Inhibitory Activities of Rehmanniae Radix 30% Ethanol Extract on Acute Gastritis and Peptic Ulcers

추출물의 급성위염 및 위궤양 억제 효과 30% ethanol

生地黃

배혜경^#, 서부일^*

대구한의대학교 대학원 한의학과

Inhibitory Activities of Rehmanniae Radix 30% Ethanol Extract on Acute Gastritis and Peptic Ulcers

Hye Kyung Bae ^# , Bu-Il Seo ^*

Departments of Korean Medicine, Graduate School of Daegu Haany University

ABSTRACT

Objective : This study was designed to evaluate the protective effect of Rehmanniae Radix Crudus (RC) in 150 mM HCl/ethanol induced acute gastritis mice.

Methods : ICR mice were divided into 5 groups (normal group, control group, 10 mg/kg sucralfate treated group, 50 mg/kg RC treated group, 100 mg/kg RC treated group, n=8). Normal group was not take any treatment. Control group induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water. 10 mg/kg sucralfate induced group was induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg. 50 mg/kg and 100 mg/kg RC treated groups were induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of RC 50 mg/kg and 100 mg/kg. After 1 hour of gastritis induction, removed the stomach tissue. We examined histological observations, oxidative stress biomarkers, antioxidant proteins, inflammatory mediators and cytokines.

Results : In this study, the RC treatment group showed gastritis and gastric ulcer inhibition, and the area of injury decreased. The oxidative stress biomarkers such as reactive oxygen species (ROS) and peroxy nitrite (ONOO

^-

) in the serum were reduced in the RC treated group. Inaddition, antioxidant proteins (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Heme oxygenase 1) were increased in RC treated group, and the expression of inflammatory mediators and cytokines induced by nuclear factor-kappa B activation was inhibited.

Conclusion : According to the results, RC may have an excellent inhibitory effect on acute gastritis and gastric ulcer. ¹⁾

Key words : Rehmanniae Radix Crudus, Gastritis, Anti-inflammatory effect, Oxidative stress

서 론 .

Ⅰ

위장 질환은 전 세계 인구 중 4~5% 가 한 번 이상 경험하 는 소화기 질환 중에서도 가장 흔한 질환이다

¹⁾

. 과거에는 중 년 이상의 연령층에서 주로 발병하였으나 문화의 발달 스트 , 레스 복잡한 사회생활 등 수 많은 요인이 원인이 되어 최근 , 에는 10 대까지 낮아지고 있는 추세이다

²⁾

. 소화기 질환 중 위 점막에 발생하는 염증성 질환을 통틀어 위염이라 하는데 위 ,

벽은 총 개의 층 점막층 점막하층 근육층 장막층 으로 이 4 ( , , , ) 루어져 있으며 위 점막이 손상된 경우를 위염이라 하고 두 , 번째 층 이상이 손상되어 점막하층이 드러난 경우를 위궤양이 라 한다

^{1, 3)}

.

급성위염은 위 점막에 염증이 일어나는 질환으로 불규칙 , 한 식사와 폭식 뜨겁거나 차가운 음식 부패한 음식물 섭취 , , 등으로 인해 야기되며 식욕부진 위부의 불쾌감 등의 상을 나 , 타내고 전신 권태를 느끼게 한다

^4-6)

. 위염의 원인으로는 위

*Corresponding author Bu Il Seo. Department of Korean Medicine, Daegu Haany University.： ·Tel : +82-53-819-1876. ·E-mail : [email protected]

#First author Hye Kyung Bae. Department of Korean Medicine, Daegu Haany University.： ·Tel : +82-53-819-1876. ·E-mail : [email protected]

·Received : 15 January 2019 ·Revised : 18 February 2019 ·Accepted : 25 March 2019

점막에 대한 공격인자와 방어인자 간의 균형이 깨짐으로써 나 타난다는 ‘balance theory’가 가장 설득력 있는 이론으로 받 아들여지고 있으며

⁷⁾

, 韓醫學 에서는 呑酸 吐酸 , , 嘈囃 , 懊恨 등의 內傷 의 諸轉變症 에서 원인 증상 치법 치방의 언급이 , . . 있다

⁸⁾

.

대표적인 위 점막 보호제로는 Sllen, Scralfate, Tprenone 이 있지만 두통 식욕부진 등과 같은 부작용이 나타나고 복 , 용량이 많다는 단점이 있어 개량된 약물의 개발이 필요한 것 으로 보이며

⁹⁾

, 위산 분비 억제 효능을 가진 위염 및 위궤양 치료제인 proton pump inhibitor (PPI) 류와 H2-receptor 는 충분히 그 효과를 입증하였지만 위장 장애를 antagonist

일으키거나 발진 두드러기 등의 부작용 뿐 아니라 위궤양 및 , 만성 난치성 위염에 대해서는 치료의 한계를 보이는 경우가

있다

^{11, 12)}

. 천연물은 현재 비교적 흔히 사용되고 있는 안전성

이 뛰어난 약물로 알려져 있으며 위염 및 위궤양의 원인을 , 차단하여 좋은 첨가제 또는 치료제로 쓰일 것이라 기대하고 있다

¹³⁾

.

地黃 ( Rehmannia glutinosa (Gaertner) Liboschitz) 은 현삼과 (Scrophulariaceae) 에 속하는 다년초로서 우리나라 , , 중국 및 일본 등 각지에서 재배된다 뿌리를 약용으로 하며 . ,

및 등으로 전통치료요법에 널리

,

造血作用 滋潤作用 消炎作用

사용되어 왔으며

¹⁴⁾

, 용도에 따라 韓醫學 에서는 뿌리의 생것을

쪄서 말린 것을 건조시킨 것을 이라

, ,

生地黃 熟地黃 乾地黃

한다

¹⁵⁾

. 생지황 및 건지황에는 stigmasterol, campesterol,



-sitosterol,

^

-butyl amino acid, fatty acids, catalpol, glucose, norcarotenoid, carbohydrate, rehmanin, stachyose,

등의 성분이 함유되어 있으며 숙지황에는

arginine , stachyose,

raffinose, mannotriose, sucrose, glucose, galactose, 등의 당류와

verbascose, fructose



-sitosterol, arginine, 등이 소량으로 함유되어 있 catalpol, vitamin A, mannitol

다고 보고되어 있다

¹⁶⁾

. 生地黃 은 현재 우리나라에서 건강기능 식품 소재의 부원료로 허가되어 있어 기능성 식품소재로써의 활용 가능성이 크다고 생각된다

¹⁵⁾

. 生地黃 은 항산화 및 대사 질환에 대한 효과가 보고되어 있으나

^{17, 18)}

, 항염증 효과에 대 한 연구는 보고된 바가 없었기에 본 연구를 시작하게 되었다.

본 연구에서는 生地黃 이 HCl/Ethanol 으로 유발된 급성 위 염에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 生地黃 추출물 을 투여하고 시간 뒤 1 , 150 mM HCl/60% ethanol 를 사용하 여 급성 위염을 유발하였고 유발 시간 후 위 조직을 적출하 , 1 였다 육안적 위 손상도 측정 혈액 내 산화적 스트레스 바이 . , 오마커 변화를 확인하였고 염증 , cytokine 및 매개인자 측정 , 항산화인자를 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하 는 바이다.

재료 및 방법 .

Ⅱ

재료 1.

약재 1)

본 실험에 사용되어진 生地黃 한국산 은 한우리약초 서 ( ) ( 울 한국 에서 구입하여 사용하였다 약재는 , ) . 300 g 을 건조시

켜 69.2 g을 얻었으며 약재 , 69.2 g 에 30% ethanol 10 배 용 량을 가하여 24 시간 동안 추출한 후 , 감압농축기 (Buchi

로 농축하여 파우더

B-4580, Switzerland) 29.12 g 수율 (

을 얻었다 파우더는 사용하기 직전까지 냉동

42.08%) . 生地黃 보관 (-80 ) ℃ 하였다 .

시약 2)

본 실험에 사용된 (DPPH) 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, (ABTS) 7 mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulphonic acid), Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, sodium carbonate, diethylene glycol, gallic acid, naringin, sodium hydroxide, potassium phosphate dibasic,

은

potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich Co.

에서 구입하여 사용하였다

(St. Louis, MO, USA) . Nitrocellulose 은

membranes Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, 에서 구입하여 사용하였고

UK) , (Nrf2) nuclear factor erythroid 2-related factor 2, (HO-1) heme oxygenase-1, (SOD) super oxide dismutase, (NF-

^

Bp65) phosphorylation of nuclear factor-kappa B p65, (COX-2) cyclooxygenase-2, (iNOS) inducible nitric oxide synthase, (TNF-

^

) tumor 과 necrosis factor-alpha, (IL-6) interleukin-6, histone



-actin 은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, 로부터 구입하였다

USA) . Rabbit lgG antibody, Mouse lgG 인 차 항체는

antibody 2 GeneTex, Inc. (San Antonio, TX, 에서 구입하여 사용하였다 또한

USA) . DMSO, Protease

inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan) 에서 구입하여 실험에 사용하였다. 2', 7'Dichlorofluorescein

와 는

diacetate (DCFH-DA) Dihydrorhodamine 123 Molecular 에서

Probes (Eugene, OR, U.S.A.) , Sucrose octasulfate- 는

aluminum complex (Sucralfate) Sigma aldrich (St.

로부터 구입하여 사용하였다 단백질 정량

Louis, MO, USA) .

을 위한 BCA protein assay kit 는 Thermo Scientific ( Rockford, IL, USA) 에서 구입하였고 , ECL Western Blotting

는 에서 구입하여 사용

Detection Reagents GE Healthcare 하였다.

동물 3)

주령 수컷 마우스 마리를 오리엔트 경기 한국 에

6 ICR 40 ( , )

서 구입하였으며 실험실 환경에 일간 적응시킨 후 실험을 , 7 진행하였다 동물 사육실은 . conventional system 으로 운영 되어 온도 22±2 , ℃ 습도 50±5%, 명암주기 (light : dark

는 시간 주기로 조절되도록 설정하였다 사료 조단

cycle) 12 . (

백질 18% 이상 조지방 , 5.0% 이상 조회분 , 8.0% 이하 , 0.85%

이상 칼슘 , 1.0% 이상 조섬유 , 5.0% 이하 칼륨 , 0.55% 이상 , 나트륨 0.25% 이상 마그네슘 , 0.15% 이상 , NIH-41, Zeigler 와 물을 충분히 공급하였다 그리고 동물실

Bros, Inc. (USA) .

험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회 (Institutional

의 승인 승인

Animal Care and Use Committee : IACUC) (

번호 :2018-071) 을 받아 진행하였으며 효율적인 관리 및 윤 ,

리적 과학적 타당성 검토를 위하여 동물관리 규정을 준수하 ,

였다.

방법 2.

함량 측정 1) Total polyphenol, Total flavonoid

폴리페놀 함량은 법

Total Folin-Denis

¹⁹⁾

을 이용하여 측 정하였다 각 시료 . 10 ㎕ (100 / ) ㎎ ㎖ 과 DW 790 ㎕ 및 Folin- Ciocalteau’ s phenol reagent 50 ㎕ 를 혼합한 뒤 , 1 분간 실 온에서 반응시킨 다음 , 20% sodium carbonate 150 ㎕ 를 더 하여 실온에서 시간 반응시키고 2 UV 분광광도계 (spectro- photometer) (Infinite M200, Tecan, Salzburg, Austria)

에서 흡광도를 측정하였다 를 사용하여 표

765 ㎚ . gallic acid

준 검량선을 구하였으며 시료추출물의 총 페놀 함량을 산출 , 하였다.

플라보노이드 함량은 등

Total Lister

²⁰⁾

의 방법을 이용하 여 측정하였다 추출한 시료 . 100 ㎕ (11.1 / ) ㎎ ㎖ 에 diethylene

및 를 혼합하여 에서 시간

glycol 1 ㎖ 1N NaOH 10 ㎕ 37 ℃ 1 동안 차광하여 방치한 후 UV 분광광도계 420 ㎚ 에서 흡광도 를 측정하였다 표준물질 . naringin 를 사용하여 표준 검량선 을 구하였으며 시료추출물의 총 플라보노이드 함량을 산출하 , 였다.

라디칼 소거 활성 측정 2) DPPH

추출한 시료의 자유 라디칼 소거능 측정을 위해 DPPH 소거법

free radical

²¹⁾

을 이용하였다 시료 . 100 ㎕ 와 Ethanol 에 녹인 60 mM DPPH 용액을 100 ㎕ 넣어 혼합한 후 실온 , 에서 차광하여 30 분간 반응시키고 UV 분광광도계 540 ㎚ 에 서 흡광도를 측정하였다 전자공여능은 아래의 식에 의해 계 . 산하였다.

DPPH Radical scavenging activity (%)

= {(OD

control

OD –

sample

)/OD

control

}×100

OD

control

: 시료가 들어가지 않은 경우의 흡광도

OD

sample

: 시료가 들어간 경우의 흡광도

라디칼 소거 활성 측정 3) ABTS

추출한 시료의 항산화능을 알아보기 위해 ABTS 자유 라디칼 소거능을 측정하였다 . 7 mM ABTS 와 2.45 mM potassium

를 에 녹인 다음 실온의 암소 상태에서 약

persulfate DW 18

시간 이상 방치하여 ABTS+ 을 형성 시킨 후 이 반응액을 ,

에서 에탄올을 이용하여 흡광도 로 보정하

415 ㎚ 0.70±0.02

였다 보정한 용액 . 95 ㎕ 와 시료 5 ㎕ 를 첨가하고 암소상태 에서 15 분 동안 반응시킨 후 UV 분광광도계 415 ㎚ 에서 흡 광도를 측정하였다 전자공여능은 아래의 식에 의해 계산하 . 였다.

ABTS Radical scavenging activity (%)

= {(OD

control

OD –

sample

)/OD

control

}×100

OD

control

: 시료가 들어가지 않은 경우의 흡광도

OD

sample

: 시료가 들어간 경우의 흡광도

위 점막 손상 유발 및 동물 처치 4)

실험 전 날까지 충분한 고형사료와 물을 공급하였고 , 24 시 간 동안 절식시킨 뒤 실험을 진행하였다 실험군은 아무런 . 처치를 하지 않은 정상군 (Nor), 증류수 경구 투여 시간 후 1 위염을 유발한 대조군 (Veh), 양성대조군인 sucralfate 를 10 으로 경구 투여한 뒤 시간 후 위염을

mg/kg body weight 1

유발한 양성대조군 (SC), 生地黃 을 50 mg/kg body weight 으로 경구 투여한 뒤 시간 후 위염을 유발한 군 1 (RL), 生地 을 100 mg/kg body weight 으로 경구 투여한 뒤 시간 후 1 黃

위염을 유발한 군 (RH) 으로 군당 마리씩 그룹으로 구분하 8 5 여 실험을 실시하였다 . 위염 유발은 150 mM HCl/60%

을 각 씩 경구 투여하여 유발하였으며 시간

ethanol 0.55 ㎖ , 1

뒤 isoflurane (Sigma Aldrich) 으로 흡입 마취하여 희생한 뒤 위 조직을 적출하였다.

실험군은 각 군별로 마리씩 군으로 나누었다 8 5 .

① 정상군 (Nor)： 아무런 처치를 하지 않은 정상군

② 대조군 (Veh) ： 증류수를 경구 투여한 뒤 시간 후 위염 1 을 유발한 대조군

③ sucralfate 투여군 (SC) sucralfate 10 mg/kg body ： 으로 경구 투여한 뒤 시간 후 위염을 유발한 군

weight 1

④ 生地黃 50 ㎎ ㎏ / 투여군 (RL) ： 生地黃 을 50 mg/kg 으로 경구 투여한 뒤 시간 후 위염을 유

body weight 1

발한 군

⑤ 生地黃 100 / ㎎ ㎏ 투여군 (RH) ： 生地黃 을 100 mg/kg 으로 경구 투여한 뒤 시간 후 위염을 유

body weight 1

발한 군

조직학적 관찰 5)

위 조직을 적출한 뒤 광학 디지털 카메라 , (DSCHX50V, 를 이용하여 촬영하였다 위 점막의 손

Sony, Tokyo, Japan) .

상도는 I-Solution lite (Innerview Co., Gyeonggido, 프로그램을 이용하여 측정하였으며 위 손상 부위의

Korea) ,

면적을 측정한 후 위 전체 면적과 비교하여 정상군에 대한 , 손상정도의 비율로 표시하였다.

산화적 스트레스 바이오마커 측정 6)

산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS (Reactive Oxygen 측정은 혈청을

Species) 25 mM 2',7'-dichlorofluorescein 와 혼합시켜준 뒤 형광 광도계를 이용 diacetate (DCF-DA) ,

하여 emission 파장 535 ㎚ 와 excitation 파장 485 ㎚ 에서 분부터 분 간격으로 분간 측정하여 산출된 값을 계산하

0 5 40

였다.

ONOO

^-

는 혈청과 DHR123 buffer (rhodamin buffer, 5

를 혼합한 후 에서 분간

mM DTPA, 10mM DHR123) , 37 ℃ 5

교반해주었다 그 다음 형광 광도계를 이용하여 . emission 파

장 535 ㎚ 와 excitation 파장 485 ㎚ 에서 분부터 분 간격 0 5

으로 40 분간 측정하여 산출된 값을 계산하였다 . ROS 및

ONOO

^-

의 실험방법은 Ali et al

²²⁾

과 Kooy et al

²³⁾

의 방법을

이용하여 시행하였다.

단백질 발현량 분석 7)

위의 세포질 내 단백질을 측정하기 위해 위 조직을 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM MgCl

2

, 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM CaCl

2

, 0.1 M DTT, 1.5 M sucrose, 0.1

을 첨가한 를

M DTT, protease inhibitor cocktail buffer A 넣고 조직 분쇄기 (tissue grinder) (Biospec Product,

로 분쇄한 후 분 뒤

Bartlesville, OK, USA) 30 10% NP-40 용액을 첨가하였다 그 후 . 4 ℃ 에서 분간 2 12,000 rpm 으로 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.

핵 내 단백질을 측정하기 위해 10% NP-40 가 더해진 buffer 에 세 번 헹구고 의

A 150 ㎍ buffer C (50 mM HEPES, 0.3 mM NaCl, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1

를 첨가한 다음 재부유시킨 후

mM PMSF, 10% glycerol) 10

분마다 vortex 를 번 하였다 3 . 4 ℃ 에서 10 분간 12,000 rpm 으로 원심 분리 한 뒤 핵을 포함하고 있는 상층액을 분리하 , 여 실험 전까지 − 80 ℃ 에서 각각 냉동 보관하였다 위 조직 . 세포질의 HO-1, SOD, COX-2, iNOS, TNF-



, IL-6,



단백질과 핵에서의

-actin Nrf2, NF-

^

Bp65, histone 단백 질의 발현량을 측정하기 위하여 8-12 ㎍ 의 단백질을 10-

을 이용하여 전기연동 후 14% SDS polyacrylamide gel ,

을 으로 이동시켰

acrylamide gel nitrocellulose membrane

다 . membrane 을 준비한 뒤에 각각의 차 1 antibody 를 처리 하여 4 ℃ 에서 overnight 시킨 다음 PBS-T 로 분마다 회 8 6 세척하고 각각 처리한 차 항체에 알맞은 차 항체 , 1 2 (PBS-T 로 1:3000 으로 희석해서 사용 를 사용하여 상온에서 시간 ) 2 반응시킨 후 , PBS-T 로 분마다 회 세척하였다 그리고 8 8 .

을 용액에

membrane enhanced chemiluminescence (ECL) 담구어 묻혀준 뒤, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci

에 감광시켜 단백질 발현 정도를 Co., Ltd., Seoul, Korea)

확인하였다 그 후 발현된 . , band 를 ATTO Densitograph 프로그램을 Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)

이용하여 정량하여 수치화 하였다.

통계분석 8)

In vitro 의 결과 값은 평균과 표준편차로 나타내었으며, in vivo 의 결과 값은 평균과 표준오차로 나타내었다. SPSS program for windows version 25 (SPSS Inc., Chicago,

를 사용하여

USA) one-way analysis of variance (ANOVA) 와 Student T test 로 각 자료의 통계적 유의성을 검증하였다 . 대조군과 투여군 사이에 p -value < 0.05 일 때 유의성이 있 는 것으로 판정하였다.

결 과 .

Ⅲ

및 함량

1. Total polyphenol Total flavonoid 측정

추출물의 폴리페놀 및 플

30% ethanol total total 生地黃

라보노이드 함량을 측정한 결과 , total 폴리페놀의 함량은

으로 나타났으며 플라보노이드 함량

3.69±0.02 /g ㎎ , total

은 1.50±0.07 /g ㎎ 으로 나타났다 . total 폴리페놀은 gallic

플라보노이드는 을 표준물질로

acid, total naringin standard 를 작성하여 값을 산출하였다

curve (Table 1).

Sample Content ( /g)㎎

Total phenol Total flavonoid Rehmannia Radix 3.69±0.02 1.50±0.07 The results are expressed the mean±SD

Table 1. Total Polyphenol and Flavonoid Content of Ethanol Extract from Rehmannia Radix

소거능 측정 2. DPPH free radical

소거법을 이용하여 추출한 시료의

DPPH free radical free

소거능을 측정하였으며 대조군으로는

radical , L-ascorbic

를 사용하였다 실험 결과 대조군인 의

acid . , L-ascorbic acid

IC

50

값은 1.43±0.04 ㎍ ㎖ / 로 나타났으며 , 生地黃 30%

추출물의

ethanol IC

50

값은 524.43±4.14 / ㎍ ㎖ 으로 나타났 다 (Table 2).

Concentration ( / )㎍ ㎖ L-ascorbic acid Rehmannia Radix DPPH (IC50) 1.43±0.04 524.43±4.14 The results are expressed the mean±SD

Table 2. Scavenging Activity of Ethanol Extract from Rehmannia Radix on DPPH Free Radicals

소거능 측정 3. ABTS free radical

추출한 시료의 항산화능을 알아보기 위해 ABTS free 소거능을 측정하였으며 대조군으로는

radical , L-ascorbic

를 사용하였다 대조군인 의

acid . L-ascorbic acid IC

50

값은

으로 나타났으며 추

3.71±0.03 / ㎍ ㎖ , 生地黃 30% ethanol 출물의 IC

50

값은 700.54±4.68 / ㎍ ㎖ 으로 나타났다 (Table 3).

Concentration ( / )㎍ ㎖ L-ascorbic acid Rehmannia Radix ABTS (IC50) 3.41±0.03 700.54±4.68 The results are expressed the mean±SD

Table 3. Scavenging Activity of Ethanol Extract from Rehmannia Radix on ABTS Free Radicals

위 점막 손상도 변화 4.

위 점막 손상 정도를 육안적으로 관찰한 결과, 150 mM 로 위염을 유발한 대조군은 선명한 점막손 HCl/60% ethanol

상과 출혈이 관찰되었으며 生地黃 투여군에서 손상부위가 뚜 렷하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 정상군 1.0

대조군 투여군

±0.2 (AU), 107.4±18.4 (AU), Sucralfate 투여군

76.1±9.5 (AU), 生地黃 50 mg/kg 38.7±6.0 ( AU),

투여군 로 나타났다

100 mg/kg 24.4±3.4 (AU) . 生地黃

투여군에서는 대조군에 비하여 유의성 50 mg/kg

生地黃

있게 감소 ( p <0.01) 하였으며 , 生地黃 100 mg/kg 투여군에

서도 대조군에 비해 유의성 있게 감소 ( p <0.001) 하였다 (Fig. 2).

0 25 50 75 100 125 150

Nor Veh SC RL RH

G as tr ic le si on a re a (A U )

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

***

***

**

Fig. 2. Optical change stomach tissues of HCl/ethanol-induced acute gastritis mice.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: **p<0.01, ***p<0.001 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg.

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

혈액 내 산화적 스트레스 바이오마커 변화 5.

1) ROS

혈청 내 ROS 생성량은 정상군 19644±3431, 대조군 투여군

81,006±6,810, Sucralfate 60,191±3,890, 生地黃

투여군 투여

50 mg/kg 57,827±5,106, 生地黃 100 mg/kg 군 50,389±9,656 로 나타났다 .

정상군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.001) 하였으며 , Sucralfate 투여군 , 生地黃 50 mg/kg 투여군 , 生 투여군에서 또한 대조군에 비하여 유의성 100 mg/kg

地黃

있게 감소 ( p <0.05) 하였다 (Fig. 3).

0 40000 80000 120000

Nor Veh SC RL RH

R O S (f lu or es ce nc e/ m in /m L )

***

* * *

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

Fig. 3. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the ROS level in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

Nor Veh

SC RL RH

Fig. 1. Effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the gross lesions in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg.

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05, ***p<0.001 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg.

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

2) ONOO

^-

혈청 내 ONOO

^-

생성량은 정상군 9,373±369, 대조군 투여군

11,629±465, Sucralfate 10,591±526, 生地黃 50

투여군 투여군

mg/kg 9,872±528, 生地黃 100 mg/kg 로 나타났다

9,584±219 .

정상군과 生地黃 100 mg/kg 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.01) 하였으며 , 生地黃 50 mg/kg 투여 군에도 대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.05) 하였다 (Fig. 4).

0 2500 5000 7500 10000 12500 15000

Nor Veh SC RL RH

O N O O

-

(f lu or es ce nc e/ m L ) ** *

**

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

Fig. 4. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the ONOO- level in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05, **p<0.01 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

항산화 단백질 분석 6.

1) Nrf2

위 조직에서 western blot 을 실시 후 측정한 결과 Nrf2 의 발현은 정상군 1.00±0.11, 대조군 0.81±0.10, Sucralfate 투여군 0.89±0.12, 生地黃 50 mg/kg 투여군 1.00±0.12,

투여군 로 나타나

100 mg/kg 1.13±0.10

生地黃 生地黃

투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 증가 100 mg/kg

( p <0.01) 되었다 (Fig. 5).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC RL RH

N rf 2 (f ol d of N )

Nrf2 Histone

**

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

Fig. 5. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the Nrf2 protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: **p<0.01 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

2) HO-1

위 조직에서 western blot 을 실시 후 측정한 결과 HO-1 의 발현은 정상군 1.00±0.13, 대조군 0.67±0.08, Sucralfate 투여군 0.77±0.08, 生地黃 50 mg/kg 투여군 0.91±0.09,

투여군 로 나타나 정상군과

100 mg/kg 1.14±0.09 生地黃

투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 100 mg/kg

生地黃

증가 ( p <0.05) 되었다 (Fig. 6).

b-Actin HO-1

0.0 0.5 1.0 1.5

Nor Veh SC RL RH

H O -1 ( fo ld o f N )

* *

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

Fig. 6. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the HO-1 protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

3) SOD

위 조직에서 western blot 을 실시 후 측정한 결과 SOD 의 발현은 정상군 1.00±0.11, 대조군 0.92±0.03, Sucralfate 투여군 1.34±0.04, 生地黃 50 mg/kg 투여군 1.10±0.09,

투여군 로 나타나

100 mg/kg 0.98±0.10 Sucralfate 生地黃

투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 증가 ( p <0.05) 되었 다 (Fig. 7).

b-Actin SOD

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC RL RH

SO D ( fo ld o f N )

*

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

Fig. 7. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the SOD protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

염증성 전사인자에 미치는 영향 7.

1) NF-



Bp65

위 조직에서 western blot 을 실시 후 측정한 결과 NF-



Bp65 의 발현은 정상군 1.00±0.12, 대조군 1.66±0.10,

투여군 투여군

Sucralfate 1.32±0.10, 生地黃 50 mg/kg

투여군 로 나타

1.36±0.06, 生地黃 100 mg/kg 1.29±0.07 나 Sucralfate 투여군과 生地黃 50 mg/kg 투여군에서 대조

군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.05) 하였으며 정상군과 , 투여군에서 또한 대조군에 비하여 유의성 100 mg/kg

生地黃

있게 감소 ( p <0.01) 하였다 (Fig. 8).

Histone NF-kBp65

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC RL RH

N F- kB p6 5 (f ol d of N )

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

**

* * **

Fig. 8. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the NF-Bp65 protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05, **p<0.01 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

염증성 발현에 미치는 영향

8. cytokine

1) COX-2

위 조직에서 western blot 을 측정한 결과 COX-2 의 발현 량은 정상군 0.93±0.04, 대조군 2.19±0.27, Sucralfate 투여군 2.20±0.27, 生地黃 50 mg/kg 투여군 1.63±0.26,

투여군 로 나타나 정상군에서

100 mg/kg 1.49±0.26 生地黃

대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.001) 하였으며 , 生地 투여군에서 또한 대조군에 비하여 유의성 있 100 mg/kg

黃

게 감소 ( p <0.05) 되었다 (Fig. 9).

b-Actin COX-2

0.0 1.0 2.0 3.0

Nor Veh SC RL RH

C O X -2 ( fo ld o f N )

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

***

*

Fig. 9. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the COX-2 protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05, ***p<0.001 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

2) iNOS

위 조직에서 western blot 을 실시 후 측정한 결과 iNOS 의 발현은 정상군 1.00±0.12, 대조군 2.49±0.43, Sucralfate 투여군 2.49±0.45, 生地黃 50 mg/kg 투여군 1.67±0.44,

투여군 로 나타나 정상군에서

100 mg/kg 1.49±0.46 生地黃

대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.01) 하였으며 , 生地黃 투여군에서 또한 대조군에 비하여 유의성 있게 100 mg/kg

감소 ( p <0.05) 되었다 (Fig. 10).

b-Actin iNOS

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

Nor Veh SC RL RH

iN O S (f ol d of N )

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

**

*

Fig. 10. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the iNOS protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: *p<0.05, **p<0.01 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

3) TNF-



위 조직에서 western blot 을 실시 후 TNF-



의 발현량 을 확인한 결과 정상군 1.00±0.24, 대조군 3.15±0.44,

투여군 투여군

Sucralfate 3.36±0.50, 生地黃 50 mg/kg

투여군 로 나타

2.41±0.51, 生地黃 100 mg/kg 1.72±0.51 나 정상군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.001) 하였으며 , 生地黃 100 mg/kg 투여군에서 또한 대조군에 비

하여 유의성 있게 감소 ( p <0.01) 되었다 (Fig. 11).

b-Actin TNF-a

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

Nor Veh SC RL RH

T N F- a (f ol d of N )

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

***

**

Fig. 11. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the TNF-α protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: **p<0.01, ***p<0.001 vs. HCl/ethanol induced gastritis mice by Student T test

Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

4) IL-6

위 조직에서 western blot 을 실시 후 측정한 결과 IL-6 의 발현은 정상군 0.72±0.06, 대조군 4.98±0.28, Sucralfate 투여군 4.58±0.32, 生地黃 50 mg/kg 투여군 4.34±0.34,

투여군 로 나타나 정상군에서

100 mg/kg 3.58±0.33 生地黃

대조군에 비하여 유의성 있게 감소 ( p <0.001) 되었다 (Fig.

12).

IL-6 b-Actin

0.0 2.0 4.0 6.0

Nor Veh SC RL RH

IL -6 ( fo ld o f N )

***

HCl/Ethanol-induced Acute gastritis mice

Fig. 12. The effects of ethanol extract from Rehmannia Radix on the IL-6 protein expression in HCl/ethanol induced gastritis animal model.

All data are expressed means±S.E, n=8 mice per group.

Significance: ***p<0.001 vs. HCl/ethanol induced gastritis

mice by Student T test Nor; Normal mice

Veh; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled water

SC; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of sucralfate 10 mg/kg

RL; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 50 mg/kg

RH; induced gastritis 1 hour after ingestion of distilled of ethanol extract from Rehmannia Radix 100 mg/kg

고 찰 .

Ⅳ

위의 상피 내막에 발생되는 염증을 위염이라 하며 가장 흔 , 한 증상으로는 상부 중앙 복부 통증과 메스꺼움 구토 트림 , , , 및 체중 감소 등이 보고되었다

²⁴⁾

. 위염과 관련된 한의 병증 및 증상은 胃脘痛 , 嘈 雜 吐血 , 등이 주요하고 , 胃脹 胃 , 癉 , 胃

등이 있다 급성 위염의 병위는 . , , , 와 관련이

絡痛 胃 膽 肝 脾

깊으며 병기는 , 外邪犯胃 脾胃虛弱 , 등으로 인해 胃失和降 , 하게 되어 발생한다

胃絡失養

²⁵⁾

. 위염 및 위궤양은 하나의 원

인이 아닌 여러 인자들이 복합적으로 작용하여 발병하며 위 , 점막에 염증이 일어나는 급성위염은 술이나 폭식 뜨겁거나 , 차거나 부패한 음식의 섭취 불규칙한 식사 등으로 인하여 위 , 점막에 염증이 야기된다

²⁶⁾

. 또한 일반적으로 과도한 알코올 , 섭취 스트레스 및 비스테로이드성 항염증제 , (NSAIDs) 를 장 기간 사용함으로써 유발되며 이러한 외부 자극은 위장의 손 , 상을 일으켜 그 결과로 위산 분비가 증가하게 되어 위 점막을 손상시킨다

²⁴⁾

. 위산 분비의 대표적인 경로로는 histamine 에 의해 histamine 2 receptor (H2r) 가 발현되는 경우 ,

에 의해

acetylcholine muscarinic acetylcholine receptor 가 활성화 되는 경우 에 의한

M3 (M3r) , gastrin cholecystokinin 의 활성화 등이 있는데 위벽세포에서 2 receptor (CCK2r) .

자극에 의하여 acetylcholine, histamine, gastrin H2r,

및 등이 활성화되면서 세포 내의 와

M3r CCK2r AMP Ca2+

농도가 증가시키고 세포막에 존재하는 proton pump 인 를 활성화시킨다 이로 인해 분비가 증

H+/K+ATPase . HCl

가되면서 위 점막의 손상에 관여하는 것으로 알려져 있다

27-29)

현재 시중에서 사용되고 있는 위염 위궤양 치료제로는

. ･

액의 소화력을 저하시키는 항펩신제 , 위액을 중화시키는 CaCO

3

, NaHCO

3

, Al(OH)

3

, MgO 및 위액의 분비를 억제시 키는 점막 마취제 항가스트린제 항콜린제 , , , H2-receptor antagonist, muscarine receptor antagonist, H+/K+-

등이 있다

ATPase inhibitor (PPIs)

³⁰⁾

. 그러나 H2-receptor 제제 투여로 장기간 위산 분비가 억제됨으로 점막 antagonist

방어기전이 약화되어 궤양이 재발하는 부작용이 발견되었고

³¹⁾

, 제제 역시 장기간 투여 할 경우 H+/K+-ATPase inhibitor

위산 분비가 억제되어 gastrin 분비가 증가하게 되고 이차적 으로 장크롬 친화성 세포에 작용하여 산 분비가 더욱 증가된 다고 보고되었다

^{32, 34)}

. 최근 천연물은 항균 항암효과 항돌연 , , 변이 항산화 등과 같은 생리활성이 있는 자원으로 주목받고 , 있으며 각종 성인병 및 노화촉진의 주된 원인인 활성산소종 ,

과 자유라디칼 과의

(reactive oxygen species) (free adical) 유의한 관련성이 알려지면서 흔히 볼 수 있는 생약재에는 여

러 가지 뛰어난 항산화 물질들이 존재하는 것으로 보고되고 있다

³⁵⁾

.

은 ( 현삼과 : Scrophulariaceae) 에 속하는 다 生地黃 玄蔘科

년생 초본인 지황 ( Rehmannia glutinosa ) 의 신선한 뿌리 로 , 性味 는 寒 甘苦 無毒 , , 하고 歸經 은 心 肝 腎 , , 의 3 經 이다 . 생지황의 차가운 성질은 열을 내려 혈액을 식히며 진액을 생 성하여 갈증을 멈추게 하는 消渴 작용을 하고, 淸熱生津 凉血 ,

하여 , , , 등을 치료하는 약

止血 熱病傷陰 吐血 衄 血 咽喉腫痛

으로 쓰여졌으며 한방에서 , 六味地黃丸 瓊玉膏 十全大補湯 , , 등의 처방에 사용되고 있다.

17, 36, 37)

. 地黃 은 生地黃 乾地黃 , 및 熟地黃 등으로 분류되어 있고 각각의 약리적 활성 또한 , 차이를 보이고 있으며 종류에 따라 임상활용을 달리하여 왔 ,

다

^{38, 39)}

. 특히 生地黃 은 地黃 중 약성이 가장 찬 약물이고 消

이 강한 것으로 알려져 있으며 , 및

炎作用 滋潤作用 造血作用

등 보음제로써 널리 사용되어 왔다

¹⁴⁾

. 또한 , iridoid glycoside, 성 물질

amino acid, carbohydrate, phenol , monoterpene 등의 성분을 함유하며 생지황의 지표성분인 , catalpol 은 iridoid 배당체로 당뇨병 신경변성질환 신장병 등의 질병 치료에 사 , , 용되고 , aucubin 은 항산화 항염증 간보호 효과가 있다고 , , 알려져 있다

^{40, 42)}

. 면역생물학적 효과 및 항염증효과에 있어 서 지황은 생쥐의 신경교성세포에 의한 TNF- α 및 IL-1 의 분비를 억제하였으며

⁴³⁾

, PGE2 생산에 관여하는 백혈구의

활성을 억제하였다

cyclooxygenase

⁴⁴⁾

. 또한 , 地黃 의 catalpol 은 당뇨 모델 쥐에서 혈중 글루코스의 농도를 낮추는 효과가 보고되어 당뇨 치료에 있어 효과적인 물질로 사용되어 왔으 며 운동으로 인한 골격근에서의 , AMPK 활성 , IL-6 분비으 로 인한 대사적 개선 효과가 있음이 밝혀져 있다

⁴⁵⁾

.

이와 같이 生地黃 은 항산화효과

⁴⁶⁾

, 대사성질환에 대한 효 과

⁴⁷⁾

, 항염증효과 및 면역반응 조절

⁴⁸⁾

등의 효과를 가지고 있 음이 확인되어 있으므로 항염증 및 면역반응과 관련이 깊은 , 위염에 효과가 있을 것으로 예상된다 이에 본 연구에서는 . 生

을 경구 투여 한 후 , 150 mM HCl/60% ethanol 로 유발 地黃

된 급성 위염 동물모델에서 위 조직을 적출하여 육안적 위 손 상도 측정 혈액 내 산화적 스트레스 바이오마커 변화를 확인 , 하였고 염증 , cytokine 및 매개인자 측정 항산화 관련 단백 , 질 변화에 대해 알아보고자 하였다.

추출물의 항산화 활성을 평가하기 위 30% ethanol

生地黃

하여 , DPPH 및 ABTS 라디칼 소거법을 활용하여 측정하였 다 . DPPH 라디칼 소거능은 추출물의 항산화 물질로부터

라디칼이 얻은 전자 혹은 수소가 반응하여 환원됨으로 DPPH

써 짙은 보라색이 탈색되어 흡광도가 감소하는 원리를 이용한 측정방법으로 항산화 활성을 비교적 빠르게 평가할 수 있 어 ㅌ 널리 이용되고 있는 방법이다

⁴⁹⁾

. ABTS 라디칼 소거법은 와 시간 동안 반응시켜 생성된 potassium persulfate 24

라디칼이 추출물의 항산화 물질에 의해 제거되어 청 ABTS+

록색이 탈색되는 원리를 이용한 방법이다 . DPPH 라디칼 소 거법은 유리라디칼이 소거되는 반면에 ABTS 라디칼 소거법 은 양이온 라디칼이 제거되는 원리는 이용한다

⁵⁰⁾

. 生地黃

추출물 와 라디칼 소거능을 측정

30% ethanol DPPH ABTS

한 결과 , DPPH 라디칼 소거능의 IC

50

값은 524.43±4.14 ㎍ 로 나타났으며 라디칼 소거능의

/ ㎖ ABTS IC

50

값은 700.54

로 나타났다

±4.68 / ㎍ ㎖ (Table 1).

폴리페놀성 화합물은 식물에 널리 분포하는 차 대사산물 2 중 하나로써 다양한 분자구조를 가진다 폴리페놀성 화합물은 .

기를 가지기 때문에 단백질 등 거대 phenolic hydroxyl (OH)

분자들과 결합하며 항산화 및 항암 등 다양한 생리활성을 가 , 지는 것으로 알려져 있다 이 중 플라보노이드류 화합물은 . 2 개의 방향족 고리를 포함한 개의 링을 가지는 구조 3 (C6-

로 각 링의 내부 작용기에 의해 항산화 활성을 가지 C3-C6)

며 항산화제로서의 역할뿐만 아니라 항균 항알레르기 및 항 , , 균 등의 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다

⁵¹⁾

. 生地黃 30%

추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량을 측 ethanol

정해 본 결과 총 폴리페놀의 함량은 , 3.69±0.02 /g ㎎ 로 나 타났으며 총 플라보노이드 함량은 , 1.50±0.07 /g ㎎ 로 나타 났다 (Table 2).

본 실험에서는 HCl/ethanol 을 이용하여 급성 위염을 유발 시켰으며 , ethanol 은 위 점막을 자극하여 점막 손상 및 출혈 을 일으키는 역할을 한다 또한 . , HCl 은 위 운동을 증가시켜 위염을 더욱 악화시키는 역할을 하는 것으로 보고되어있다

⁵²⁾

.

추출물을 경구 투여한 뒤

30% ethanol HCl/ethanol

生地黃

을 이용하여 급성위염을 유발하였으며 억제 효과를 확인한 , 결과 아무런 처치를 하지 않은 정상군에서는 위 점막의 손상 , 이 발견되지 않았으나 증류수를 처리하고 급성 위염을 유발한 대조군에서는 HCl/ethanol 에 의해 위 점막에서 출혈과 발적 및 부종 등 손상 정도가 높게 나타났다 . 生地黃 50 mg/kg 투 여군과 生地黃 100 mg/kg 투여군에서의 위 점막 손상 정도 는 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다 (Fig. 1,

이러한 결과로 보아 은 급성 위염이 유발된 동물 모

2). 生地黃

델에서 위 점막 손상 억제효과가 있다고 생각된다.

는 체내 산화적 스트레스를 유도하는 호기성 대사과정 ROS

의 부산물로써 지질 , DNA, 단백질 등의 손상을 일으키는 원 인이 된다

⁵³⁾

. ROS 가 증가하면 인체 내 항상성 유지를 위해

등과 같은 효소에 의해 산소와 물로 분해되지만 생

catalase ,

성이 과도하게 증가하거나 생성 증가가 자주 일어나게 되면 불균형이 일어나 인체에 악영향을 미치게 된다

⁵⁴⁾

. ONOO

^-

는 O

2-

와 NO 가 반응하여 생성되는데 특히 염증 시에 호중구 , , 내피세포 등에서 많이 생성되며 전구체보다 훨씬 강력한 산 , 화력을 지니고 있다 이는 지질과산화 또는 . thiol 등의 아미노 산을 변형시켜 에너지대사 , DNA 손상 등을 초래한다

⁵⁵⁾

. 이렇 게 유발된 산화적 스트레스는 알츠하이머 및 염증성질환 등의 병리학적 진행과 노화과정에 있어 중요한 원인으로 생각되어 지고 있다

⁵⁶⁾

. 본 실험에서 측정한 혈정 ROS 는 Sucralfate 투 여군 , 生地黃 50 mg/kg 투여군 , 生地黃 100 mg/kg 투여군 에서 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다 (Fig.

또한 혈청

3). ONOO

^-

측정 결과 , 生地黃 50 mg/kg 투여군 , 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있는 100 mg/kg

生地黃

감소를 나타내었다 (Fig. 4). 이러한 결과를 통해 生地黃 이 혈 액 내 산화적 스트레스 인자인 ROS 와 ONOO

^-

를 조절하여 위 점막의 손상을 억제함을 확인하였다.

과도하게 ROS 가 생성되면 체내를 방어하기 위하여 glutathione 등과 같 peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD) 은 항산화 효소의 발현을 통해 ROS 를 제거한다

⁵⁷⁾

. 또한 항 , 산화에 관여하는 핵심 메커니즘의 하나인 nuclear factor

는 에 의한 산화적 erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) ROS

손상을 받게 되면 Keap 1 으로부터 분리되어 핵 안으로 이동 하게 된다 핵 안으로 이동한 . Nrf2 는 ARE 에 결합해 HO-1 등의 항산화 유전자의 전사를 활성화 시켜 단백질의 발현을 증가시키고 세포의 손상을 보호하며 항산화 시스템의 중요한 , 역할을 한다

⁵⁸⁾

.

본 실험에서 Nrf2, HO-1, SOD 의 발현량을 측정해본 결 과 , Nrf2 와 HO-1 의 발현량이 生地黃 100 mg/kg 투여군에 서 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 나타내었다 (Fig.

이러한 결과를 통해 이 항산화 단백질 중

5-7). 生地黃 Nrf2

와 HO-1 을 증가시킴으로써 위 점막의 손상 억제함을 확인하 였다.

NF-

^

B 는 여러 가지의 cytokine 에 의해 활성화되어지는 전자 조절자로서 염증이나 스트레스에 대한 생체 반응과 관련 , 된 유전자들의 핵심 전사 조절자이다

⁵⁹⁾

. NF-



B 는 inhibitory kappa B (I

^

B) 와 함께 세포질 내에서 존재하며 이러한 상태 , 에서 활성화시키는 자극이 가해지면 I

^

B 는 인산화 과정을 거 친 후 분해되어 NF-



B 는 핵 속으로 이동하여 target 유전자 들의 전사를 야기한다

⁶⁰⁾

. 본 실험에서 NF-

^

B 의 발현은 生地

투여군 투여군에서 대조

50 mg/kg , 100 mg/kg

黃 生地黃

군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 8).

는 유전자 전사단계에서 산화적 스트레스 또는 허혈

iNOS ,

조직손상 염증 및 면역반응 등에 따라 유리되는 여러 종류의 , 에 의해 유도되며

cytokine

⁶¹⁾

, COX-2 는 염증조직 종양조직 , 등에서 많은 양의 프로스타글란딘의 생성을 유도하여 염증 뿐 만 아니라 면역 반응 및 혈관조절 등을 억제하고 염증성

에 의해 활성화 된다

cytokine

^{62, 63)}

. IL-6 는 대표적인 염증성 으로 급성 혹은 만성 염증질환의 발생과 진행 과정 cytokine

에서 중요한 역할을 하며

^{64, 65)}

, TNF-

^

는 염증 반응 초기에 호중구를 유도하여 염증 반응을 악화시키는 역할을 한다

⁶⁶⁾

.

본 실험 결과 , COX-2, iNOS 및 TNF-

^

의 발현은 生地黃 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되 100 mg/kg

었다 (Fig. 9-12). 이러한 점으로 미루어 보아 生地黃 은 염증 매개 인자들의 생성과 염증성 cytokine 의 발현을 억제하여 항염증 효과를 낼 수 있을 것으로 생각된다.

위 실험결과를 통해 生地黃 과 sucralfate 의 효능을 비교해 보았을 때 두 약물 모두 위 점막의 손상을 유의하게 감소시켰 다 또한 . 生地黃 은 혈청 내 산화적 스트레스 관련인자인 ROS 와 ONOO

^-

를 유의하게 감소시켰으며 , 항산화 단백질인

와 염증성 매개인자인

Nrf2, HO-1 NF-

^

B 및 염증성

인 및

cytokine COX-2, iNOS TNF-

^

의 발현을 유의성 있 게 감소시켰다.

이상의 결과들을 종합해 볼 때 , 生地黃 은 HCl/ethanol 에 의해 유발된 급성 위염 흰쥐에서 항산화 작용 및 항염증 작용 을 나타내었으며 또한 뛰어난 위 점막 보호 효과가 나타나 . 추가적인 연구를 통해 위염 치료 약물로서 활용될 수 있을 것 이라 기대된다.

결 론 .

Ⅴ

이 급성 위염에 미치는 영향을 확인하기 위하여 총 生地黃

페놀 및 플라보노이드 함량 및 DPPH, ABTS 라디칼 소거능

을 측정하였으며 , HCl/ethanol 에 의해 유발된 급성 위염 동 물모델에서 위 조직을 적출하여 육안적 위 손상도 측정 혈액 , 내 산화적 스트레스 바이오마커 변화를 확인하였고 항산화 , 인자 발현량 측정 염증 , cytokine 및 매개인자 측정을 시행하 여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 生地黃 30% ethanol 추출물의 총 폴리페놀 함량은 3.69 으로 나타났으며 총 플라보노이드 함량은

±0.02 ㎎ /g ,

으로 나타났다 1.50±0.07 /g ㎎ .

2. 生地黃 30% ethanol 추출물의 DPPH 라디칼 소거능의 IC

50

값은 524.43±4.14 / ㎍ ㎖ 으로 나타났으며 , ABTS 라 디칼 소거능의 IC

50

값은 700.54±4.68 ㎍ ㎖ / 으로 나타 났다.

3. 위 조직에서 점막 손상 정도는 유의하게 감소하였다.

4. 혈청 내 산화적 스트레스 관련인자인 ROS 와 ONOO

^-

는 유의하게 감소하였다.

5. 항산화 단백질인 Nrf2, HO-1 의 발현은 유의하게 감소하 였다.

6. 염증성 매개인자인 NF-

^

B 의 발현은 유의하게 감소하였다 . 7. 염증성 cytokine 인 COX-2, iNOS 및 TNF-

^

의 발현은

유의하게 감소하였다.

이상의 결과로 보아 生地黃 은 HCl/ethanol 에 의해 유발된 급성 위염 흰쥐에서 항산화 인자 및 항염증 인자를 효과적으 로 억제하였으며 또한 뛰어난 위 점막 보호 효과가 나타나 , 급성 위염 치료에 유의할 것으로 생각된다.

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