염산/에탄올로 유도된 급성위염 동물모델에서 치자 에탄올 추출물의 보호 효과
김수현1․이진아1․이아름2․신미래1․박해진3․노성수1
1대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실
2호산대학교 뷰티디자인학과
3대구한의대학교 의과학대학 한방식품조리영양학부
Protective Effect of Gardenia Fruit Ethanol Extract in HCl/Ethanol-Induced Acute Gastritis
Soo Hyun Kim1, Jin A Lee1, Ah Reum Lee2, Mi-Rae Shin1, Hae-Jin Park3, and Seong-Soo Roh1
1Department of Herbology, College of Korean Medicine and
3Faculty of Herbal Cuisine and Nutrition, Daegu Haany University
2Department of Beauty Design, Hosan University
ABSTRACT This study examined the protective effects of gardenia fruit 50% ethanol extract (GFE) on a 150 mM HCl/60% ethanol-induced acute gastric injury model in mice. The antioxidant activities were evaluated through radical scavenging assays using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid). To evaluate the anti-gastritis effect of GFE, ICR mice were divided into 5 groups: Nor (normal group), Con (gastritis induced by HCl/ethanol with distilled water), SC treatment group (gastritis induced by HCl/ethanol treated with 10 mg/kg sucralfate), GL treatment group (gastritis induced by HCl/ethanol treated with 50 mg/kg GFE), and GH treatment group (gastritis induced by HCl/ethanol treated with 100 mg/kg GFE). The mice were pretreated with the extract (GL, GH) or drug (SC), and after 1 hour, 0.55 mL of 150 mM HCl/60% ethanol (v/v) mixture was administered orally.
GFE improved the gastric lesions in a concentration-dependent manner. In addition, GFE inhibited the increased reactive oxygen species and ONOO- through the antioxidant pathway. The antioxidative biomarkers, including nuclear factor-er- ythroid 2-related factor 2, heme oxygenase-1, superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase-1/2, were increased significantly. In addition, the inflammatory related makers, nuclear factor-kappa B p65, inhibitor of nuclear factor kappa B alpha, cyclooxygenase-2, tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-1 beta, were increased. GFE sig- nificantly inhibited inflammation through the antioxidant pathway. Therefore, GFE has potential for treating acute gastritis.
Key words: acute gastritis, gardenia fruit, antioxidant, anti-inflammation
Received 22 October 2018; Accepted 14 November 2018 Corresponding author: Seong-Soo Roh, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Daegu 42158, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-53-770-2350
Author information: Soo Hyun Kim (Graduate student), Jin A Lee (Graduate student), Ah Reum Lee (Professor), Mi-Rae Shin (Researcher), Hae-Jin Park (Professor), Seong-Soo Roh (Professor)
서 론
위염은 위점막의 염증성 질환으로 위점막의 방어인자와 공격인자 사이의 불균형으로 인하여 발생한다(1). 위산과 다, NSAID(non-steroidal anti-inflammatory drugs), Heli- cobacter pylori 균 감염, 과도한 음주, 스트레스 등이 대표 적인 원인이며, 이로 인하여 히스타민 분비량 증가, 산화적 스트레스 등은 위 조직의 손상과 염증을 일으킨다(2).
위염의 치료제로는 위산의 분비를 억제하는 제산제, 히스 타민 수용체 억제제(H2 receptor antagonist), 양성자 펌프
를 억제하는 proton pump inhibitor(PPI), 위벽의 상피 세포 를 보호하는 sucralfate 등이 대표적으로 알려져 있다(3).
이러한 약물들은 우수한 치료 효과를 보이나 여러 부작용이 보고되고 있다(4,5).
현재 위염 발생의 분자학적인 기전에 대해서는 명확하게 규명되어 있지 않으나 많은 연구에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 위염의 발병에서 중요한 원인으 로 알려져 있다(6). 위에서 발생한 활성산소종의 과도한 증 가는 세포의 과산화지질 형성 증가로 이어지며, 이는 세포벽 을 손상해 위점막의 손상을 유발한다(7). 또한 과도한 활성 산소종은 세포 내 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 발현 을 유도하여 염증성 매개 사이토카인을 증가시킴으로써 염 증반응을 일으킨다(8). 질병의 원인이 되는 활성산소종을 제 거하기 위한 항산화제의 기능성에 대한 연구가 활발하게 진 행되고 있으며, 천연물에서 유래된 천연 항산화제를 이용한 항산화 활성 및 여러 생물학적 기능성에 대한 연구도 진행되
고 있다(9,10).
치자(gardenia fruit)는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하 는 치자나무의 잘 익은 열매이다(11). 치자의 구성성분으로 는 flavonoids 계열의 quercetin, rutin, nicotiflorin 등과 carotenoid 계열의 crocin, crocetin 등과 iridoid 계열의 genipin, geniposide, gardenoside 등이 있다(12). 기존 연 구에서 치자는 담즙분비 촉진 작용(13), 항염증 작용(14), 불안 억제 작용(15), 항산화 작용(16) 등이 보고되어 있다.
본 연구에서는 치자 50% 에탄올 추출물(GFE)을 이용하 여 in vitro 항산화 활성을 측정하였고, 이에 따른 항산화 경로를 통한 위염 억제 효과를 확인하기 위하여 in vivo 동물 실험에서 HCl/에탄올로 유도된 급성위염 동물 모델에서 GFE를 경구 투여하여 보호 효과를 평가하였다.
재료 및 방법
시료 추출
본 실험에 사용된 치자는 휴먼허브(영천, 한국)에서 구입 한 것을 생약규격집에 맞춰 관능검사 하고 약전규격에 적합 한 것만을 정선하여 사용하였다. 치자 200 g 분량에 50%
에탄올을 2,000 mL 가하여 24시간 냉침하여 추출액을 얻었 다. 그 추출액을 감압 증류장치로 농축하고 그것을 다시 동 결 건조기를 이용하여 완전 건조한 분말(GFE 46.24 g, 23.12%)을 얻었으며 실험에 사용하기 직전까지 냉동(-80
°C) 보관하였다.
실험동물
6주령 웅성 ICR mouse(오리엔트, 서울, 한국)를 구매하 여 물과 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사, 경산, 한국)를 충 분히 공급하며 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사 용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2°C, 습도 50±5%, 명암주기는 12시간 주기로 조 절하였다. 사료는 고형사료(조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6
% 이상, 인 0.4% 이상, 항생제 무첨가, 삼양사)와 물을 충분 히 공급하였다. 실험은 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Commit- tee: IACUC)의 승인(DHU2018-058)을 얻어 시행하였으 며 동물관리 규정을 준수하였다.
시약
본 실험에 사용된 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 7 mM 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS), sodium hydroxide, potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, sucrose octa- sulfate-aluminum complex(sucralfate)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 2’,7’-
Dichlorofluorescein-diacetate(DCF-DA)와 dihydrorho- damine(DHR) 123은 Molecular Probes(Eugene, OR, USA) 에서 구입하였고 nitrocellulose membranes, enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection re- agents는 GE Healthcare(Little Chalfont, UK)에서 구입하 였다. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf- 2), heme oxygenase-1(HO-1), superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase-1/2(GPx-1/2), nuclear factor-kappa B p65(NF-κBp65), inhibitor of nu- clear factor kappa B alpha(IκBα), phosphorylation-in- hibitor of nuclear factor kappa B alpha(p-IκBα), cyclo- oxygenase-2(COX-2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleu- kin-1 beta(IL-1β), interleukin-6(IL-6), histone, β-ac- tin과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, protease inhibitor mix- ture, dimethyl sulfoxide, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit은 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
DPPH 자유라디칼 소거 활성 측정
항산화 활성을 측정하는 방법으로 Blois에 의한 DPPH 자유라디칼 소거법을 사용하였다(17). DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 중에 포함된 항산화 물질의 양을 측정하는 데 사용되는 대표적인 실험법이다. 일정 농도의 시료 100 μL와 60 μM DPPH 용액을 100 μL 넣고 혼합한 후, 암소 상태의 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 UV spectro- photometer(Infinite M200, Tecan, Salzburg, Austria)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였다. 시료 를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는 데 필요한 시료의 양을 IC50 값으로 나타내었다.
ABTS 자유라디칼 소거 활성 측정
GFE의 항산화 효능을 비교 평가하기 위하여 ABTS 라디 칼 소거 활성을 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM po- tassium persulfate를 증류수에 녹인 다음 12시간 동안 차 광하여 반응시킨 후, 이 반응액을 415 nm에서 에탄올을 이 용하여 흡광도 0.70±0.02로 보정하였다. ABTS 용액 95 μL에 시료 5 μL를 첨가하고 15분 동안 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다(18). 각 시료 추출물의 자유 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료첨 가군의 흡광도를 1/2로 억제하는 IC50 값으로 나타내었다.
급성위염 유발과 동물 처치
실험동물은 군당 8마리씩 5그룹으로 구분하여 실험을 하 였다. 실험 전날까지 고형사료와 물을 충분히 공급하였고
위점막 손상 유발 실험 24시간 전 절식하였다. 실험 전 정상 군(Nor)은 아무런 처치를 하지 않았고 위점막 손상 대조군 (Con)은 증류수를 경구 투여하였으며, 양성대조군인 수크 랄페이트 투여군(10 mg/kg body weight, SC), GFE 저농도 투여군(50 mg/kg body wight, GL), GFE 고농도 투여군 (100 mg/kg body weight, GH)은 각 농도에 맞게 경구 투여 한 후 1시간 방치하였다. 그다음 위점막 손상을 유발하기 위하여 150 mM HCl/60% 에탄올을 각 0.55 mL씩 경구 투여하였고 1시간 후 isoflurane(Sigma-Aldrich Co.)으로 흡입 마취하여 개복 후 위 조직을 적출하였다(19).
조직학적 관찰
적출한 위 조직을 고정한 다음 광학 디지털카메라(DSCHX 50V, Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 위점막 측정은 i-Solution Lite(Innerview Co., Gyeonggi- do, Korea) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정한 후 위 전체 면적과 비교하였으며, 아래의 식을 이용 하여 위점막 손상도를 나타냈다.
∫ 위점막 손상면적＝ 위 손상 부위 면적 위 전체 면적
∬ 위점막 손상도＝ 각 군의 위점막 손상 면적 정상군 위점막 손상 면적
산화적 스트레스 바이오마커 측정
위 조직을 분쇄하여 샘플을 채취하였다. ROS 측정은 Ali 등(20)의 방법을 시행하였다. 위 조직 샘플과 25 mM DCF- DA를 혼합한 후 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 5분씩 emission 파장 535 nm와 excitation 파장 480 nm를 이용 하여 30분간 측정한 산출된 값을 계산하였다.
ONOO-는 각 위 조직의 샘플을 pH 7.4의 rhodamine buffer와 5 mM DHR123과 섞은 후 5분간 37°C에서 흔들어 준 다음 0분부터 매 5분씩 35분간 emission 파장 535 nm와 excitation 파장 480 nm를 이용하여 분간 측정하여 산출된 값을 계산하였다(21).
위 조직 western blotting
위의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2 mM 염화마그네슘(MgCl2), 15 mM 염화칼슘(CaCl2), 1.5 M sucrose, 0.1 M dithiothreitol (DTT), protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 조직 분쇄기(Biospec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심 분리하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵 을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구 고 100 mL의 buffer C[50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid(HEPES), 50 mM 염화포
타슘(KCl), 0.3 mM 염화소듐(NaCl), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF), 10% glycerol]를 첨가해 재부유시킨 뒤 10분마다 vortex 를 3번 하였다. 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리 한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 -80°C에서 각각 냉동 보관하였다. 위 조직 세포질의 β-actin, IκBα, p-IκBα, HO-1, SOD, catalase, GPx-1/2, COX-2, TNF-α, IL-1β 와 세포핵의 histone, Nrf-2, NF-κBp65 단백질 발현을 측 정하기 위하여 10 μg의 단백질을 8~15% SDS 폴리아크릴 아미드겔을 이용하여 전기영동 후, 아크릴아마이드겔을 니 트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 준비된 막(membrane)에 각각의 1차 antibody를 phosphate buffered saline sup- plemented with tween 20(PBS-T로 1:1,000으로 희석해 서 사용)를 처리하여 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T 로 6분마다 5회 세척하고, 각각 2차 항체(PBS-T로 1:
3,000으로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 2시간 반 응시킨 후 다시 PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 membrane을 ECL 용액에 노출한 후 Sensi-Q2000 Chemi- doc(Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백 질 발현을 확인한 다음, 해당 band를 ATTO Densitograph Software(ATTO Corp., Tokyo, Japan) 프로그램을 사용 하여 정량하였다.
통계분석
In vitro의 수치는 평균과 표준편차로, in vivo의 수치는 평균과 표준오차로 표시하였으며, SPSS(Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences(LSD) test로 사후검증을 하여 각 군의 평균 차 이에 대한 통계적 유의성을 P<0.05, P<0.01, P<0.001에서 검증하였다.
결과 및 고찰
항산화 활성 측정 결과
치자 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 방법을 통하여 측정하였는데, DPPH 와 ABTS 측정 방법은 각각 항산화 물질이 라디칼에 대한 결합 정도의 차이가 나타나기 때문에 2가지 실험방법을 이 용하여 측정하였다(22). 양성대조군으로는 L-ascorbic acid 를 사용하였으며 각각 측정한 결과를 IC50 값으로 나타내었 다. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 L-ascorbic acid의 IC50 값은 1.09±0.02 μg/mL이고, GFE의 IC50 값은 40.51±0.17 μg/mL로 나타났다. ABTS 라디칼 소거 활성 을 측정한 결과 L-ascorbic acid의 IC50 값은 3.74±0.01 μg/mL이고, GFE의 IC50 값은 87.91±0.91 μg/mL로 나타 났다(Table 1). 따라서 GFE는 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 나타내었고, 향후 연구에서는 GFE의 성분 분석을
Table 1. DPPH and ABTS radical scavenging activity of GFE Sample1) DPPH radical
(IC50, μg/mL) ABTS radical (IC50, μg/mL) L-Ascorbic acid
GFE2)
1.09±0.02 40.51±0.17
3.74±0.01 87.91±0.91
1)All values are mean±SD of three replications.
2)GFE: gardenia fruit 50% EtOH extract.
A B
C D E
F
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*** ***
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Fig. 1. Gross appearance of stomach tissues in HCl/ethanol-induced acute gastritic mice. The mice divided 5 groups were Nor, Con, SC, GL, and GH fasted for 24 hours. The Con, SC, GL, and GH were administered each sample, after 1 hour experimental groups except for Nor were orally administered with 0.55 mL of 150 mM HCl/60% ethanol (v/v) mixture. 1 hour later gastric tissue was harvested and took pictures. All values are mean±SEM (n=8). (A) Nor, normal mice; (B) Con, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of distilled water; (C) SC, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 10 mg/kg sucralfate; (D) GL, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 50 mg/kg gardenia fruit; (E) GH, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg gardenia fruit; (F) gastric mucosal injury area.
Significance: **P<0.01, ***P<0.001 vs. HCl/ethanol-induced acute gastritic mice.
통해 조금 더 세밀한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
위점막 보호 효과
HCl/에탄올은 급성위염 동물실험 모델에서 주로 사용되 며, HCl은 위 운동을 증가시켜 위를 자극하고 에탄올은 위점 막을 자극하여 산화적 스트레스를 일으킨다고 보고되어 있 어(23), 본 실험에서는 치자 추출물을 경구 투여한 뒤 HCl/
에탄올로 급성위염을 유발하여 평가하였다. 위점막을 육안 으로 관찰한 결과, 정상군은 점막의 손상이 나타나지 않았으 나 대조군은 HCl/에탄올 유발로 인하여 위점막에 손상을 받 아 발적, 출혈 및 부종이 뚜렷하게 나타났다. 반면 양성대조 군 SC투여군과 약물투여군인 GL투여군, GH투여군 모두 출 혈성 점막 손상이 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다.
위점막 손상도를 측정한 결과, 손상 부위 면적 비율은 정 상군(1.00±0.14)보다 대조군(26.07±3.36, P<0.001)이 매 우 높게 나타났다. 반면 양성대조군인 SC투여군(13.87±
1.26, P<0.001)은 대조군보다 유의성 있게 감소하였고, 또 한 GL투여군(15.88±2.57, P<0.01)과 GH투여군(13.14±
2.13, P<0.001) 모두 유의성 있는 감소를 나타냈다. 이전 연구 결과 HCl/에탄올은 위점막 손상을 일으키는 것으로 보 고되어 있으며(24), 이러한 위점막 손상을 양성대조군인 SC
투여군이 유의성 있게 감소시켰으나 GH투여군은 양성대조 군보다 더 높은 위점막 손상 개선 효과를 나타냈다(Fig. 1).
산화적 스트레스 바이오마커 변화
최근 연구에서 산화적 스트레스는 알코올에 의한 위염 모 델에서 손상을 일으키는 중요한 인자로 알려져 있다(25).
과도한 산화적 스트레스의 생성은 체내 세포의 손상을 발생 시키고 염증반응과 여러 질환 발생에 원인이 된다고 알려져 있다(26).
위 조직에서 산화적 스트레스 바이오마커인 ROS, ONOO- level을 측정하였다. 먼저 ROS를 측정한 결과, 정상군 (199,620±10,798 fluorescence/min/mg)보다 대조군 (257,878±19,362 fluorescence/min/mg, P<0.05)은 유의 성 있는 증가를 나타냈다. 양성대조군인 SC투여군(225,256
±6,785 fluorescence/min/mg)과 GL투여군(225,436±
30,788 fluorescence/min/mg), GH투여군(222,286±14,648 fluorescence/min/mg) 모두 대조군보다 유의성은 없으나 감소하는 경향을 나타냈다.
ONOO-를 측정한 결과 정상군(12,625±990 fluores- cence/mg, P<0.01)보다 대조군(19,153±2,993 fluores- cence/mg)은 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군보다 양 성대조군인 SC투여군(12,981±925 fluorescence/mg, P<
0.05)은 유의성 있는 감소를 나타냈고, 또한 GL투여군 (12,647±1,747 fluorescence/mg, P<0.01)과 GH투여군 (8,987±394 fluorescence/mg, P<0.001) 모두 유의성 있 는 감소를 나타냈다.
본 연구에서 GFE의 처치는 위 조직 내에서 산화적 스트 레스 바이오마커인 ROS와 ONOO- level을 감소시켰고, 특
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** * **
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Fig. 2. Effect of GFE on oxidative stress biomarker level of stomach tissues in HCl/ethanol-induced acute gastritic mice. All values are mean±SEM (n=8). Nor, normal mice; Con, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of distilled water;
SC, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 10 mg/kg sucralfate; GL, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 50 mg/kg gardenia fruit; GH, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg gardenia fruit. Significance: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. HCl/ethanol-induced acute gastritic mice.
히 GH투여군은 산화적 스트레스를 방어하는 효과가 탁월하 였으며, 위점막 손상을 억제하는 데 긍정적인 영향을 미치는 것으로 생각된다(Fig. 2).
위 조직에서의 항산화 인자 발현
ROS 소거에 관련된 항산화 활성은 전사인자인 Nrf-2와 항산화 효소인 HO-1, SOD, catalase와 GPx-1/2에 의해 조절되고 체내 과도한 ROS의 생성은 세포의 손상 및 데미지 를 입히는데, 그로 인해 항산화 인자들이 발현되어 저항하는 방어기전 역할을 한다(27,28).
위 조직에서 western blot을 실시하여 항산화 전사인자 인 Nrf-2의 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과 Nrf-2의 발현은 정상군(1.00±0.08)보다 대조군(0.37±0.05, P<0.001) 이 유의성 있는 감소를 나타냈다. 대조군보다 양성대조군인 SC투여군(0.80±0.09, P<0.001)은 유의성 있는 증가를 나 타냈었고, GL투여군(0.56±0.03, P<0.05)과 GH투여군(0.63
±0.05, P<0.01)은 농도 의존적으로 모두 유의성 있는 증가 를 나타냈다.
항산화 효소인 HO-1, catalase와 GPx-1/2의 단백질 발 현을 측정한 결과, 대조군보다 GFE 투여군에서 농도 의존적 으로 유의성 있는 증가를 나타냈다. 그리고 SOD의 경우 대 조군보다 GL투여군은 증가하는 경향만 나타냈으나 GH투여 군에서 유의성 있는 증가를 나타냈다.
항산화 활성 전사인자 Nrf-2의 발현 증가는 항산화 효소 들의 발현 증가를 통해 염증성 인자들을 막아주는 항염증 효과를 한다(29). 본 실험에서는 GFE의 투여가 농도 의존적 으로 위 조직 내에서 항산화 전사인자인 Nrf-2와 항산화 효소인 HO-1, SOD, catalase와 GPx-1/2를 모두 증가시켰 고, 이로 인해 HCl/에탄올로 유도된 급성위염 동물 모델에 서 GFE의 처치는 항산화 인자들의 발현을 증가시킴으로 위 점막 손상을 보호하는 역할을 하는 것으로 판단된다(Fig. 3).
위 조직에서의 염증성 인자 발현
최근 연구 결과에 따르면 산화적 스트레스의 증가는 NF- κBp65, IκBα와 같은 염증성 전사인자와 COX-2, TNF-α, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 유도하며, 분비 된 염증성 인자들은 염증반응을 일으켜 세포를 손상하는 원 인으로 알려져 있다(30,31). 염증반응에서 전사인자인 NF- κBp65는 면역기능을 조절하고 암과 질병의 발생에 관여하 는 중요한 역할을 하며, 염증반응으로 IκBα는 인산화되어 세포질 내에 존재하던 NF-κB를 핵 내로 이동시켜 염증성 매개인자 및 염증성 사이토카인의 발현을 유도한다(32).
Western blot을 통해 실험동물 위 조직에서 GFE의 경구 투여가 염증 매개인자의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과, 정상군보다 대조군에서 NF-κBp65의 발현과 IκBα의 인산 화를 유의성 있게(P<0.001) 증가시켰다. NF-κBp65의 단 백질 발현량은 대조군보다 약물 처리군인 GL투여군과 GH 투여군에서 각각 26%, 27%로 유의성 있게(P<0.01) 감소시 켰고, IκBα의 인산화 또한 25%, 28%로 모두 유의성 있게 (P<0.01) 농도 의존적으로 감소시켰다.
GFE의 투여가 위염 유발 실험동물의 위 조직 내에서 염 증성 사이토카인에 미치는 영향을 측정하기 위해 western blot을 통해 분석한 결과, 대조군은 정상군보다 COX-2, TNF-α와 IL-1β의 발현을 모두 유의성 있게(P<0.001) 증 가시켰다. 염증반응을 활성화하는 인자로 알려진 COX-2 (33)는 GFE의 투여로 인해 각각 27%, 31%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소시켰다. TNF-α와 IL-1β는 T세포의 분화 를 유도하며 염증반응을 증가시키는 염증성 사이토카인으 로 알려져 있다(34). GFE의 투여로 TNF-α의 발현을 각각 27%, 31%로 유의성 있게(P<0.001) 농도 의존적으로 감소 시켰으나, IL-1β의 발현을 GH투여군에서 25%로 유의성 있게(P<0.05) 감소시켰고 GL투여군은 15%로 유의성은 없 으나 감소시키는 경향을 나타냈다.
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Fig. 3. Effect of GFE on antioxidant enzyme of stomach tissues in HCl/ethanol-induced acute gastritic mice. All values are mean±SEM (n=8). Nor, normal mice; Con, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of distilled water; SC, HCl/ethanol-in- duced acute gastritic mice with the administration of 10 mg/kg sucralfate; GL, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 50 mg/kg gardenia fruit; GH, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg gardenia fruit. Significance: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. HCl/ethanol-induced acute gastritic mice.
본 실험에서 GFE의 투여는 HCl/에탄올로 유도된 급성위 염 동물 모델의 위 조직 내에서 염증성 인자들을 유의성 있 게 억제하였고, 그로 인해 GFE의 투여는 위점막 손상 보호 효과가 있다고 판단된다(Fig. 4).
요 약
본 연구는 150 mM HCl/60% 에탄올로 유도된 급성위염 동물 모델에서 치자 50% 에탄올 추출물(GFE)의 보호 효과 를 평가하기 위해 수행되었다. 치자 추출물은 DPPH, ABTS 자유라디칼 소거능 실험을 통해 평가한 결과, 높은 항산화 활성을 나타냈다. GFE의 항위염 효과를 평가하기 위해 ICR 마우스를 이용하였고, Nor(정상군), Con(대조군), SC투여
군(sucralfate 10 mg/kg 농도), GL투여군(치자 추출물 50 mg/kg 농도), GH투여군(치자 추출물 100 mg/kg 농도) 총 5군으로 나누어 실험을 진행하였다. 치자 추출물 투여 후 위점막을 육안으로 관찰한 결과, 점막 손상을 현저히 감소시 켰다. 위 조직에서 산화적 스트레스 바이오마커인 ROS와 ONOO-를 감소시켰다. 또한 위 조직을 western blot을 통해 분석한 결과, Nrf-2, HO-1, SOD, catalase 및 GPx-1/2 항산화 바이오마커들의 발현을 증가시켰으며, NF-κBp65, IκBα, COX-2, TNF-α 및 IL-1β 염증성 인자의 발현을 유 의하게 억제하였다. 따라서 치자 50% 에탄올 추출물의 투여 가 급성위염 동물실험 모델에서 위염 개선 효과가 있다고 사료된다.
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Fig. 4. Effect of GFE on inflammatory factors of stomach tissues in HCl/ethanol-induced acute gastritic mice. All values are mean±SEM (n=8). Nor, normal mice; Con, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of distilled water; SC, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 10 mg/kg sucralfate; GL, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 50 mg/kg gardenia fruit; GH, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg gardenia fruit. Significance: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. HCl/ethanol-induced acute gastritic mice.
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