Modulation of arachidonic acid metabolism and inflammatory process in macrophages by different solvent fractions of Glasswort (Salicornia herbacea L.) extract

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©The Korean Society of Food Science and Technology

큰포식세포에서 퉁퉁마디 추출물의 아라키돈산 대사효소조절 및 항염증 활성

강스미¹·최유미¹·홍정일^1,*

1서울여자대학교 자연과학대학 식품응용시스템학부

Modulation of arachidonic acid metabolism and inflammatory process in macrophages by different solvent fractions of Glasswort

( Salicornia herbacea L.) extract

Smee Kang

¹

, YooMi Choi

¹

, and Jungil Hong

^1,

*

1

Division of Applied Food System, College of Natural Science, Seoul Women’s University

Abstract Glasswort has attracted an attention because of its interesting physiological actions. In this study, the effects of glasswort on inflammatory events including nitric oxide (NO) synthesis and arachidonic acid metabolism in cultured RAW264.7 macrophages were investigated. A series of solvent fractions, including fractions of hexane (Fr.H), ethyl ether (Fr.E), ethyl acetate, butanol, and water, were prepared from a 70% methanol extract of glasswort. Among the fractions, Fr.E showed the strongest inhibition of NO synthesis and inducible NO synthase (iNOS) expression in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated macrophages. At a concentration of 80 µg/mL, Fr.E decreased the NO and iNOS levels by 73 and 77%, respectively, after 24 h. Fr.E showed the most potent inhibitory effects on the expressions of cytosolic phospholipase A₂ and cyclooxygenase-2 with IC₅₀ values of 33.4 and 27.9 µg/mL, respectively. Fr.H and Fr.E also significantly inhibited 5- lipoxygenase expression in LPS-stimulated macrophages. These results suggest that the hydrophobic fractions of glasswort possess anti-inflammatory activities through modulating the arachidonic acid metabolism and NO synthesis.

Keywords: glasswort, macrophage, cyclooxygenase, lipoxygenase, phospholipase, nitric oxide

서 론

비정상적인 면역반응은 다양한 환경적, 유전적 요인에 의해 나 타나며 대표적인 형태로서 과도한 염증반응을 들 수 있다(Griven- nikov 등, 2010). 만성염증은 암, 동맥경화, 관절염, 비만에 이르 는 다양한 질병의 주요 원인으로, 이를 제어하기 위한 식품과 의 약품에 대한 연구가 지속적으로 이어지고 있다(Ferrucci와 Fabbri 2018; Hamminga 등, 2006; Macarthur 등, 2004).

해안의 염습지에 주로 서식하는 염생식물은 해홍나물, 나문재 등 16과 40여종이 알려져 있는데(Lim 등, 2007), 그 중 퉁퉁마디 ( 함초, Salicornia herbacea L.)는 명아줏과(Chenopodiaceae)에 속하 며 예로부터 음식 재료나 민간치료제로 이용되어 왔다(Shin 등, 2002). 퉁퉁마디의 줄기는 나물이나 샐러드로 먹기도 하고, 이를 이용한 천일염, 함초환, 함초즙 등의 가공식품이 국내에 유통되 고 있다. 또한 장기능 개선, 소화불량, 위장병, 신장병 및 당뇨병 등을 치료하기 위한 민간요법의 재료로써 이용되고 있다(Jo 등, 2002). 퉁퉁마디는 다량의 염분뿐만 아니라 마그네슘, 아이오딘, 포타슘 등 다양한 무기질을 함유하고 있으며(Cha 등, 2006), 고

농도의 염 스트레스를 이겨내기 위한 베타인 등의 기능성 물질 도 포함하고 있다(Lee 등, 2004a).

그람음성 세균의 지방질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 성분은 큰포식세포(macrophage)의 Toll-like receptor (TLR)를 자극하여 염 증 반응에 관여한다(Rossol 등 2011). LPS에 의한 자극은 큰포식 세포에서 유도 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 합성을 유도하고 이 효소에 의한 과도한 산화질소(NO)의 생성은 염증의 유발과 진행에 중요한 인자로 작용한다(Guzik 등, 2003; Nagy 등, 2007). 한편 고리산소화효소(cyclooxygenase, COX), 지방질산화효소(lipoxygenase, LOX), 포스포라이페이스 (phospholipase A

₂

, PLA

₂

) 등의 아라키돈산 대사와 관련된 효소들 이 염증반응에서 중요한 역할을 담당하고 있으며, 염증조절을 위 한 대표적인 타깃효소로 알려져 있다(González-Périz와 Clària, 2007; Ricciotti 와 FitzGerald, 2011; Leslie 2015). PLA

2

의 작용으 로 세포의 인지방질로부터 생성되는 아라키돈산은 COX, LOX 및 사이토크롬 P450 등에 의해 대사되며, 특히 COX에 의해 생 성되는 프로스타글란딘(prostaglandins)과, LOX에 의한 하이드록 시에이코사테라엔산(hydroxyeicosatetraenoic acids) 및 루코트라이 엔(leukotrienes)은 강력한 염증의 매개체로서뿐만 아니라 암세포 의 증식 및 성장, 전이 등에도 중요한 역할을 하는 것으로 보고 되었다(Greene 등, 2011; Williams 등, 1999).

선행 연구에 의하면 퉁퉁마디 분획이 산화방지 효과와 함께 LPS 에 의해 활성화된 큰포식세포에서 NO의 생성과 iNOS의 발 현을 억제하였으며(Lee 등, 2007), isorhamnetin 3-O-β-

D

-glucopyr- anoside 성분이 항염활성을 나타내는 주요 성분이라고 보고하였 다(Kim 등, 2009). 하지만 오히려 퉁퉁마디 성분이 인터루킨

*Corresponding author: Jungil Hong, Division of Applied Food Sys- tem, College of Natural Science, Seoul Women’s University, Seoul 01797, Korea

Tel: +82-2-970-5639 Fax: +82-2-970-5977 E-mail: [email protected]

Received September 13, 2018; revised October 14, 2018;

accepted October 30, 2018

(2)

(interleukin)-1 β, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α, 인터 페론(interferon)-γ 등의 염증성 사이토카인(cytokine)의 발현을 촉 진한다는 보고도 있다(Im 등, 2006). 따라서 퉁퉁마디의 면역조 절활성에 있어서 연구가 더 필요한 상태에 있으며, 특히 PLA

2

, COX 및 LOX 등을 포함한 일련의 아라키돈산 대사관련 효소들 에 미치는 영향에 대한 결과는 아직까지 보고된 바 없다. 본 연 구에서는 퉁퉁마디의 줄기를 극성이 다른 용매로 분획하여 헥세 인(hexane, Fr,H), 에테르(ether, Fr.E), 에틸아세테이트(ethyl acetate, Fr.EA), 뷰탄올(butanol, Fr.B), 물(water, Fr.W)의 총 5가지 분획을 제조하였고, LPS로 활성화된 큰포식세포에서 iNOS 발현 및 NO 생성에 미치는 영향과 아라키돈산 대사 효소 단백질인 cytosolic PLA

₂

(cPLA

₂

), COX-2, 5-LOX 의 발현 패턴에 미치는 영향을 체 계적으로 분석하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 퉁퉁마디 분획 제조

실험에 사용한 퉁퉁마디는 대신함초(Sinan, Korea)에서 구입하 였고, 추출과 분획물은 선행연구의 방법에 따라 제조하였다(Kang 과 Hong, 2016). 제조한 분획은 200 mg/mL로 다이메틸설폭사이 드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켜, −80

^o

C 초저온 냉동고 에 저장하여 사용하였다. Lipopolysaccharides

(

LPS) 와 N-1-naph- thylethylenediamine dihydrochloride (NED) 는 시그마알드리치(St Louis, MO, USA) 에서, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다. Extracellular signal-regulated kinase (ERK), glyceral- dehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 및 tubulin 1차 항 체는 Ab frontier (Seoul, Korea)에서, iNOS, cPLA

2

, COX-2, p- ERK 의 1차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 에서, 5-LOX 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 에서 구입하였다. 쥐의 큰포식세포 RAW264.7은 Amer- ican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) 에서 구입하였다

총 폴리페놀(polyphenol)과 플라보노이드 함량 측정

각 추출물의 총 폴리페놀(polyphenol) 함량은 폴린-데니스(Folin- Denis) 법을 변형하여 측정하였다(Swain과 Hillis, 1959). 각 추출물 시료 80 µL에 50% 폴린시오칼토 페놀(Folin-Ciocalteu’s phenol) 시 약 20 µL를 가한 후 상온에서 3분간 반응시켰다. 이 반응액에 2%

탄산소듐(Na

2

CO

₃

) 100 µL 를 첨가하여 상온에서 30분간 방치한 후, 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max M2; Molecular device, Sunnyvale, CA, USA) 를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 농도를 달리한 타닌산으로 표준곡선을 작성하여 시료 내 총 폴리페놀 함량을 계산하였다. 총 플라보노이드 함량측정을 위해 각 추출물 시료 50 µL에 5% 아질산소듐(NaNO

2

) 30 µL 를 가하여 5 분간 상온에 방치한 후, 60 µL의 염화알루미늄(AlCl

3

) 을 첨가하 여 6분간 반응시켰다. 이후 4% 수산화소듐(NaOH) 100 µL를 첨 가하여 11분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max M2) 를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다(Lee, 2009).

농도를 달리한 퀘세틴(quercetin)으로 표준곡선을 작성하여 총 플 라보노이드 함량을 계산하였다.

세포배양 및 세포성장 분석

RAW264.7 은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100 unit/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스트렙토마이신이 포함된 Dul-

becco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하여 37

^o

C, 95% 습도와 5%의 CO

2

가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 세포 성장 분석을 위하여 RAW264.7세포를 96-well plate에 8×10

⁴

이 되 게 분주하여 24시간 배양 후, 각 분획 시료를 24시간 처리하였 다. 이후 배양액을 0.5 mg/mL MTT가 함유된 배지 100 µL로 교 체하고 37

^o

C 에서 1시간 반응시켰다. 이후 배지를 제거하고 세포 내에 생성된 MTT 포마잔을 DMSO에 용해시켜 마이크로플레이 트 판독기(Spectra Max M2)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

아질산과 NO 제거활성 측정

아질산(nitrite)에 대한 화학적 제거활성은 Gray와 Dugan의 방 법(1975)을 변형하여 측정하였다. 시료 50 μL에 100 μM 아질산소 듐(NaNO

2

) 100 μL를 가하여 37

^o

C 의 암소에서 1시간 방치한 후, 5% 인산(H

3

PO

₄

) 으로 희석한 1% 설파닐아마이드(sulfanilamide)를 가하여 암소에서 5분간 반응시켰다. 이후 0.1% NED 50 μL를 첨 가하여 10분간 반응시키고 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세 포에서 생성되는 NO제거능을 분석하기 위하여 RAW264.7세포를 96-well plate 에 각 well마다 8×10

⁴

씩 분주하고 24시간 배양하였다.

이어서 LPS (1 μg/mL)를 포함한 serum free 배지로 교체하여 1시 간 동안 선처리한 다음, LPS를 포함한 배지는 제거하고 서로 다 른 농도의 퉁퉁마디 분획을 24 또는 48시간 동안 처리하였다. 이 후 50 μL의 배지를 취하여 5% H

3

PO

₄

에 희석한 1% 설파닐아마 이드를 50 μL와 1% NED solution을 50 µL을 첨가하여 암소에서 10 분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max M2)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.

웨스턴 블롯팅(Western blotting)

RAW264.7 세포는 6-well plate에 well당 10

⁶

씩 분주하여 24시 간 배양한 후, 1 µg/mL LPS를 처리하였다. 이 후 각 퉁퉁마디 분 획을 24시간 처리한 세포를 냉각 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS) 로 세척하고 세포용해 완충용액(cell lysis buffer,

#9803, Cell Signaling Technology) 을 이용하여 세포용해물(cell lysate) 을 제조하였다. 각 세포용해물은 초음파를 이용하여 분쇄한 다음 4

^o

C 에서 10,000×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하 였다. 동일한 양의 단백질을 함유한 세포용해물을 7.5-10% SDS- 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기이동 한 후, 젤 상에 분리된 단 백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(membrane)에 1시간 transfer 하였다. 막은 5% 차단 완충용액(blocking buffer, 0.05%

Tween-20 을 함유한 5% non-fat milk in PBS)를 이용하여 상온에 서 3시간 동안 처리한 후, iNOS, cPLA

2

, COX-2, 5-LOX, p-ERK 및 튜불린의 1차 항체(in 5% blocking buffer)를 첨가하여 4°C에 서 12-48시간 반응시켰다. 이 후, 막은 0.05% Tween-20을 함유한 트리스완충식염수(Tris-buffered saline) 용액으로 15분씩 3회 헹군 다음, 겨자무 과산화효소(horse radish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 상온에서 3시간 반응시켰다. 이를 다시 0.05% TBS-T로 3 회 씻어내고 luminol 시약(sc-2048, Santa Cruz Biotechnology)과 반응시켜 이미지분석기(LAS-4000 mini; Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. 각 세포용해물의 단 백질 농도는 bicinchoninic acid 단백질 분석 키트(Pierce, Rock- ford, IL, USA) 를 사용하여 측정하였으며, 소혈청알부민을 표준물 질로 이용하여 정량하였다.

통계처리

모든 측정값은 2회 또는 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로

(3)

나타내었으며, 각 실험군별 유의차 분석은 Student’s t-test 또는 일 원분산분석(One-way analysis of variance, ANOVA)을 사용하였다.

일원분산분석은 SAS 프로그램(SAS Institute; Cary, NC, USA)을 이용하여 실행하였으며, 사후검정은 Tukey’s test를 사용하여 95%

의 유의수준에서 검정하였다.

결과 및 고찰

화학적 조성, 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량, 아질산 제거 활성

퉁퉁마디 추출물의 각 분획별 총 폴리페놀과 플라보노이드 함 량을 타닌산과 퀘세틴을 표준물질로 계산하여 Fig. 1A에 나타내 었다. 분획별 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 Fr.EA>Fr.B>

Fr.H>Fr.E>Fr.W 순으로 나타났다. 가장 높은 함량을 나타낸 Fr.EA 는 mg 추출물당 각각 224.8, 111.2 µg의 총 폴리페놀과 플라보노 이드 함량을 함유하였고, 이에 반해 Fr.W는 mg당 각각 12.7, 4.3 µg 를 함유함으로써 분획 중 가장 낮은 함량을 보였다. 일반적으 로 식물 추출물에서 발견되는 폴리페놀성 물질에는 다양한 플라 보노이드 성분들이 포함되어 있으며, 이들은 주로 중간 극성의 용매분획에서 발견되는데 본 퉁퉁마디 시료에서도 Fr.EA와 Fr.B 의 중간 극성 분획에서 이들의 함량이 높게 나타났다. 친수성 성 분들로 구성된 분획인 Fr.W는 80%이상의 가장 높은 수율을 나 타내었는데 퉁퉁마디 중에 다량 함유된 염분과 다양한 무기질들 이 주성분으로 예상된다(Kang과 Hong, 2016). 비교적 소수성이 강한 물질들의 분획인 Fr.E의 성분으로는 기존에 보고된 베타시 스토스테롤(β-sitosterol)이나 스티그마스테롤(stigmasterol)과 같은 파이토스테롤류와 지방산 등이 포함되어 있을 것으로 예상되며 (Lee 등, 2004b), 가장 강한 소수성을 가진 Fr.H에는 중성지방질 이나 스테로이드와 같은 지질성분들이 함유되어 있을 것으로 보 이나 퉁퉁마디의 지방질류를 비롯한 소수성 성분에 대한 연구는 거의 보고된 바 없다.

NO 는 NOS에 의해 아르지닌(

L

-arginine) 으로부터 효소적으로 생 성되며 염증반응의 진행에 중요한 역할을 담당한다(Bogdan, 2001).

본 연구에서는 퉁퉁마디 분획성분들이 NO에 대한 화학적 제거 능을 가지고 있는지 알아보기 위하여 아질산 용액에 각 분획을 처리하여 제거활성을 측정하였다. 아질산은 생체 내에서 NO로 환원될 수 있는 안정적 저장물질이며(Lundberg 등, 2008), 화학적 으로 불안정한 NO를 측정하기 위해서도 비교적 안정한 대사물 인 아질산을 지표로 사용한다(Marletta 등, 1988). 퉁퉁마디 분획 별 아질산 제거활성은 Fr.EA>Fr.B>Fr.H>Fr.E>Fr.W 순으로 나타 났으며, Fr.EA는 33 μg/mL 농도에서 76%의 nitrite를 제거하였고 IC

₅₀

은 18.6 μg/mL로 나타났다(Fig. 1B). 동일한 농도에서 Fr.B, Fr.H 와 Fr.E는 각각 53, 43 및 32%의 NO를 제거하였으며, Fr.W 는 6% 정도의 NO를 제거함으로써 분획 중 그 활성이 가장 낮 았다. 퉁퉁마디의 아질산 제거활성은 각 분획의 폴리페놀 및 플 라보노이드성 물질의 함량과 일관된 경향을 나타내었고, 따라서 이들 물질의 산화방지 특성이 아질산의 화학적 제거에 중요한 역 할을 하는 것으로 판단된다.

세포독성과 NO 제거활성 측정

RAW264.7 세포에 각 시료 추출물을 48시간 처리하여 세포독성 효과를 확인한 결과, 세포독성을 나타내지 않았으며 오히려 세포 의 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. Fr.H, Fr.E, Fr.EA와 Fr.B는 50 μg/mL 농도에서 20-70% 세포성장 촉진 효과를 나타내고 Fr.W 는 세포성장에 영향을 미치지 않았다(Fig. 2A). LPS로 1시간 동

안 자극한 큰포식세포에 각 분획을 50 μg/mL 농도로 처리하고, 24 와 48시간 후 배지 중 생성된 NO량을 측정한 결과, 각 분획 의 NO 생성량 억제 정도는 Fr.E>Fr.H>Fr.EA>Fr.B>Fr.W 순으로 나타났다(Fig. 2B). 가장 강한 활성을 나타낸 Fr.E는 24시간 처리 시 60% 정도의 NO 생성을 억제하였으며, 48시간 경과 후에는 NO 의 생성을 70% 이상 감소시킴으로써 시간의 경과에 따라 그 효과가 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 2B). 큰포식세포에 0-80 μg/

mL 까지 농도를 달리하여 각 분획을 24시간 처리한 결과, Fr.W를 제외하고 전반적으로 농도 의존적인 NO 억제활성을 나타내었다 (Fig. 2C). Fr.E 는 10-80 μg/mL 농도에서 배지 중 NO량을 28-74%

저하시킴으로써 가장 높은 활성을 보였으며, Fr.H와 Fr.EA도 처 리농도 증가에 따라 활성이 강화되어 80 μg/mL 농도에서 각각 61% 와 36%의 NO 억제효과를 나타내었다(Fig. 2C). Fr.W는 100- 800 μg/mL에서 24시간 처리 시 배지 중 NO 생성량을 4-15% 정 도 감소시켰다(data not shown). 특정 분획들이 LPS를 처리하지 않은 조건에서 큰포식세포의 성장을 촉진한다는 결과와(Fig. 2A), 퉁퉁마디 성분이 큰포식세포에서 염증성 사이트카인의 분비를 활 성화한다는 기존 보고(Im 등, 2006)에 근거하여, 분획 성분 자체 가 큰포식세포를 활성화하고 NO의 생성을 유도하는가에 대한 여 부를 조사한 결과, 100 μg/mL까지의 농도범위에서 자체적인 유 도효과는 관찰되지 않았다(Fig. 2D).

지금까지 LPS에 의해 활성화된 큰포식세포를 이용하는 대부분

의 연구에 의하면 측정물질의 처리시점이 LPS처리 전이거나 LPS

와 같이 처리하여 효과를 분석한 결과가 대부분이고, 퉁퉁마디의

Fig. 1. Contents of total polyphenols and flavonoids in the

fractions from glasswort (A) and their nitrite scavenging

activities (B). Each value represents the means±SD (n=4). Different

letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way

ANOVA and the Tukey’s HSD test.

(4)

항염 효과에 대한 기존 연구들에서도 유사한 실험이 진행된 바 있다(Lee 등, 2007). 하지만 정제되지 않은 천연 추출물을 사용하 는 경우 다양한 미지성분이 비특이적으로 LPS의 작용을 방해하 거나 세포막과 TLR을 비롯한 관련 수용체와의 비특이적인 간섭 을 통해 진행되는 염증반응에 영향을 미쳐 항염증 메커니즘으로 오인되는 결과가 나타날 수 있다. 본 연구에서는 큰포식세포 활 성화를 위한 LPS 처리를 시료물질 처리 전 1시간 동안 실시하 였고 이를 제거한 후 퉁퉁마디 분획을 처리함으로써 이미 수용 체를 통해 염증반응이 유발된 세포계에서의 활성을 분석하였으 며, 따라서 LPS와 처리물질 간 또는 처리물질의 수용체에 대한 비특이적 간섭요인을 배제하여 실험오류를 최소화하고자 하였다.

iNOS 발현 패턴 조사

세포배양계에서 NO 제거활성에 의하면 아질산 제거능이 뛰어 난 Fr.EA나 Fr.B보다 Fr.E와 Fr.H 분획이 더 강한 효과를 나타내 었고, 이는 Fr.E와 Fr.H 분획성분들이 산화방지능을 발휘하여 화 학적으로 NO를 제거하기보다는 큰포식세포에서 LPS에 의한 iNOS 발현을 억제하여 나타난 효과로 판단된다.

생체 내에서 NO는 endothelial NOS, neuronal NOS 및 iNOS 에 의해 효소적으로 합성되고, 체내 혈관을 확장시키거나 신경전 달에 관여하는 등 생체 내 중요한 기능을 담당하기도 하지만, iNOS 에 의한 과도한 NO 생성은 염증 유발에 중요한 인자로 작 용한다(Bogdan, 2001). 특히 iNOS는 일반적으로 정상상태의 세포

에서는 발현되지 않으나, 큰포식세포와 같은 면역세포에서 다양 한 자극에 의해 유도되어 다량의 NO를 생성하며, 혈관 투과, 부 종 등의 염증반응을 촉진시키고 염증매개 물질의 생합성을 촉진 시킨다(Nagy 등, 2007). LPS에 의해 활성화된 큰포식세포에 각 퉁퉁마디 분획을 50 μg/mL 농도로 24시간 처리한 결과, Fr.E, Fr.H 및 Fr.EA에 의한 현저한 iNOS 발현 억제현상이 관찰되었다(Fig.

3A). 농도를 달리하여 각 분획을 처리한 결과, Fr.E>Fr.H>Fr.EA

>Fr.B 의 순의 iNOS 발현 억제활성을 나타내었으며, 가장 강한 효 과를 나타낸 Fr.E의 iNOS발현에 대한 IC

50

은 28.5 μg/mL로 나타 났다(Fig. 3B). Fr.W는 100-200 μg/mL 농도에서 오히려 iNOS 발 현을 30% 증가시켰으며, 800 μg/mL 농도에서는 12%의 발현 감 소효과를 나타냈다(Fig. 3C). 따라서 퉁퉁마디 성분의 세포배양계 에서의 NO 억제효과는 iNOS 발현 억제효과와 직접적으로 관련 이 있음을 확인하였고, Fr.E와 Fr.H 분획의 성격상 플라보노이드 나 폴리페놀류보다는 훨씬 소수성 성질을 가진 물질이 활성을 나 타내는 것으로 생각된다. 기존 보고(Lee 등, 2007)에서는 높은 산 화방지 활성을 나타낸 에틸아세테이트와 뷰탄올 분획에 대해서 만 큰포식세포에서의 NO 제거활성을 측정이 이루어졌고, Kim 등(2009)에 의해 항염활성물질로 제시된 isorhamnetin 3-O-β-

D

- glucopyranoside 의 경우에도 중간극성 이상의 성질을 가지고 있는 배당체로서, 본 연구결과에 나타난 소수성 분획의 높은 활성은 항염활성을 나타내는 퉁퉁마디 신규물질에 대한 가능성을 강하 게 제시하고 있다.

Fig. 2. Effects of the glasswort fractions on cell viability and NO production in RAW264.7 cells. The viability of RAW264.7 cell treated

with 50 µg/mL of the fractions was analyzed for 24 h (A). Effects of each fraction on NO productions in LPS-stimulated RAW264 cells during

24 and 48 h (B) and their concentration-dependent effects at 24 h (C) were determined. Effects of the fractions on NO production in

unstimulated cells during 24 h were also analyzed (D). Each value represents the means±SD (n=8). Significantly different from its

corresponding control according to Student’s t-test (**p<0.01). Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way

ANOVA and the Tukey’s HSD test. ns, No significant difference among samples

(5)

cPLA

₂

발현 및 ERK1/2 활성화에 대한 영향 평가

세포막구조물의 인지질로부터 아라키돈산을 유리시키는 PLA

2

효소로는 secreted PLA

2

(sPLA

₂

), cPLA

₂

, Ca

²⁺

independent PLA

₂

(iPLA

₂

), lipoprotein-associated PLA

₂

s (lp-PLA

₂

) 가 있으며(Leslie, 2015), 염증반응과 가장 밀접하게 관련 있는 cPLA

2

는 세포질에 존재하면서 특정 자극에 의해 유도되거나 p-ERK에 의해 인산화 되고, Ca

²⁺

의존 하에 소포체 또는 핵 주변 막(perinuclear mem- branes) 으로 전좌(translocation)되어 아라키돈산을 방출시킨다(Leslie, 1997). 이렇게 방출된 아라키돈산은 COXs와 LOXs 효소에 의해 연속적으로 대사되어 프로스타글란딘과 루코트라이엔과 같은 강 력한 염증 매개물을 형성하게 된다(Romano와 Claria, 2003). 따라 서 본 연구에서는 염증반응의 핵심경로 중 하나인 아라키돈산 대 사의 속도결정단계로 알려진 cPLA

2

효소발현에 대한 퉁퉁마디

분획의 효과를 검토하였다. 본 실험조건에서 cPLA

2

는 LPS자극에 의해 발현량이 30%정도 증가하는 것으로 나타났고, 퉁퉁마디 분 획 중 Fr.E, Fr.EA 등의 처리시 현저한 발현량의 감소가 관찰되 었다(Fig. 4A). 한편 각 분획을 농도별 처리하여 효과를 평가한 결과, Fr.E는 10-80 μg/mL 범위에서 농도 의존적으로 86%까지 cPLA

₂

발현을 감소시켰으며, 80 μg/mL에서 Fr.H와 Fr.EA는 각각 59 및 75%의 cPLA

2

발현을 억제하였다(Fig. 4B). 강력한 cPLA

2

발 현 억제효과를 보인 Fr.E, Fr.EA 및 Fr.H의 IC

50

은 각각 33.5, 45.9 및 50.5 μg/mL로 나타났다(Fig. 4B).

ERK1/2 또는 p44/p42는 다양한 자극에 의해 p-ERK로 인산화

되어 활성화되며 cPLA

2

를 인산화시켜 세포막에서 아라키돈산의

방출을 유도한다(Hiller와 Sundler, 1999). 이어지는 실험에서 강력

한 cPLA

2

발현억제활성을 보인 Fr.E에 대하여 LPS로 자극한

Fig. 3. Effects of the fractions from glasswort on the expressions of iNOS in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. After stimulation

with 1 µg/mL LPS for 1 h, cells were treated with 50 µg/mL with each fraction for 24 h (A). Effects of different concentrations (0-80 µg/mL) of

each fraction and IC

₅₀

value on iNOS expression were analyzed (B). Concentration-dependent effects of Fr.W were also analyzed (C). The

results indicate a representative of more than duplicate experiments which show similar patterns and tubulin (B) is a representative loaded with

Fr.E. Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test (B).

(6)

RAW264.7 세포에 농도별로 처리하여 ERK와 p-ERK 변화량을 조 사하였다(Fig. 5). LPS 자극과 Fr.E의 처리여부에 관계없이 전체 적인 ERK단백질 발현량의 차이는 나타나지 않았다. 그러나 LPS 자극에 의해 ERK의 활성화가 일어나 인산화수준이 현저히 증가 하였는데, Fr.E는 농도의존적으로 p-ERK의 수준을 감소시켰고 특 히 p44의 인산화를 p42보다 효과적으로 저해하였다(Fig. 5). 선행 연구에 의하면 RAW264.7세포에서 p-ERK의 저해가 cPLA

2

의 인 산화의 저해와 함께 전반적인 아라키돈산 대사과정의 저해에 연 관되어 있음을 보고 하였으며(Hong 등, 2006), 따라서 퉁퉁마디 분획에 의한 ERK활성화의 저해는 cPLA

2

의 활성화를 막고 연속 되는 아라키돈산 관련 대사를 효과적으로 억제할 수 있을 것으 로 판단된다.

COX-2 및 5-LOX 발현억제 효과

세포에서 cPLA

2

에 의해 유리된 아라키돈산은 COXs, LOXs 등 에 의해 대사되어 염증반응을 촉진한다. COX는 항상 일정량 발 현되어있는 COX-1과 특정 자극에 의해 발현이 유도되는 COX- 2, 최근 밝혀진 COX-3 등의 동형(isoform)이 알려져 있는데 그 중 COX-2는 다양한 염증자극에 의해 그 발현량이 수십배 이상 증가하며 과량의 아라키돈산 대사물을 생성하여 염증반응을 촉 진시키는 것으로 보고되었다(Williams 등, 1999; Wang과 Dubois,

2006). LPS 로 자극한 RAW264.7 세포에 퉁퉁마디 분획을 각 50 μg/mL 처리하여 COX-2 발현에 미치는 영향을 평가한 결과, Fr.E 와 Fr.H 분획을 처리한 세포에서 강력한 COX-2 발현억제 현상 이 나타났으며 Fr.EA에 의해서도 현저하게 발현량이 감소하는 것 으로 나타났다(Fig. 6A). 각 분획을 농도별로 처리한 실험에서, Fr.E 는 10-80 μg/mL 범위에서 농도 의존적으로 81%까지 COX-2 발현량을 감소시켜 가장 높은 활성을 나타내었고, IC

50

는 27.9 μg/

mL 로 계산되었다(Fig. 6B). Fr.H와 Fr.EA 역시 농도 의존적으로 COX-2 발현 억제효과를 보이며 각각 42.8과 69.1 μg/mL의 IC

50

결과를 나타내었고, Fr.B는 COX-2 발현에 대한 억제활성이 크게

나타나지 않았다(Fig. 6B). 아라키돈산의 또 다른 대사경로 관련

효소인 LOXs는 사람에게서 5-LOX, 12-LOX, 15-LOX 등이 발견

되었으며, 이 중 주로 5-LOX에 의해 대사되어 생성되는 대사산

물이 염증반응을 매개하는 데 중요한 역할을 하며, 암의 발생 및

암세포의 성장과도 밀접하게 연관되어 있는 것으로 알려져있다

(Steele 등, 1999; Steinhilber와 Hofmann, 2014). LPS를 처리하지

않은 RAW264.7세포에도 5-LOX가 미량 발현되어 있었으나, LPS

처리에 의해 5-LOX의 발현이 크게 증가하는 것으로 나타났다

(Fig. 6C). 각 퉁퉁마디 분획을 50 μg/mL 농도로 처리하여 5-LOX

발현량의 변화를 평가한 결과, Fr.H, Fr.E, Fr.EA 처리군에서 유

의적인 발현량의 감소를 나타내었으며 Fr.B와 Fr.W는 억제효과

Fig. 4. Effects of the fractions from glasswort on the expressions of cPLA

₂

in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. After stimulation

with 1 µg/mL LPS for 1 h, cells were treated with 50 µg/mL with each fraction for 24 h (A). Effects of different concentrations (0-80 µg/mL) of

each fraction and IC

₅₀

value on cPLA

₂

expression were analyzed (B). The results indicate a representative of more than duplicate experiments

which show similar patterns and tubulin (in B) is a representative loaded with Fr.E. Different letters indicate a significant difference (p<0.05)

based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test (in B).

(7)

Fig. 5. Effects of Fr.E from glasswort on the level of ERK and p-ERK in LPS-stimulated RAW264.7 cells. After stimulating with 1 µg/mL LPS for 1 h, cells were incubated with different concentrations of Fr.E for 24 h. Western blot analysis was performed on cell lysates containing 50 µg protein with an antibody against ERK, p-ERK and tubulin. *

^,

**

^{, ##}

Significantly different from its corresponding control according to Student’s t-test (*p<0.05; **

^{, ##}

p<0.01) (n=3).

Fig. 6. Effects of the fractions from glasswort on the expressions of COX-2 and 5-LOX in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages.

After stimulation with 1 µg/mL LPS for 1 h, cells were treated with 50 µg/mL with each fraction for 24 h (A and C). Effects of different

concentrations (0-80 µg/mL) of each fraction and IC

₅₀

value on COX-2 expression were analyzed (B). Effects of the fractions on 5-LOX levels

were also analyzed (C). The results indicate a representative of more than duplicate experiments which show similar patterns, and tubulin (B) is

a representative loaded with Fr.E. Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD

test (B). **

^{, ##}

Significantly different from its corresponding control according to Student’s t-test (**

^{, ##}

p<0.01) (n=3, in C). N/C, not calculated

(8)

를 나타내지 않았다(Fig. 6C).

이상의 결과로부터 퉁퉁마디 추출물이 iNOS 발현 및 NO 생 성에 대한 억제효과를 가지고 있으며, cPLA

2

의 발현과 ERK1/2 의 활성화 억제, COX-2 및 5-LOX 효소의 발현 억제를 통한 아 라키돈산 대사 조절로 인해 효과적인 항염증 활성을 발휘할 수 있을 것으로 사료된다. 특히 각 분획별 활성을 고려하였을 때, Fr.E 또는 Fr.H에서 비교적 높은 활성을 나타내었고 Fr.W와 Fr.B 에서의 활성은 상당히 미약한 것으로 나타나 퉁퉁마디의 수용성 이나 친수성 성분보다는 소수성 물질들이 항염증활성의 주요 원 인성분으로 예상되며, 퉁퉁마디 항염증 관련 제품을 위한 추출과 가공공정에 본 연구결과가 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

요 약

퉁퉁마디는 식용 염생식물로서 이에 대한 유용 기능성 탐색 및 생리활성 평가에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 본 연 구에서는 퉁퉁마디 70% 메탄올 추출물을 극성에 따라 분획하여 얻은 Fr.H, Fr.E, Fr.EA, Fr.B 및 Fr.W의 5분획의 NO제거 및 iNOS 발현, 아라키돈산 대사에 관련된 효소 cPLA

2

, COX-2, 5- LOX 등의 발현과 활성화에 대한 효과를 분석하여 항염작용과 메커니즘을 검토하였다. 이 중 Fr.EA가 가장 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 성분 함량을 나타내었고 nitrite/아질산의 제거에 있 어서도 가장 뛰어난 활성을 보였다. 하지만 LPS로 자극한 RAW264.7 큰포식세포 배양계에서는 Fr.E가 가장 우수한 NO 제 거활성과 iNOS발현억제 활성을 나타내었고 이어 Fr.H와 Fr.EA의 활성 순을 나타냈다. Fr.E는 또한 LPS로 자극한 RAW264.7 배양 세포계에서 cPLA

2

와 COX-2의 발현억제에 가장 큰 효과를 나타 내었으며 이들의 억제를 위한 IC

50

는 각각 33.4과 27.9 μg/mL로 나타났다. Fr.E는 cPLA

2

의 활성화에 중요한 영향을 미치는 ERK1/

2 의 인산화도 농도의존적으로 저해하였다. Fr.H와 Fr.EA도 80 μg/

mL 이하 농도에서 iNOS와 아라키돈산 대사효소들의 발현을 농 도의존적으로 억제하였다. 하지만 가장 극성 분획인 Fr.W는 모 든 활성평가 시스템에서 거의 효과를 나타내지 않았다. 본 연구 는 퉁퉁마디가 iNOS와 아라키돈산 대사효소계를 효과적으로 억 제하여 항염증작용을 할 수 있다는 것을 보고하고 있으며, 특히 Fr.E 와 Fr.H와 같은 소수성 분획들이 우수한 활성을 나타내어 향 후 이를 타깃으로 하는 관련 기능성 소재로서의 활용이 기대된다.

감사의 글

본 연구는 농림축산식품부 농림식품기술기획평가원(Grant No.

109147-03-1-SB020) 과 2018년 서울여자대학교 교내학술연구비 지 원에 의해 수행되었습니다.

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