오미자 착즙박 용매 추출물의 Nitric Oxide 생성 저해 효과
⁃ 연구노트 ⁃
이 진 원
수원여자대학교 보건식품학부 약용식물과
Inhibition Effects of Nitric Oxide Production of Solvent Extracts from Residue of Omija (Schisandra chinensis) Juice
Jin-Won Lee
Faculty of Health & Food/Medicinal Plant, Suwon Women’s University
ABSTRACT Omija (Schisandra chinensis) fruit is a small round-shaped and red fruit from the Omija tree that is high in a variety of gomisin A, gomisin N, schizandrin, and lignin. Omija fruit has an anti-effect as well as reducing effects on hyperlipidemia. Accordingly, this study examined the cell viability, such as cytotoxicity and inhibition of nitric oxide production, of Omija juice residue extracted from various solvents [H2O, 50% ethanol (EtOH), 70% EtOH, 95% EtOH]. The cell cytotoxicity and anti-inflammatory activity of the Omija juice residue extracted from EtOH were investigated using an MTT assay and an evaluation of the inhibitory effect nitric oxide in RAW 264.7 murine macrophage cells. The MTT assay showed that the RAW 264.7 cell viability of the EtOH extracts was better than that of the H2O extracts. The solvent extracts of 50% EtOH (2,500 μg/mL) showed potential inhibitory activities on the nitric oxide activity in RAW 264.7 cells. These results suggest that the EtOH extracts and 50% EtOH extracts from the residue of Omija juice have anti-inflammatory activity.
Key words: Omija fruit, effect, anti-inflammatories, nitric oxide, inhibition
Received 4 May 2018; Accepted 18 June 2018
Corresponding author: Jin-Won Lee, Faculty of Health & Food/
Medicinal Plant, Suwon Women’s University, Suwon, Gyeonggi 16632, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-31-290-8287
서 론
오미자는 오미자 나무과(Schisandraceae)에 속하는 낙 엽성 목본의 덩굴성 식물이며 오미자나무(Schisandra chi- nensis(Turcz.)Baillon)의 구형의 붉은색 과실이다(1). 오 미자의 주요 기능성 성분으로는 리그난 화합물이 알려져 있 으며, schizandrin, gomisin N 및 gomisin A가 가장 많이 함유되어 있다(2-4). 오미자의 붉은색은 80% 이상이 an- thocyanin에 기인하며, 이 anthocyanin은 peonidin 3-glu- coside인 것으로 보고되고 있다(5,6). 이와 같은 기능성 성 분이 함유된 오미자를 이용하여 다양한 연구가 진행되고 있 으며, 특히 알코올 해독 작용 및 간 보호 효과(7,8), 간암세포 에 대한 항암 효과(9), 대장암세포 증식 억제 효과(10), 고지 혈증 완화(11,12), 항염, 혈당 및 혈압 강하 등에 효과가 있 다는 연구보고가 알려져 있다(2). 특히 약용식물의 열매인 오미자에 대하여 최근 천연 항산화 소재에 대한 연구가 활발 히 이루어지면서 항산화 효과를 갖고 있는 천연 소재로 관심 이 증가하고 있다(9). 일반적으로 천연 소재에서의 항산화
효과를 알아보기 위해서는 다양한 용매를 이용하여 천연 소 재를 추출하는 방법을 이용하여 항산화 효과를 측정하는 연 구가 많이 진행되었다(13). 그 결과 오미자를 H2O와 에탄올 (EtOH)을 이용하여 추출한 경우 H2O보다는 에탄올 추출물 이 항산화 효과가 더 높게 나타났으며, 상온일 때보다 가온 을 한 경우 더 높은 항산화 효과를 나타내는 것으로 보고되 고 있다(14). 또한, 오미자의 기능성 성분은 과육보다는 종 자에 많이 함유된 것으로 보고되었으며(15,16), 이에 따라 서 오미자를 분쇄하면 기능성 성분을 더욱 많이 추출할 수 있음을 알 수 있었고, 오미자 추출물은 항염증 효과에도 탁 월한 효과가 있다는 연구 보고가 있다(17,18). 일반적으로 염증반응은 외부의 자극이나 상처 및 세균감염 시 생체를 방어하기 위해 나타나는 반응이며, 염증의 작용 및 기간에 따라서 급성염증과 만성염증으로 나눌 수 있다. 급성염증반 응은 외부의 이물질로 인한 자극에 의해 대식세포(macro- phage)가 활성화되어 cytokine, chemokine 및 nitric oxide (NO) 등의 염증 매개 물질을 생성한다(19). 정상적인 NO는 세균을 죽이거나 종양을 제거하는 중요한 역할을 한다. 그러 나 외부 요인에 의한 과도한 NO의 생성은 염증을 유발하고, 신경손상 및 유전자 변이를 발생시킨다. 또한, 급성염증반응 은 생체를 방어하기 위하여 필수적인 반응이다. 특히 이 반 응에서 과도하게 분비된 염증매개 물질인 inducible nitric oxide synthase(i-NOS)는 외부 상처에 대한 반응 및 염증
과 같은 면역방어기전의 과정을 매개하는 cytokines, 염증 원인 내독소(lipopolysaccharide, LPS) 등에 유도되어 과도 한 혈관확장을 일으키며, 면역세포의 지속적인 생존과 활성 을 일으켜 만성염증이나 면역 과민반응의 원인이 된다(20).
따라서 i-NOS에 의한 NO의 생성을 저해하는 새로운 염증 치료제를 개발하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있으 며, 이와 같이 오미자에 관한 기능성 연구가 활발히 진행되 면서 주로 약용작물로 사용되어 왔던 오미자를 활용하여 농 산업의 고부가가치 작물로 자리매김하고 있다.
따라서 본 연구에서는 오미자의 가공 원료로서의 기능성 과 생산성을 증가시키고 오미자의 건강 기능성 식품의 원료 사용 가능성에 대한 데이터를 구축하고자 생 오미자 착즙 과정에서 얻은 착즙박(extracts from residue after Omija juice, ERAO)을 용매별[H2O(A), 50% EtOH(B), 70% EtOH (C), 95% EtOH(D)]로 추출하여 H2O로 추출한 ERAO(A- ERAO), 50% 에탄올을 이용하여 추출한 ERAO(B-ERAO), 70% 에탄올을 이용하여 추출한 ERAO(C-ERAO) 및 95%
에탄올을 이용하여 추출한 ERAO(D-ERAO) 각각의 추출물 에 대한 항염 효과를 알아보고자 한다. 즉 생 오미자 착즙 공정을 통해 얻은 오미자 착즙박에 H2O 및 에탄올을 농도별 (50%, 70%, 95%)로 처리하여 추출물을 제조한 후, RAW 264.7 cell에 처리하여 항염 활성 측정용 시료로 이용하였다.
오미자 착즙박 추출 시 에탄올을 농도별(50%, 70%, 95%)로 사용한 이유는 오미자 착즙박에 함유된 다양한 페놀성 화합 물들이 항산화 작용과 함께 항염 효과에도 영향을 미칠 수 있으므로 일반적으로 식물체에 함유된 페놀성 화합물 추출 시 사용되는 에탄올 추출 용매를 농도별로 이용하여 오미자 착즙박 추출 용매에 대한 최적의 조건을 알아보았다(21,22).
재료 및 방법
재료
본 실험에서 사용한 오미자는 전라북도 장수군에서 2016 년도에 수확한 생 오미자를 구입하여 -40°C에서 냉동보관 후 4°C에서 해동하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 RAW 264.7 실험세포는 성균관대학교 유전공학과(Seoul, Korea)에서 공급받아 실험에 사용하였다.
생 오미자 착즙박 추출물 제조
생 오미자를 가지와 열매로 분리한 후 착즙기(Hurom- HL Series, Seoul, Korea)를 이용하여 오미자 착즙박을 분 리하였다. 분리된 오미자 착즙박 15 g에 각각의 용매[H2O (A), 50% EtOH(B), 70% EtOH(C), 95% EtOH(D)]를 ERAO 의 10배 비율로 가한 후 60°C 항온수조에서 정치 추출하였 다. 추출한 시료는 filter paper(No.20, 90 mm, 5~8 μm, Hyundai Micro Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 감압 여과하였다. 분리된 여과액은 rotary vacuum evaporator (HS-2005S-N, Hahn Shin, Gyeonggi, Korea)에서 감압
농축 후 세포 실험에 대하여 에탄올 농도에 따른 독성에 대 한 안전성을 알아보기 위해서 에탄올 농도별 추출물 각각을 제조하여 시료로 사용했으며, 각각의 에탄올 추출물을 농도 별(10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 μg/
mL)로 제조하였다(23).
세포배양
동결된 murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세 포를 50 mL 튜브에 옮겨서 fetal bovine serum(FBS; Invi- trogen Co., Carlsbad, CA, USA) 9 mL를 가하여 세포를 부유시킨 후 원심분리(1,200 rpm, 15 min) 하여 실험에 사 용할 세포를 얻었다. 상층액이 제거된 튜브의 세포에 1%
penicillin으로 조성된 Dulbecco’s modified Eagle’s me- dium(DMEM, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)과 10% FBS를 가하여 세포를 부유시킨 다음 RPMI-1640을 배지로 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 배양하면서 5회 이상 계대 배양을 실시하였으며, NO 저해 정도를 측정하기 위하여 LPS(lipopolysaccharide, E. coli serotype O111:
B4, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다(24).
MTT assay에 의한 세포독성 측정
생 오미자를 착즙 후 남은 오미자 착즙박을 용매별로 추출 한 추출물의 세포독성 활성을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.7 세포(1×105 cells/mL)를 96-well plate에 100 μL씩 분주한 다음 배양기(37°C, 5% CO2)에서 well의 80% cell이 차도록 배양하고, 배지 제거 후 시료를 농도별(10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 μg/mL)로 100 μL씩 처리하여 18시간 배양하였고(37°C, 5% CO2), 5 μg/mL 농도의 MTT 용액을 10 μL/well 처리하 여 다시 4시간 동안 배양하였다. 그다음 배지를 제거하고 DMSO 100 μL/well을 분주하여 다시 30분 배양한 후 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay reader, Versa Max, Molecular Device, Silicon Valley, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 처리 대신 배 지를 처리하였다(23,25).
항염증 효능 측정
생 오미자를 착즙 후 남은 오미자 착즙박을 용매별로 추출 한 각각의 추출물의 NO 저해 정도를 측정하기 위해 RAW 264.7 세포(5×105 cells/mL)를 48-well plate에 100 μL씩 분주한 다음 well의 80% cell이 차도록 배양(37°C, 5% CO2) 하고, 배지 제거 후 1 μg/mL LPS를 100 μL/well씩 처리하 여 2시간 배양하였다. 여기에 시료를 농도별(10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 μg/well)로 100 μL씩 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 상층액 100 μL와 Griess 시약[1% sulfanilamide(w/v), 0.1% naphthyleth- ylenediamine(w/v) in 2.5% phosphoric acid(v/v)] 100 μL를 96-well plate에 취하여 배양기(37°C, 5% CO2)에 넣
Fig. 1. Cytotoxicity of macrophage cell (RAW 264.7) of extracts from residue after Omija juice by MTT assay. ERAO, extracts from residue after Omija juice;
A-ERAO, H2O extract of ERAO; B-ERAO, 50% EtOH extract of ERAO; C-ERAO, 70% EtOH extract of ERAO; D-ERAO, 95% EtOH extract of ERAO. Each values are the mean±SD of three independent experi- ments. Means with different letters (a-c) in the same concentration are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
어 10분 동안 반응시킨 다음, ELISA(enzyme linked im- munosorbent assay reader, VersaMax, Molecular Device, Silicon Valley, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도 를 측정하였다(19). 표준물질은 sodium nitrite(NaNO2)를 이용하여 동일한 방법으로 실험을 진행한 후 표준곡선을 작 성하여 NO 생성 저해능을 측정하였다(25,26).
통계 처리
모든 측정값은 3회 이상 반복하였으며, 실험 결과는 SAS (Statistical Analysis System, Version 6.12, SAS Insti- tute, Cary, NC, USA) 통계 Package를 사용하여 각각의 분 석 데이터를 통계분석 하였으며, Duncan’s multiple range test를 이용하여 P<0.05의 수준에서 통계학적 유의성을 검 정하였다.
결과 및 고찰
MTT assay에 의한 세포독성 측정
대식세포인 RAW 264.7 세포를 이용한 오미자 착즙박 추 출물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 측정하 였다. 오미자 착즙박을 용매별로 추출하여 얻은 각각의 추출 물(A-ERAO, B-ERAO, C-ERAO 및 D-ERAO)을 RAW 264.7 세포에 농도별(10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 μg/mL)로 처리한 결과는 Fig. 1과 같다. 대 부분의 추출물의 경우 RAW 264.7 세포에 대하여 큰 독성을 나타내지 않았으나, ERAO의 추출물의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하는 경향을 나타내었다. 특히 D-ERAO 를 500 μg/mL 및 10,000 μg/mL 농도로 처리한 경우 대조 구보다 다소 낮은 세포 생존율을 나타내었으나, 대조구 100
% 대비 50% 이상의 세포 생존율을 유지하는 것으로 나타났 다. A-ERAO 및 C-ERAO를 RAW 264.7 세포에 처리하여 세포 생존율을 측정한 경우 전반적으로 추출물 농도가 증가 할수록 세포 생존율이 감소하는 경향을 나타내었다. 특히 500 μg/mL 및 10,000 μg/mL의 농도를 처리한 경우에서는
대조구 100% 대비 다소 낮은 세포 생존율을 나타내었으나 다른 추출액 처리 농도별 세포 생존율에 비하여 가장 안정적 인 것으로 판단되었다. 이와 같은 결과는 Kim 등(27)이 보고 한 결과와 같이 오미자 내 lignan및 phenolics 등과 같은 페놀성 화합물들이 많이 함유되어 있으며, 이러한 성분들은 항산화 활성을 나타내므로 RAW 264.7 세포의 보호 역할에 영향을 미친 것으로 판단되었다. 이러한 결과를 기준으로 오미자 착즙박 용매별 추출물에 대한 항염증 저해 활성을 측정할 경우 모든 시료구에 대하여 다양한 농도를 이용하여 NO 활성에 대한 저해 효과 실험에 이용하는 것이 가능할 것으로 판단되었다(28,29).
NO 측정
대식세포에서 생성되는 NO는 세포 내 감염에 대한 저해 작용의 신호 물질로 RAW 264.7 세포에 오미자 착즙박 추출 물을 농도별로 처리하여 NO 활성 저해를 측정한 결과는 Fig.
2~5와 같다. 각각의 추출물에 대한 NO 활성 저해 효과 측정 은 LPS를 처리한 (+)control을 100% 기준으로 하여 나타 내었다. 그 결과 A-ERAO 추출물에서는 1,000 μg/mL 농도 에서부터 유의적 차이가 나타나기 시작하여 10,000 μg/mL 에서 73% NO 저해 활성을 나타내었으며, B-ERAO 추출물 은 1,000 μg/mL에서 89%, 2,500 μg/mL에서 49% NO 저 해 활성을 각각 나타내었다. C-ERAO 추출물의 경우에서는 1,000 μg/mL에서 75% 및 2,500 μg/mL에서 30% NO 저해 활성을 나타내었으며, D-ERAO 추출물 처리구에서는 1,000 μg/mL에서 52%, 2,500 μg/mL에서 47% NO 저해 활성 결 과를 측정하였다. 오미자 착즙박에 에탄올을 농도별로 이용 하여 추출한 모든 추출물에 대하여 2,500 μg/mL 농도 처리 구에서 50% 이상의 NO 생성 저해 효과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 Lee 등(30)의 열매인 감귤류를 메탄올을 이용 하여 추출한 추출물을 처리한 경우 LPS 처리구를 기준으로 40% 정도 NO 생성 저해 효과를 나타내었다는 연구 보고와 유사한 결과를 나타내었다. 감귤류도 오미자와 같이 열매 부위로, 특히 과피 부분에 lignan 및 phenolics 등과 같은
Fig. 2. Effects of A-ERAO on the production of nitric oxide in macrophage cell (RAW 264.7). ERAO, ex- tracts from residue after Omija juice; A-ERAO, H2O extract of ERAO; (+), LPS group. Each values are the mean±SD of three independent experiments. Means with different letters (a-c) above bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Fig. 3. Effects of B-ERAO on the production of nitric oxide in macrophage cell (RAW 264.7). ERAO, ex- tracts from residue after Omija juice; B-ERAO, 50%
EtOH extract of ERAO; (+), LPS group. Each values are the mean±SD of three independent experiments.
Means with different letters (a-c) above bars are sig- nificantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Fig. 4. Effects of C-ERAO on the production of nitric oxide in macrophage cell (RAW 264.7). ERAO, ex- tracts from residue after Omija juice; C-ERAO, 70%
EtOH extract of ERAO; (+), LPS group. Each values are the mean±SD of three independent experiments.
Means with different letters (a-d) above bars are sig- nificantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
페놀성 화합물들이 많이 함유되어 NO 생성 저해 효과에 영 향을 미친 것으로 판단되었다. 또한, 오미자를 H2O, 에탄올 및 메탄올을 이용하여 추출한 추출물을 간암세포에 처리한 경우 항암 효과를 나타내었다는 Roh와 Oh(31)의 연구 결과 에서도 각각의 오미자 추출물에 lignan 성분이 함유되어 항 산화 작용, NO 생성 저해 효과 등 다양한 생리활성 기능을
갖고 있다고 보고되고 있다. 또한, 오미자 박을 에탄올로 추 출한 추출물을 500 μg/mL 농도로 세포에 처리한 경우 안정 적인 세포 생존율을 나타내었으며(32), 오미자 착즙박을 에 탄올을 이용하여 추출한 추출물의 경우 500 μg/mL 농도에 서부터 항산화 및 항염증 효과를 나타내었다는 Kim 등(33) 의 연구 결과 보고에서처럼 오미자 착즙박을 에탄올로 추출
Fig. 5. Effects of D-ERAO on the production of nitric oxide in macrophage cell (RAW 264.7). ERAO, ex- tracts from residue after Omija juice; D-ERAO, 95%
EtOH extract of ERAO; (+), LPS group. Each values are the mean±SD of three independent experiments.
Means with different letters (a-c) above bars are sig- nificantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
한 추출물을 이용할 경우 NO 저해 활성 효과를 나타낼 것으 로 판단되었으며, 이와 같은 결과에서 오미자 자체 활용은 물론 부산물인 오미자 착즙박을 기능성 식품 소재로 이용이 가능할 것으로 생각되었다.
요 약
생 오미자를 착즙하고 남은 착즙박(ERAO)을 용매별[H2O (A), 50% EtOH(B), 70% EtOH(C), 95% EtOH(D)]로 추출 한 추출물(A-ERAO, B-ERAO, C-ERAO 및 D-ERAO)을 시료로 하여 세포독성 및 항염증 작용 효과를 알아보기 위해 NO 생성 저해 활성을 측정하였다. 그 결과 오미자 착즙박 추출물(A-ERAO, B-ERAO, C-ERAO 및 D-ERAO)의 대식 세포인 RAW 264.7 세포에 대한 세포독성은 대조구 100%
대비 50% 이상의 세포 생존율을 유지하는 것으로 나타났다.
오미자 착즙박 추출물에 대한 NO 생성 저해 활성을 이용하 여 항염증 효과를 측정한 결과, 에탄올을 농도별로 추출한 추출물(B-ERAO, C-ERAO 및 D-ERAO)을 2,500 μg/mL 이상의 농도를 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 50% 이상의 NO 저해 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해 오미자 를 원료로 음료 형태의 가공식품 제조 시 부산물로 얻어지는 착즙박에 대한 활용 범위를 증대시킬 수 있으며, 항염증 활 성을 갖는 유용한 물질로 사용 가능할 것으로 생각된다.
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