid e

는 생물학의 여러 연구 분야에 사용되고 있다

1*1.

합성

D N A

의 수요가 증가함에 따라 더 좋은 합성법에 대한 연구가

활발하게 진행되어

s o lid p hase

합성법이 확립

되었다

(3).

최근에는 자동화된 합성기에 의해 쉽

게 대량 생산할 수 있는 방법이 보편화되어 유 기 합성의 기초가 적은 분자 생물학자 등에 의 해 많이 사용되고 있다

^

합성

D N A

는 분자 생물학의 모든 분야의 연

구에 사용될 수 있으며 앞으로도 그 이용도는 더욱 증가할 것으로 전망된다

.

합성 기술의 발 달로 생리활성을 가진 인조 유전자를 제조하는 것이 가능해졌으며 또한 다른 방법으로는 어려 운 유 전 자 의 분리 와

clo nin g, site sp e c ific

m u tag e n e sis,

질병의 진단

,

유전자의 구조 및

기능의 연구등 수많은 분야의 연구에 이용되고 있다

u’s>.

본고에서는 현재 여러 군데 분자 생 물학 연구실에서 성공적으로 사용되고 있는 자

동 합성기에 의한

p h o s p h ite

합성법의 기초 이

론과 합성된

o lig o n u cle o tid e

의 정제법에 대하 여 간단히 서술하고 그 응용 방법에 대하여 논 하고자 한다

.

2 . Solid phase 합성 법

O lig o n u c le o tid e

의 합성에 있어 어려운 과정

은 합성에 사 용 되 는

p r o te c te d n u c le o tid e

와

n u cle o tid e d e r iv a tiz e d s u p p o r t

제 조 하

-Sf

정으로서 많은 시간과 정밀한 기술을 필요로 한 다

13’1".

요즈음에는 이러한 시료들이 여러 회사 들에 의해 대량 생산되어 시 판되 고 있으며 비 교적 싼 값에 공 급 되 고 있다

.

여기서는 이러한 시료로부터

p h o sp h ite

합성법에 의해

oligo nuc-

le o tid e

를 제조하는 과정을 고찰하고 여기서 얻

어지는

p r o te c te d o lig o n u c le o tid e

의

d e p ro te c -

tion

과정 및 정제 과정에 대하여 설명하고자한다

.

2 - 1 . 합성 주기

P h o s p h ite

합성법을 이용한

D N A

합성은

4

가 지의

d e o x y r ib o n u c le s id e - d e r iv a tiz e d s u p p o r t

및

4 7

}•只

1

의

d e o x y rib o n u c le o tid e m o n o m e r -!■

사용하여 간단하고 효과적인 반응 순서에 의해

n u cle o tid e m o n o m e r

를 순서대로 붙 이 고

d e -

p r o te c t io n

과 정제 과정을 거쳐 이루어진다

.

한

개의 염기를 붙 이 는 합성 주기는

d e tr ity la tio n ,

죽합반응

, ca ppin g,

산화반응 등 으로 구성되어

있다

(F ig . 1

참조

).

고상 합성법에서는 먼저

3 '

끝의

n u c le o tid e

를

s u p p o r t

에 붙여야 하며 현 재는 이것이 여러 회사들에 의해 제조 공급되 고 있 다

1*1.

합성을 시작하는 처음 순서는

d e p r o te c tio n

즉

5/ - 0 H p r o te c tin g g ro u p

인

dim ethoxy- tr ity l (D M T )

을 제거하는 과정이다

.

반응 용기 는

filt e r

가 달린 작은

c o lu m n

을 사 용 하 고 반응

후에는 과잉으로 존재하는 시료를

f ilt e r a t io n

에

의해 제거하고

s u p p o r t

는 적당한 용매로 씻어

내면

so lid s u p p o r t

에 고정된

p r o d u c t

만이 반 응 용기 안에 남게 된다

.

다음 순서는 축합 반 응이다

.

축합반응은

5 ' - 0 H

가

D M T

기로 보호 되고 염기의

N H 2

기가 보호된

p h o s p h o r a m id ite

를 사용하여

s u p p o r t

에 붙은

n u c le o tid e

의

5 '

(2)

S - 10

나 도 선

F ig . 1.

DNA

힙성주기

- O H

에 두번째

n u c le o tid e

를 붙이는 반 응 이다

.

다음 순서는

c a p p in g

과정이다

. P h o s p h o r a m i-

d ite

를 이용한 축합 반응은

9 6 - 9 8 %

의 수율을

보 이 므로 반응이 안된

2 - 4 %

의

Y - 0 H

에

ace

tyl

기를 붙여서 다음 반응 주기에 여기에

n u c l

eo tid e

가 반응하여

o lig o n u cle o tid e

의 염기 서 열이 달라지는 것을 방지한다

.

마지막 순서는 산화반응이며

n ucleotide

의

p ho sph ite

기를

p h o s p h a te

로 산화시키는 과정이다

.

이렇게하여

한 개의

n u c le o tid e

를 연결시키는 반응이 끝나

며 이 합성 주기는 해당된 서열의

oligonucleo

tide

가 생성될 때까지 계속된다

.

자동 합성기를 이용하면 매 합성 주기당 약

15

분이 소요되므

로

4 0 - m e r

를 합성하기 위해서는 약

10

시간 정

도가 걸린다

.

반응 조건등 더 자 세 한 합성 과 정은 여러 논문들을 참조하면 된다내

’3， 7， 8， '

2 — 2 . D e p r o te c tio n 과 정제

합성 과정에서는 반응에 이용되지 않는 모든

fu n c tio n a l g r o u p

은 부 반응을 줄이기 위해 보

호되므로 반응이 완성된 후에는 이 보호기들을 제거하고 또한

O lig o n u cle o tid e

를

s o lid supp -

o r t

로부터 떼어 내어야 한다

. F ig . 2

에 예시된

바와 같이 먼저

m ethyl g r o u p

들을 제거하고

(3)

DNA

합성과 이용

S - l l

p ro te c te d o lig o n u c le o tid e

를

s u p p o r t

에서 메 어 낸 다음

base

의

p r o te c tin g g r o u p

을 제거 한다

.

마지막으로

D M T

기를 제거하여

5 '- 0 H

인

o lig o n u c le o tid e

를 얻는다내

-' D e p r o te c tio n

이 끝나면 중간에 합성이 중단된 작은 o l i g o n -

u c le o tid e

들로부터 완전한 길이의

oligo nucleo- tid e

를 분리한다

. O lig o n u cle o tid e

의 분리는

p o ly a c ry la m id e gel

전기 영동법으로

7M u r e a

를 포함하는 丁

r is / H C l b u ffe r

를 사 용한 다

.

전

기 영동에 의한 분리가 끝나면

T L C p late

위에

놓고 U V lam p를 사용하여 D N A band들을 볼 수 있다

.

이

g e l

로 부터 원하는

b a n d

부분을 잘 라 내고

gel e lu tio n technique

에 의해

D N A

를

분리해 낸 다음

d e s a lt in g

하면 모든 과정이 끝

나게 된다

(10).

2 — 3 . O lig o n u c le o tid e 으 I C h a r a c te r iz a tio n O lig o n u c le o tid e

의 합성과 정제가 끝난 후에

는 염기 서열을 분석하여 원하는

D N A

가 만들

어졌는가를 확인한다

. S e q u e n c in g

은 합성된

o lig o m e r

의

7 - 0 H

에 〔

7 - 32P ) A T P

와

T 4Ki- n a s e

로 방사선 표식을 하여

w a n d e r in g spot

방법이나

M a x a m - G ilb e r t

방법에 의한다

. W a n d e r in g spo t

방법은

2 0 -

미아보다 작은

o lig o n u cle o tid e

를

sequ e ncin g

할 때 사용되는

반면(u， i2) Maxam-Gilbert 방법은 더 큰 oligo - m e r (

〜

40 0base)

까지도

s e q u e n c in g

할 수 있다

<13

，비

. W a n d e rin g s p o t

방법에서는

la b e l

된

o li

gonucleotide-1- snake venom p h o sp h o d ie ste - r a s e

로 부분적으로

d ig e s t

하고， 이것을

ce llu - lose a c e ta te p a p e r

를 사용하여

pH 3. 5

에서

전기 영동시켜 일차원 분리를 얻고

D E A E -

C e llu lo s e

상에서

h o m o c h ro m a to g ra p h y

에 의해 이차원의 분리를 얻는다

. S e q u e n c e

는 부분적 으로

d ig e s t

된

o lig o m e r

들의

m ob ility s h ift

로

부터 알아낼 수 있다

.

이 방법은

sequence

를

알아낼 뿐 아니라 합성 중에 생기는 불순물 도 알아낼 수 있는 잇점이 있다

. M a x a m - G ilb e rt

방법에서는

4

가지의 다른 염기에 특이성이 있 는 화학 반응을 이용하여 이 염기가 있는 부분

에서

D N A

를 부분적으로 잘라 주고

polyacryl-

am ide gel

전기 영동에 의해 크기 별로나눈 다

음

gel p a t t e r n

으로부터

s e q u e n c e

를 알아낸 다

.

이 방법은 가장 보편적으로 쓰 이 고 있다

.

3. 합성 DNA 의 응용 분야

O lig o n u c le o tid e

합성 기술의 발 전 은 원하는

sequ e nce

의

D N A

의 합성을 가능케 하여 분자

생물학 분야의 연구에 혁신을 가 져 왔 다

.

합성

D N A

는 분자 생물학의 모든 분야의 연구에 사

용 되 고 있으며 여기서는 현재 가장 많이 사 용 되고 있는 이용 방법에 대하여 기술 하고자 한 다

.

3 - 1 . H y b r id iz a tio n p ro b e

O lig o n u c le o tid e

는

c o m p le m e n ta r y sequen- c e

를 가지는

D N A

또는

R N A

와 적 당 한 조건하 에서

h y b r id iz e

하여 안정한

d u p le x

를 형성하며

,

이러한 성질을 이용하여

‘ s h o tg u n l i b r a r y ’

방 법으로 제조된

c - D N A

나 또 는

g e n o m ic D N A l i b r a r y

로 부터 원하는

c lo n e

을 찾 아 내 는

p r o b e

로 사 용 된 다 巧 다시 말하면

c - D N A

나

g e n o

m ic D N A

의 혼합물을

p la s m id

등의 벡터에 재

조 합 하 고

E . c o h

•에 주입시킨 다음 많은

clone

들 을

a g a r p late

상에 얻는다

.

이

c lo n e

들 을

n it r o c e llu lo se filte r

에

im m o b ilize

히•고

r a d io a c tiv e

한

o lig o n u c le o tid e p r o b e

와의

h y b r id iz a t io n

으 로 선 별 한 다

.

어떤

p r o te in

유전자의

D N A se- q u e n c e

가 알려져 있다면 이

s e q u e n c e

를 이용 하여 정확한

h y b r id iz a tio n p r o b e

를 합성할 수 있다

.

그 러 나 대부분의 경우에

D N A se q ue nc e

는 알려져 있지 않으며 이 때 에 는

p r o te in

의

am ino a c id s e q u e n c e

를 이용하여

h y b r id iz a tio n p r o b e

를 만든다

.

물론 아 미 노 산

se q u e nc e

로부터 이

p r o te in

은

code

하는

D N A se q u e nc e

을 정확하게 알아 내기는 어려우며 .따라서

hy-

b r id iz a tio n p ro b e

의

ho m o log y

가 낮아져서

p r o b e

의

s p e c if ic it y

가 떨어진다

.

이러한 문제점 을 극복하기 위하여

54-mer

인

oligonucleotide

를 사용하여

h y b r id iz a t io n

의 안 정 성 을 높 이 는

방법과

^ 1 7 - m e r

의 혼합을 사 용 하 는 방법 이

개 발 되 었 다

(17). W a lla c e

등에 의하면 적당한 온 도 에 서 는 완전하게

c o m p le m e n ta ry

인

sequen-

c e

를 가진

17-m e r

만이 안정하게

h y b r id iz e

하

고 single mismatch

가 있을 때 는

hybridization

(4)

s 12 나 도 선

Eight possible m RN A sequences

Eight possible gene sequences CC 5'

3' ACC TAC C T ^ GT드 C T ^ CC 5, Synthetlc DNA probe T T T (mixture of eight sequences)

F ig . 3.

M ixe d oligo nu cle otide p ro b e 9 \ sequence

결정 과정

이 일어나지 않 는 다

Fig. 3

에 예시된 바

와 같이 모든 가능한

codon

의 조합인

17-mer

의 혼합물을 사용하면 그 중 한개는 반드시 완 전하게

complementary

인

sequence

를 갖는다

.

혼합물인

17-mer

를 합성하기 위해서는 두가지

가능한

sequence

의

nucleotide

를 붙이는 단계 에서

mixture

를 사용하여 단 한번의 합 성 으 로 원하는

Pr0be

를 얻을수 있다(탸

3 - 2 . Primer

Oligonucleotide

는

DNA

나

RNA template

의

complementary sequence

와

hybridize

하 므로 이것은

primer

로 이용하여

complementary D- NA(c-DNA)

를

polimerase reaction

에 의하 여 합성할 수 있 다 이 러 한 성질은

DNA

나

RNA

를

sequencing

하는데 이용될 수 있으며

15 - 20 residue primer

를 사용하여

‘dideoxy chain termination’

방법으로

DNA

의 염기배열 을 알아 내는 기술은 이미 확립되어 널리 사용 되고 있다

(**

ᅵ

*4>.

이 밖에

, primer

는

clone

된 유 전자를 선별하는데 이용되고 있다

.

요약하여 말 하면

, primer

를 사용하여

mRNA

로부터

radio

active

한

c-DNA

를 합성하여 이것을

hybridi

zation probe

로 사용하여

clone

을 선 별 한 다

. Oligonucleotide

를

primer

로 사용할 때에도

hy

bridization probe

로 사용할 때와 마 찬 가 지 로

unique sequence

를 이용하거나 또는 가능한

co~

don

으로 만든 몇가지 혼합된

sequence

를 사용 하는 방법이 있다

^

ᅵ

* ' Unique sequence

를 사 용 하 는 방법은

mismatch

가

primer

의

3

ᄌ쪽 에 있거나 또는

primer sequence

의 결정이 잘

Trp Met Glu Gin Glu Gly Protein sequence 못 되 었

7

때는

p o ly m e r a s e

반응이 잘 일어나지

않는 반면 혼합된

sequence

를 사용하는 방법

은 이러한 결점을 보완할 수 있다

.

위와 같이

p r im e r

를 사용하여

m - R N A

로 부 터

hybridization probe

를 만드는 이외에

, m- RNA

로부터 만들어진

c-DNA

자체를

clo nin g

한 경우도 보고되었다

.

이 방법은 상당히 적은 비율로 존재하는

m-RNA

의

c-DNA

를

enrich

하여

cloning

을 효과적으로 수행하는데 쓰인다

. W inter

등은

oligonucleotide primer

를 사용하 여

h um an in flu e n z a v ir u s R N A

의 전체 유전 자를 가진

double s tr a n d D N A copy

를 만들어 서 클 로 닝 하 였 다

(27).

3 - 3 . D N A 으 | 구조와 기능의 연구

DNA

는 잘 알려진

Watson-Crick

의

B-form

구조 이외에

Z-form

구조나 또는

cruciform, slip structure

등의 이차 구조를 가질 수 있다

. DNA

의 세부 구조를 연구하는데 있어

X - ra y c r y s ta llo g r a p h y

나

N M R s p e c tro s c o p y

둥은매 우 중요한 정보를 제공하며 여기에 쓰이는 다 량의

oligonucleotide

는 다른 방법으로는 얻기 어려우며 합성에 의해 제공될 수 있다

.

예를들 면

d(CGCGCG) sequence

를 가진

hexamer

의

single crystal

을

X-ray crystallography

로분 석함으로써

‘Z-DNA

’ 의 세부 구조를 알게 되 었으며(폐 d (C G C G A T A T C G C G ) sequence 의

crystal

로부터

‘B-DNA

’ 의 세부 구 조까지도 연구가 가능하게 되 었 다 에

.

또한

DNA

와

pro

tein

의

cocrystal

을 만들어서

protein

이

DNA

에

b in d

할 때의 세부 구조를

X - r a y c r y s ta ll - ography

로 연구하였다

(so>. NMR spectroscopy

나

(S1> Raman spectroscopy

13*)를 이용하여

D- NA

세 부구 조를 연구한 결과도 보고된 바 있다

. DNA세부 구조나 DNA-protein interaction을

연구하기 위해 위의 예와 같이 합성된

D N A

를

직접 이용하는 방법이외에 최근에는 이러한

oli

gonucleotide

를 적당한 벡터에 재조합하여

p l

asmid

내에서의 특정한

sequence

의 구조나

DNA - p ro te in in t e r a c t io n

을 연구할 수 있게 되었다

Wells

등은

d (GC) n sequence

를

plasmid

에 삽

입하여

plasmid

내에서의 이 부분의 세부 구조

A U G G A ^ C A ? C A_{^ A} _A 우 _A

AT G G A ^ C A ^ G A ^

A A A

TAC C T ^ GT^ ：^{C T ^}

(5)

D N A g l

성과 이용

S- 13

hoGATCTGCAoh

—

-TCTAGp

_An

PG — i

hq

A C G T C —

oGATCTGCAG- -TCTAGp hoACGTC-

DNA ligase

-AGATCTGCAG- -TCTAGACGTC-

-AGATCTGCAG — -TCTAGACGTC —

F ig . 4.

O cta m er^} ad ap to r9\ 이용으로

제한효소

B g l

II M G/4「CT; 오느

Pst

I

(CTGCAG) Site

을 재생하는 과정

와 구조의 변화에 따른

DNA-enzyme

의

inter- action

에 대하여 연구하였다

(33， 34).

그들은

two d im e n sio n al gel

분석법으로

d (G C ) i« sequence

가

supercoil

형태의

plasmid

내에서

‘Z-DNA’

구조를 가지는 것을 관찰하였으며 또한

Hha I m e th y la s e

를 이용하여 이

enzym e

이

B - form DNA

와 반응하나

Z-form DNA

와는 반응하지 않는 것을 관찰하였다

. Nordheim

등은

Z-DNA

를

a n tig e n

으로 하여

a n tib o d y

를 만들고 이

an — tib o d y

와

p la s m id

내의

Z - D N A

또는

B - D N A

구조와의

interaction

을 연구하였다

(35>.

이와같 이 합성된

DNA

를

plasmid

에 재조합하여 그 부 분의 구조나 또는 구조와

gene regulation

의 상관관계를 연구하는 방법은

c r u c if o r m

이나

slip structure

등의 이차 구조와 그 특성을 연 구 하 는데 사용될 수 있다

.

3 - 4 . L in k e r , A d a p to r, C o n n e c to r L in k e r , a d a p to r, c o n n e c to r

는 약

10 — 15re-

sidue 의 oligonucleotide 이며 유전자 재조합의 효율을 높이고 조작을 편리하게 하는데 많이 사 용되고 있다

. L in k e r

의 역할은

c io n p

하고자 하

는

DNA fragment

의 양 끝 을 벡터에 연결할수 있는

cohesive end

로 만들어 줌으로써

ligation

효율을 증 대시 키고 후에 이

fragment

를 다른 벡터에 옮기고자 할 때 편리한 제 한 효 소 절단부 위를 제공하는데 있다

.

따라서 과량의

linker

와

clo ne

하려는

b lu n t en d D N A fr a g m e n t

와 반응시키고 제한효소 반응을 거치면 원하는

ter- mini

를 갖는

DNA fragment

를 만들 수 있다 ( 세

Adaptor

는 제한 효소의

cohesive end sequence

를 가지며

Fig. 4

에서 보듯이

3" (

혹 은

5 ') - protruding end

를

5 x

(혹 은

3 ) — pro

truding end

로 바꾸거나， 끝이 맞지 않는

co- hesive end

간의 연결 및 제 한 효소 부 위 를 재생 하는데 쓰 인다

. Fig. 4

는

Bgl I I

와

Pst I

의

cohesive end sequence

로 구 성 된

adaptor -1'

이용하여

Pst I site

과

Bgl II site

을 재생시 킨 예 이 다

(M>. C o n n e c t o r

는 두가지

a d a p to r

의 사 용으로 끝이 맞지 않는

cohesive end

를 가진

D N A fr a g m e n t

를 연결함과 동시에 제

3

의 제한 효소 부위를 만드는 경우를 말한다

.

예를들면

F i g . 5

와 같이 두개의

d e c a m e r

의 사 용 으로

EcoR I site

과

Sal I site

을 재생시키고

Sma

I site

을 삽 입 하 였 다

(39).

3 - 5.

인조 유전자의 합성

합성

DNA

를 이용하여 전체 유전자를 구 성 하

는 기술은

Khorarm

등에 의해 처 음 으로 개발되 어

tRNA gene

이 제 조 되 었 다 네

DNA

합성 기 술의 발달로

oligonucleotide

의 합성이 비교적 쉬워짐에 따라 현재는 수 백

base p a ir

를 가진

duplex DNA

의 제조가 가능하다

.

우선 적당한 크기의

oligomer

들 을 합성하 고 이것들을

T4ki-

_c oh

-CTTAAp

EcoRl

terminus

pAATTCCCGGGo

oGGGCCCAGCTp

pTCGAC-

ho

G - Sall

terminus

j

DNA ligase

Smal

site -GAATTCCCGGGTCGAC -CTTAAGGGCCCAGCTG

丰 * * ,* * * 本 * * * *

■EojRI site

Sail

site

Fig. 5. 이

ig o n u d eo tid e

^를 connector 로_

이용하는

바bH

a t=i

(6)

S 14

나 도 선

EcoR I Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Pbe Thr Ser Cys Stop Stop BamH I

구

— |

A A T T C A T G G C T G G T T G T A A G A A C T T C T T T T G G A A G A C T T T C A C T T C G T G T T G A T A G

^ ^ G T A C C G A C C A A C A T T C T T G A A G A A A A C C T T C T G A A A G T G A A G C A C A A C T A T C C T A G

(a) 3 © ® ® ^

5' _________ ®_____________________ g __________ ^③ r

A A T T C A T G G C T G G T T G T A A G A A C T T C T T T T G G A A G A C T T T C A C T T C G T G T T G A T A G

r G T A C C G A C C A A C A T T C T T G A A G A A A A C C T T C T G A A A G T G A A G C A C A A C T A T C C T A G ,

(b) EcoR I ④ ⑤ ⑥

5' I I .'55 - mor 3'

G G A A T T C A T G G C T G G T T G T A A G A A C T T C T T T T G G A

G A A G A A A A C C T T C T G A A A G T G A A G C A C A A C T A T C

(c) 3--- 5'

F ig . 6.

S'oma?ᄋs?a?/>7 유전자의 합성 전략

n a s e

와

T 4 D N A lig a s e

의 사용으로 조합시 킨 다

.

이렇게 제조된

duplex D N A

는 벡터

D N A

와 재조합시켜 클로닝한다

(41>. F ig . 6

는

p e p tid e hor- m o n e

인

s o m a to s ta tin

유전자의 합성 전략을 보여 주고 있다

.

예시된 바와 같이 몇 가지의 다른 방법을 사 용 할 수 있으며

(a)

에서는

8

개의

o li

g o m e r

가 필요하나

(b)

에서는

6

개만이 필요하 다

. (c)

에서는 두 개의

3 5 - m e r

와

D N A p o ly

m e r a s e I

을 사용하여 이 유전자를 제조할 수

있음을 보여 주고 있다

.

현재까지는

(a)

나

(b)

의 방법이 많이 쓰여졌으나 합성법의 발달로

35 - m e r

의 합성 수율이 좋아짐에 따라

(c)

의 방

법도 앞으로 많이 쓰여질 것으로 전망된다

.

위 와 같이 합성 유전자의 도입으로 현재까지 여러 가지 생리활성 물질이 발현 생산되었는데 예를 들면

h u m an insulin*42! hum an g ro w th horm o- n e (43), h um an leukocyte in t e r f e r o n (44)

등이다

.

생리활성 물질의 유전자를 합성하고

c lo n in g

하

여 발 현시키는 외에도 합성 유전자는 분자생물 학 연구에 유용하게 쓰여지고 있다

.

그 한 가지 예로서 여러가지 다른

co/i' p r o m o te r seq - u ence

를 합성하여 이

p ro m o te r

들과

R N A p o ly m e r a s e

와의

in t e r a c t io n

을 연구한 것을 들 수 있 다

(4S， 46).

3 — 6 . S i t e s p e c i f i c m u ta g e n e s is

유전자의 구조와 그 기능은

m u t a n t

를 이용하

여 연구할 수 있다

.

이 때에는 먼저 홍 미 있 는 유 전자를

c lo n e

하고 여기에

single b a s e muta-

t io n

을 도입하여 기능의 변화를 조사함으로써

그_

유전자의 기능을 알아낸다

.

특정한

site

에

m u ta tio n

을 도입하는 방법은 여러가지가 있으

나 대별하여

o lig o n u c le o tid e

를 이용하는 방법 과

(47， 48) c h e m ic a l

을 이용하는 방 법 의 네 삐 두 가

지로 나눌 수 있다

.

합성

D N A

를 이용하는 방

법은 원하는 위치에 정확하게

m u ta tio n

을 얻을

수 있는 잇점이 있으며

ta rg e t a r e a

의

s e q u - e n c e

를 알고 적은 수의

m u ta tio n

을 얻고자 할

때에 많이 쓰인다

.

그 방법은

F ig . 7

에서 보는

바와 같이

D N A s e I

과

ex onuclease

를 써서

sin gle s tr a n d tem plate

를만든 다음 여기에

s i - ngle base m is m a tc h

가 있는

o lig o m e r

를

p ri- m e r

로 사용하여

h e te ro d u p le x

를 얻는다

.

이것 을

_E.co/i

•에

tr a n s fo r m

하면

m ism a tc h

부분에 서 원래의

D N A

가 생기거나 또는

m u tatio n

이 일어나게 되는데 이것을 선별하면 된다

.

선별방 법은

p he no typic sele ctio n

이나 혹은

p r im e r

로 사용된

o lig o m e r

를

p r o b e

로 사용하여

hybridi- z a tio n

방법으로 한다

. S in g le s tr a n d tem plate

를 만드는 다른 방법은

b a c te rio p h a g e M 13 cl-

F ig . 7.

합성

DNA

를 이용한

site-sp eccific m u ta

genesis.

(7)

DNA

합성과 이용

S -

15

oning vector*51)를 사용한다. M 13 system 을

사용하는 다른 잇점은

m u ta tio n

된

r e g io n

의 염 기 서열을

‘dideoxy chain te r m in a tio n ’

방법에

의해 쉽게 알아낼 수 있다는 점이며 이것은 또

한

m u tan t

의 선별에 이용되고 있다

.

현재까지

많은

m u ta n t

가 합성

D N A

와

M 1 3 s y s te m

을 이 용하여 만들어졌으며

single b a se tr a n s itio n , transversion, deletion, i n s e r t i o n 다른 종

류의

m u ta tio n

을 얻을 수 있다

(S2>.

3 - 7 . 질병의 진단

유전자에 일어 난 point mutation은 여 러 가지 유전병의 원인으로 알려져 있 다 예 를 들 면 sickel-cell a n e m ia

는

yff-globin g e n e

의 한 개

의 염기가 바뀜으로 일어난다. 이것은 6 번 째 의 아미노산기 의 adenine 이 thymine 으로 바뀜 에 의해 glutamic acid가 valine 으로 변이가 일 어나고 이로 인해 /9-globin의 구조가 달라지는 데 기인한다(54). Conner등은 oligonucleotide를 hybridization probe로 사용하여 sickel cell

anem ia

를 진단하는 방법을 개 발 하였다

(S5).

그

방법을 요약하면 다음과 같다. 유전자를 적당한 제한 효소로 절단한 후 DNA fragment를 ag

arose gel 에서 분리 하고 Southern DNA blo- t t in g tiJ

•법으로

n itro c e llu lo s e filte r p a p e r

에

옮기 거 나 또는 agarose gel 상에서 직 접 label 된 probe로 hybridization시 킨다(56， 57).

최근에는 hybridization prob e에 radioisotope 대신에 B io tin을 표식하는 방법이 개발되었다

(S8).

Radioactive label 을 사용하는 방법은 safety, handling, dispo sal등의 문제를 야기시키며 32P 의 radioactivity 가빨리 감소하므로 적은 양의 prob e를 매 번 만들어야 하는 단점이 있다

.

반 면， biotin label 된 probe는 32P label 보다 감 도가 높고

^

빨리 결과를 얻을 수 있으며 장기 간 보관할 수 있는 장점이 있다

.

B io tin label 된 probe를 hepatitis, h e rp e s등의 감염을 진단 하는데 사용하려고 하는 연구가 진행되고 있으 며 또한 sickle cell anem ia1601 卢-thalassem ia/61) 등의 유전병의 진단법이 개발되었다

.

Biotin lab e l된 p ro b e의 사용 범위는 앞으로 넓어질것 으로 보이며 아직은 비교적 값이 비싼 것이 단 점이다

.

4.

^결 ^론

자동 합성기의 보급과 합성에 사용되는 여러 가지 시료가 개발，시판됨에 따라 DNA 합성은 여러 분자생물학 연구실에서 쓰이는 보편적인 기술로 정착되고 있다. 합성 DNA는 생물학의 여러 분야의 연구에 있어서 없어서는 안 될 소

재가 되었으며 분자생물학의 발달과 함께 그

이용 범위는 점점 늘어날 것으로 전망된다. 본 고에서는 D N A 합성 법의 기초 이론과 합성된 D- NA의 응용 범위에 대하여 고찰하였다.

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