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서 론
세포고사는 세포형태변화, 염색질 응축, DNA 분절, 미토 콘드리아 기능 장애, caspase protease 활성화 등의 특징을 수반하여 세포괴사와 구분된다. 이러한 세포고사는 배 발 생과정에 특이적으로 작용할 뿐 아니라 유해한 세포의 제 거 등에 관여하여 개체의 항상성을 유지하는 중요한 조절 기구로 작용하고 있다. 최근에 잠정적으로 유해한 세포들 을 제거하거나, 노쇠한 세포의 죽음, 즉 세포고사의 회피가 암을 포함하는 각종 질병의 발병원인으로 해석하는 견해도 대두되고 있다. 또한 암 치료에 사용되고 있는 각종 항암제 들이 암세포의 세포고사를 포함하는 세포독성을 유발하는 것으로 밝혀졌다.
암 치료 개발의 한 부류는 기존의 항암제를 적은 농도로 병용 및 복합 처리하므로 고농도의 단일처방에 의한 정상
대장암 세포주에서 Doxorubicin과 Lovastatin 유도성 세포고사에 대한 p53과 p38 MAPK의 영향
원광대학교 의과대학 외과학교실 및 1미생물학교실
박 원 철․이 정 균․박 래 길1
책임저자：박원철, 전북 익산시 신용동 344-2 ꂕ 570-749, 원광대학교병원 외과학교실 Tel: 063-850-1205, Fax: 063-855-2386 E-mail: [email protected]
접수일：2003년 5월 15일, 게재승인일：2003년 7월 14일 이 논문은 2002년도 원광대학교 교비지원에 의해서 연구됨.
Role of p53 and p38 MAPK on Doxorubicin and Lovastatin-induced Apoptosis in Colon Cancer Cells
Won Cheol Park, M.D., Jeong Kyun Lee, M.D. and Rae Kil Pak, M.D.1
Purpose: Apoptosis plays a central role in tumor develop- ment and it has been hypothesized that lack or failure of apoptosis leads to the development of tumors, including colon cancers. Anticancer drugs do not invariably cytotoxic to all cancer cells. Some resistant cells against anticancer drugs are resuming to proliferate after initial damage, whereas others undergo permanent growth arrest or death.
The resistance of advanced colorectal cancers to chemo- therapy is often related to mutations in p53 tumor suppressor gene.
Methods: To understand the molecular mechanism of lovastatin-induced apoptosis, the relationship between p53 and p38 MAPK upon cytotoxicity by anticancer drug was investigated in colon cancer cell lines including HCT-116 (p53 wild type) and HT-29 (mutated p53). Doxorubicin (dox) or lovastatin (lova) increased the cytotoxicity of colon cancer cells in a dose- and time-dependent manner.
Results: Cytotoxic effects of dox and lova was more prominent in HCT-116 than HT-29. The combined treatment of dox and lova further increased the cytotoxic effect on both cells. The cytotoxicity of dox and lova was resulted from apoptotic cell death, which was determined by genomic DNA fragmentation, PARP cleavage and activation of caspase-3 and -9. The Combined treatment of dox and lova synergi- stically increased the catalytic activity of caspase-3 and -9 in colon cancer cells, but not caspase-6 and -8. Anticancer drugs also induced the cytosolic release of cytochrome c
from mitochondria. Dox also induced the accumulation and activation of p53 protein (phosphorylation of p53, ser15), which was suppressed by lova. p38 MAPK inhibitor, SB203580, significantly increased the apoptotic death of lova-treated cells. Furthermore, Lova significantly induced apoptotic death of MKK6 D/D stable transfectant compared to pcDNA3.1 transfectant of HT-29 cells, which was determined by MTT assay, DNA fragmentation, and caspase activation. Similarly to MKK6 D/D transfectant, Exip (alter- native splicing p38 gene) transfectant showed the apopto- genic effect of dox with lova.
Conclusion: These results indicate that lova induces apo- ptosis in colon cancer cells via p38 MAPK-dependent and p53-independent mechanism (J Korean Surg Soc 2003;
65:267-278)
Key Words: Colon cancer, Lovastatin, Apoptosis, p53, p38 MAPK
중심 단어: 대장암, Lovastatin, 세포고사, p53, p38 MAPK ꠏꠏ ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ ꠏꠏꠏꠏ Departments of Surgery and 1Microbiology, School of Medi- cine, Wonkwang University, Iksan, Korea
세포의 세포독성을 완화하고, 암세포의 세포독성을 증가시 키는 항암제를 선별하는 방향으로 진행되고 있다.
암유전자나 암억제 유전자가 단독으로 전이를 발생하는 것이 아니라 여러 유전자들과 단백질이 관여하게 되고 특 히 대장암에서는 p53 암 억제 유전자의 돌연변이가 주를 이 루고 있음이 밝혀졌다. DNA가 손상을 입게 되면 세포 내 p53단백질이 활성화되어 세포주기의 G1 arrest가 일어나 DNA 복제가 중단되고 DNA 수복이 되면 다시 세포가 증식 하거나 DNA 손상이 심각하여 수복할 수 없는 상태가 되면 세포고사가 일어난다. p53 유전자의 돌연변이가 있거나 결 손이 있는 경우 p53유전자를 삽입하여 wild type p53단백의 발현이 회복되면 세포 내에서 세포고사나 세포성장 억제가 유발된다.(1,2) 이와 관련하여 외부의 신호를 세포 내로 전 달하는 기작인 mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade 는 세포 증식과 분화, 세포사멸과 생존 등의 매우 다양한 과정에 관여하는 효소이며, MAPK에는 extracellular signal regulated kinase (ERK), p38 kinase, c-jun N-terminal kinase/
stress activated protein kinase (JNK/SAPK) 등의 subtype이 알 려져 있다. 이들 각 그룹들은 각기 다른 경로를 통해 조절되 고, 각기 특이적인 기능들을 수행한다. 일반적으로 ERK는 주로 생존 신호에 관여하는 반면, SAPK와 p38 kinase는 세 포고사 신호로서 역할을 하고 있다고 보고하였다.(3) 따라서 본 연구에서는 대장암 세포주인 HCT-116 (p53 wild type)과 HT-29 (p53 mutant type) 세포를 모델 시스템으 로 doxorubicin (Dox)와 lovastatin (Lova)에 의한 항암 효능과 항암기전을 세포고사의 관점에서 연구하고, 세포고사의 신 호전달 경로와 각각 항암제의 표적 분자를 규명하고자 하 였다.
방 법
1) 세포배양
사람 대장암 세포주 HCT-116 (p53 wild type)와 HT-29 (p53 mutant type)은 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD)에서 분양 받아 10% FBS, 50 IU/ml penicillin 과 50μg/ml streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지로 5%
CO2, 37oC 세포 배양기에서 계대 배양하여 본 실험에 사용 하였다.
2) p53 및 p38 MAPK 관련 유전자 클로닝
p38 MAPK의 활성을 조절하는 MKK6의 constitutive ac- tive form인 MKK6 D/D 유전자와 p38 MAPK 유전자의 alter- native splicing variant인 Exip 유전자로 형질전환시킨 대장 암 세포주 HT-29 세포에서 항암제의 감수성을 조사하여 p38 MAPK의 기능을 분석하고자 일본 RIKEN 연구소의 Sudo 박사로부터 human MKK6 gene을 mutagenesis에 의해 serine 207과 threonine 211을 aspartic acid로 치환한 MKK6
D/D와 쥐 신장암 세포주의 cDNA library로부터 cloning 되 었고, 여러 조직에서 발현되나 몇몇 배양세포에서는 발현 되지 않는 것으로 보고된 p38 MAPK variant인 Exip 유전자 를 얻었다. Exip는 세포고사의 초기에 관여하는 것으로 밝 혀졌으나, 자세한 작용기전에 대해선 밝혀져 있지 않다. 한 편 p53(AF3078, Genebank)에 대한 유전자는 primer를 합성 하여 클로닝하였다. 이들에 대한 transfection을 확인하기 위 해 각각의 primer 제작 합성 및 epitope에 관한 항체를 구입 하였으며 p53 유전자와 p38 MAP kinase의 상위 조절유전자 및 alternated splicing gene인 Exip에 대한 음성 대조군으로 pcDNA3.1과 각각의 유전자로 형질 전환시킨 HT-29 세포를 G418로 1주일 선별하고, 이 중 일부의 클론을 선택하여 계 대 배양하였다. 그 외 세포를 배양하고 항암제 처리 48시간 후 MTT assay로 세포 독성을 분석하였다.
3) 형질전환 실험
형질전환 전날에 HCT-116 및 HT-29 세포주를 약 60%의 confluence상태로 분주하고 15시간 배양하고 수거하여 230μl의 배양액에 5∼10×106의 밀도로 부유한 세포에 20μl의 plasmid DNA 용액(5∼10μg)을 첨가하고 균일하게 섞어 4 mm gap cuvette에 옮겼다. 상온에서 10분 후, 각각의 시료 를 electroporator (Bio-Rad, USA)에서 230V, 970 μF로 pulse 하고 상온에서 15분 방치 후 10 cm culture dish에 10 ml 배양 액으로 분주하여 배양하였다. Transient transfection의 경우 에는 transfection 24∼30시간 후, 실험에 사용하고 stable transfection의 경우에는 2일 후 G418 (1 mg/ml)이 함유된 배 양액에서 형질 전환된 세포주를 선별하고, 선별된 세포주 에서 각각의 유전자의 발현 정도를 anti-Flag 또는 anti-HA antibody로 westhern blotting을 수행하여 확인하였다. 아울러 유전자가 형질 전환된 세포주에서 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하여 확인하였다.
4) 세포 생존율 측정
세포 생존율은 MTT 분석법으로 측정하였다.(4) 세포 배 양판(24-well plate)에 1×105/ml 세포를 1 ml/well씩 분주하 여 14시간 이상 CO2 세포 배양기에서 배양한 후, 시료를 각각의 조건에 따라 처리하였다. 각각의 배양세포에 배양 액의 1/10 MTT 용액(5 mg/ml in PBS)을 첨가하였다. 4시간 후 배양액을 제거하고 1 ml DMSO를 첨가하여 세포를 용해 시킨 다음 분광광도계(ELISA reader, Molecular Devices Co2
Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도 를 측정하였다. 생존율은 실험군의 A595/실험대조군의 A595
×100의 계산에 의하여 백분율로 계산하였다.
5) DNA 추출 및 전기영동
배양된 세포로부터 genomic DNA 추출은 Wizard Genomic DNA purification kit (Promega, Madison, WI)를 이용하여 제
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 조회사의 추출방법에 따라 수행하였다. 배양된 세포를 PBS
로 수세하고 수거한 후, nuclear lysis buffer [100 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS)]를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포 에 RNase를 첨가하고 37oC에서 30분간 반응 후 단백질 침 전용 완충용액을 첨가하여 단백질을 제거하였다. DNA를 포함하는 상층액을 isopropanol로 탈수 침전시키고, 70%에 탄올에 세척한 후, 진공 건조기로 건조하였다. 분리된 DNA 를 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)으로 DNA를 완전히 용해한 후 DNA 5 mg을 1.5%
agarose gel에서 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 UV 등에서 DNA 분절을 관찰하였다.
6) 미토콘드리아 추출
미토콘드리아를 포함하는 소기관 추출은 Ferreira 등(5)의 방법으로 수행하였다. 간략히 기술하면, 배양세포를 수거한 후 완충용액 A [20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT)]로 수세하고 100μl 완충용액 A를 첨가하여 얼음에서 30분간 반응시켰 다. 세포를 26 G 주사기를 이용하여 파쇄시키고 750×g에 서 10분간 원침시켰다. 상층액을 10,000×g에서 25분간 원 침하여 침전물을 미토콘드리아를 포함하는 membrane fraction으로 사용하였다. 원침된 membrane fraction에 lysis buffer (1% Triton X-100, 0.32 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 1μg/ml aprotinin, 1μg/ml leupeptin)를 첨가하고 얼음에서 30분 반응 시킨 후, 13,000 rpm으로 20분 원침하여 상층액을 미토콘드 리아 용해시료로 이용하여 cytochrome c의 유리 측정에 사 용하였고 유리 정도는 western blot 방법으로 검사하였다.
7) Caspase계 cystein 단백분해효소 활성도 측정 배양세포(1×106)를 PBS로 수세한 후 4oC에서 15분 lysis buffer (1% Triton X-100, 0.32 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 μg/ml aprotinin, 1 μg/ml leupeptin)로 용해하고 13,000 rpm으로 15 분 원심 분리하여 상층액을 수거하였다. 원심 분리하여 얻 은 세포 파쇄액은 bicinchoninic acid (BCA, Sigma Co. MO, USA)법으로 단백질을 정량하고, 세포 파쇄액을 분석 완충 용액(100 mM HEPES, pH 7.5, 10% sucrose, 0.1% Chaps, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 1μg/ml aprotinin, 1μg/ml leupeptin)에 함유된 형광기질과 37oC에서 30분 반응시킨 후 Fluoropho- tometer (Molecular Devices Co, USA)로 측정하였다. Caspase-3 단백분해효소와 caspase-9 단백분해효소의 효소 활성의 측 정은 형광기질인 Ac-DEVD-7-amino-4-methylcoumarin (AMC) 과 Ac-LEHD-AFC (Calbiochem Co. CA, USA) 50μM을 이용 하였고, 이들 형광기질의 단백질분해 분절을 측정하여 caspase 활성을 결정하였다. 이 때의 파장은 각각 excitation
wavelength (380 nm, 400 nm)와 emission wavelength (460 nm, 505 nm)를 사용하였다.
8) Western blot analysis
배양세포를 수거하고 PBS로 2회 세척한 후 각각의 세포 에 70μl 세포용해 완충용액(50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1μg/ml aprotinin)을 첨가하여 4oC에서 30분간 반응시키고 13,000 rpm에서 20분 원심 분리하여 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액의 단백질을 BCA법으로 정량하고, 동량의 단백질 (100μg)을 2x sample buffer와 섞어 100oC에서 5분 끓인 후, SDS-PAGE를 시행하였다. 전기영동 후 gel의 단백질은 semi-dry 방법으로 실온에서 단위 면적당 0.8 mA 전하로 2 시간 nitrocellulose membrane상에 이동시켰다. Nitrocel- lulose membrane을 blocking buffer (5% skim milk)로 상온에 서 1시간 반응시키고, TBS-T 완충용액으로 수세한 후 PARP, cytochrome c에 대한 항체를 0.01% (v/v)의 Tween-20 이 포함된 3% skim milk/TBS에 1：1000으로 희석하여 상온 에서 3시간 반응시켰다. Blot을 이차항체인 anti-rabbit IgG conjugated horse-radish peroxidase와 1시간 반응시키고, nitrocel- lulose membrane을 TBS로 3번 세척 후 ECL kit(Amersharm, England)를 사용하여 ECL 필름에 감광시켰다.
결 과
1) Doxorubicin과 Lovastatin에 의한 대장암 세포주의 세포독성
Dox가 정상 p53 암 억제유전자 세포주인 HCT-116에 약 20%까지 감소시키는 세포독성이 있으며 암 억제 유전자의 유전형에 따라 크게 다른 것으로 나타났다(Fig. 1A).
HCT-116 세포에 처리 시, 세포독성은 시간, 농도 의존적 으로 증가되었으나, 세포독성은 lova (10μM/ml)를 48시간 처리한 세포에서 생존율이 약 50% (Fig. 2B)로 dox (Fig. 2A) 보다 적은 것으로 나타났다. 그러나, 돌연변이 암 억제유전 자 p53을 발현하는 HT-29 세포에서는 세포 생존율이 약 90%로 나타났다(Fig. 2B).
항암제를 병용처리 시 HCT-116세포의 생존율은 약 30%
로 감소하여, 세포독성이 약 70%로 증가하였다. 이러한 결 과는 dox (0.5 mg/ml)에 의한 세포독성 40%와 lova (5μM/ml) 에 의한 세포독성 30%의 합인 70%와 일치하는 것으로 나 타났다. 동일한 조건으로 p53 암 억제 유전자 돌연변이 세 포주 HT-29 세포에서 분석한 결과, HCT-116의 세포와 유사 한 경향으로 농도 의존적 생존율 감소를 나타내는 세포독 성이 있으나 HCT-116에 비교하여 크지 않았다(Fig. 1C).
2) 항암제에 의한 대장암 세포주의 세포고사 특히 dox와 lova을 병용처리한 HCT-116 세포에서 항암제
로 유도된 DNA 분절은 더욱 더 유도되었으나, HT-29 세포 에서는 크게 유도되지 않았다(Fig. 2A). HCT-116 세포에서 PARP 분절은 항암제 처리 24시간부터 뚜렷하게 진행되었 으나, 돌연변이 p53 암 억제 유전자형인 HT-29 세포에서 PARP 분절은 36시간에 진행된 것으로 나타났다(Fig. 2B).
dox와 lova 병용처리는 p53 암 억제 유전자형에 관계없이 세포고사를 유발하고 있으며, 그 세포고사는 p53 유전자형 에 따라 크게 다르게 나타났다.
대장암 세포주에서 항암제에 의한 caspase-9의 활성화에 따라(Fig. 3 A, B), p53 유전자형에 따른 caspase-9 활성화의 차이를 확인하기 위하여 미토콘드리아 cytochrome c 방출을 확인하였다. 대장암 세포주 각각에 항암제 dox (0.5μg/ ml)과 lova (5μM/ml)을 시간별로 병용처리 시 정상 p53 유전자형 HCT-116 세포 미토콘드리아에 존재하는 cytocrome c 양이 16시간에 약간 감소하였고 24시간에는 현저히 감소되었다.
돌연변이 p53 유전자형 HT-29 세포에서는 항암제 처리 24 시간에 유의한 변화가 없었다.
3) 대장암 세포 csapase-3와 -9 활성화에 미치는 영향 Dox와 lova를 HCT-116 세포에 처리 시 caspase-3의 활성
을 36시간에 각각 3배와 2배로 약하게 증가시켰으나, dox와 lova를 병용처리한 HCT-116 세포에서 caspase-3 활성은 24 시간부터 유의하게 증가하여 36시간에는 약 15배로 증가되 었다(Fig. 3 A-left). 항암제를 병용처리 시 단독 처리에 비교 하여 약 5배와 7배로 증가시키는 상승효과가 있음을 나타 내었다. 항암제를 병용처리한 세포에서는 HCT-116과 동일 하게 caspase-3만 약 5배 활성화되는 상승효과가 있는 것으 로 나타났다(Fig. 3 B-left).
HCT-116의 경우에는 세포막에 존재하는 세포고사 관련 신호전달 수용체에 의하여 활성화되는 initiator caspase-8은 각각의 항암제 단독처리와 병용처리 시 유의성 있는 활성 도의 변화가 없었으나 미토콘드리아 신호전달 경로를 경유 하는 initiator caspase-9의 활성도는 각각의 항암제를 36시간 단독처리 시 약 2배가 증가하였고(Fig. 3 A-right), 병용처리 24시간부터 시간 의존적 증가가 유도되었고 36시간에는 effector caspase-3와 유사하게 약 7.5배로 증가하는 상승효과 가 있는 것으로 나타났다. 또한 HT-29 세포에서도 caspase-8 의 활성도는 유의한 증가가 없었으나, 항암제 병용처리 시 에만 caspase-9의 활성도가 36시간에 약 3배가 증가하였다 (Fig. 3. B-right).
Fig. 1. Cytotoxic effect of Doxorubicin (Dox) and Lovastatin (Lova) on colon cancer cells. HCT-116 (A and B, Upper) and HT-29 (A and B, Lower) cells were treated with Dox (A) and Lova (B) at various concentration for indicated time periods. (C) These colon cancers were treated with Dox (0.5μg/ml) and Lov (1 to 5μM/ml) for 36 hrs. Viability was determined by MTT assay, and results were calculated as relative value of survived cells in experimental group compared to control group.
0
Viability (%)
Doxorubicin ( g/ml)µ 0
24 hrs 36 hrs 48 hrs
1 0.5
0.1 100
60 120
80
40 20
A
0
Viability (%)
Lovastatin ( M/ml)µ 0
HCT-116 W/O HCT-116 Dox (0.5)
5 2.5 1 100
60 120
80
40 20
C
0
Viability (%)
Lovastatin ( M/ml)µ 0
24 hrs 36 hrs 48 hrs
10 5
100
60 120
80
40 20
HCT-116 B HCT-116
HT-29 W/O HT-29 Dox (0.5) Doxorubicin (0.5 g/ml)µ
0
Viability (%)
Doxorubicin ( g/ml)µ
0 0.1 0.5 1
100
60 120
80
40 20
D
0
Viability (%)
Lovastatin ( M/ml)µ
0 5 10
100
60 120
80
40 20
HT-29 E HT-29
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
4) Lovastatin이 암 억제 유전자 p53 발현에 미치는 영향
대장암 세포에 처리한 dox가 p53 유전자 발현을 유도할 수 있는가를 알아보기 위하여 p53 단백질의 활성화에 관여 하는 인산화 부위인 ser15의 아미노산에 대한 phospho-p53 (ser15) 항체로 western blot을 수행하였다. 정상 p53 유전자 형 대장암 세포주인 HCT-116 세포에 dox를 처리 시 p53의 활성화는 8시간부터 24시간까지 지속되었다(Fig. 4A). Dox 는 p53 단백질의 활성화와 p53 유전자 발현을 유도하여 세 포의 p53 단백질 축적을 유도하였다. 또한 p53의 인산화로 활성화된 p53은 전사조절인자(trans-acting factor)로서 세포 주기에 관여하는 p21WAF 유전자 발현을 유도하고 있음을 확인하였다. 위 결과는 dox가 대장암 세포주 HCT-116 세포 의 DNA 손상을 유발하고, 세포주기에 관여하는 p53과 p21WAF 유전자 발현을 유도하고 있음을 시사하고 있다.
HCT-116 세포주에 각각의 항암제를 단독 또는 병용처리 시 p53 단백질의 활성화 정도를 p53 (ser15)의 인산화에 대한 항체로 western blot 분석을 통하여 알아본 결과, HCT-116 세포에서 dox 단독처리 한 4시간부터 p53 단백질 활성화는 유도되었으나, lova를 단독처리한 세포에서는 p53 단백질의 활성화가 유도되지 않았다(Fig. 4B). 그러나 dox 단독처리로 활성화된 p53 단백질은 dox와 lova 병용처리에 의하여 p53 활성화가 억제되는 결과를 나타냈다.
5) p38 MAPK에 의한 대장암 세포주의 세포고사 조절
SB203580을 2시간 전 처리한 HCT-116 세포에 각각의 항 암제를 36시간 단독 혹은 병용처리한 후 생존율을 분석한 결과, SB203580은 dox로 유도된 생존율 감소에 큰 영향이 없었으나, lova 처리결과는 약 55%의 생존율을 보이는 것과 비교하여 억제제 처리 후 약 30%로 감소시키는 효능이 있 는 것으로 나타났다(Fig. 5A-left). 또한 SB203580은 dox와 lova 병용처리로 유도된 생존율보다 감소시키는 영향이 있 었으나, 그 감소율이 크지는 않았다. 돌연변이 p53 유전형 HT-29 세포에서 항암제로 유도된 세포고사에 대한 SB203580 의 영향도 정상인 p53 유전형 HCT-116 세포와 유사하게 나 타났다(Fig. 5A-right).
위의 생존율 변화와 관련하여 PARP의 분절화를 확인한 결과(Fig. 5B), dox와 lova를 처리한 HCT-116 세포에서 PARP 분절은 8시간부터 관찰되었고, p38 MAPK 억제제인 SB203580 전처리하고 dox와 lova로 유도된 경우에서 PARP 분절이 8시간에 보다 많이 진행되었다.
6) p53 및 p38 MAP kinase 형질전환체의 세포독성 p53 및 p38 MAP kinase 관련 유전자를 클로닝 및 해당 유전자를 다량 증폭하기 위해서 다음의 과정을 수행하였 다. p53의 경우는 Genebank의 AF3078을 바탕으로 합성한 PCR primer를 가지고 HCT-116에서 mRNA를 추출하여 이 Fig. 2. Effect of genomic DNA fragmentation (A), PARP cleavages (B) and mitochondrial cytochrome c release in colon cancer cells treated
with drugs. (A) Cells were treated with dox (0.5μg/ml) or lova (5μM/ml and 10μM/ml), or combination of dox and lova for 36 hrs. DNA was subjected for electrophoresis in 1.5% agarose gel. (B) Cells was determined by combination of dox (0.5μg/ml) and lova (5μM/ml) for indicated times. (C) Membrane fraction of mitochondria was prepared from cells treated with dox (0.5 μg/ml) and lova (5μM/ml) for indicated time periods. Quantity of mitochondrial protein was confirmed with the antibody of mitochondiral protein VDAC. Proteins (70μg) extracted from cells were subjected to Western blot analysis with antibody for PARP described in materials and methods.
A
B
C
Lova ( M/ml)µ Dox ( g/ml)µ
- -
- +
5 -
5 +
10 -
10 + HCT-116
- -
- +
5 -
5 +
10 -
10 + HT-29
HCT-116
HT-29
Cyt. c
Cyt. c
VDAC 0 8 16 24 (hr)
HCT-116
HT-29
0 12 18 24 30 36 (hr)
116 kDa 85 kDa
를 가지고 RT-PCR을 수행하여 해당 유전자를 pcDNA3.1 vector에 sense와 anti-sense로 구성하여 각각 pcp53-F 와 pcp53-Rev라 하였고 이를 HT-29 대장암 세포에 stable 형질 전환하여 실험을 수행하였다. 아울러 앞에서 얻어진 p38α, p38α의 alternativesplicing form인 Exip, p38 MAP kinase의 상 위 kinase인 MKK6, MKK6의 constitutive activated form인 MKK6 D/D를 확인하기 위해서 각각의 primer를 가지고 PCR을 수행하여 확인하였다(Fig. 6A, B).(6)
Mammalian expression vector인 pcDNA 3.1 vetor에 p53유 전자를 sense와 anti-sense로 클로닝하였고 이를 p53 유전자 가 정상적인 HCT-116과 돌연변이된 HT-29 대장암 세포주 에 각각 electro-transfection시키고 얻어진 stable-transfectant 를 가지고 항암제에 대한 감수성을 측정하였다. HCT-116의 경우 control과 비교하여 각각의 항암제에 대한 감수성은 p53유전자의 삽입과는 무관한 것으로 나타났다(Fig. 6C).
p53 돌연변이형인 HT-29의 경우에서도 유사한 결과가 나타 났다. Lova의 경우, 단독처리나 병용처리 시 p53유전자가
정상적이거나 돌연변이형이거나에 관계없이 세포고사를 유발시키는 것으로 생각된다.
p38 MAPK의 활성을 조절하는 MKK6의 구조적 활성형 인 MKK6 D/D 유전자와, p38 MAPK 유전자의 alternative splicing variant인 Exip 유전자로 형질전환시킨 대장암 세포 주 HT-29 세포에서 항암제의 감수성을 조사함으로, p38 MAPK의 기능을 분석하였다. pcDNA3.1로 형질전환시킨 세 포에서 dox에 의한 생존율은 약 80%였으나, MKK6 D/D나 Exip로 형질전환시킨 세포의 생존율은 약 50%로 약 30%가 감소하였다. 또한 lova에 대한 생존율도 약 80%에서 약 30%와 45%로 각각 약 50%와 35%가 감소하였다. 함암제를 병용처리 시 생존율은 약 60%에서 약 20%로 감소하였다 (Fig. 6D).
p38 MAPK inhibitor인 SB203580으로 2시간 전처리 후, lova를 48시간 처리 시 pcDNA3.1로 형질전환시킨 세포의 생존율은 큰 변화가 없었으나 각각의 유전자로 형질전환시 킨 세포에서의 생존율은 약 50%가 감소한 20% 수준을 나 Fig. 3. Chemotherapeutic agents induced effector caspase-3 and -9 activation. (A) HCT-116 cells were treated with dox (0.5μg/ml), lova
(5μM/ml), or both for the indicated times. (B) HCT-116 and HT-29 were treated with the combination of dox and lova. Caspase-3 and -9 activity was determined as described in Materials and Methods.
0 20
Activation (fold)
Time (hrs) 0
Dox Lova Dox+Lova
HT-29 HCT-116
30 24 18 12 18
16 14
10
6 12
8
4 2
36
A Caspase-3
0 10
Time (hrs)
0 12 18 24 30
9 8 7
5
3 6
4
2 1
36 Caspase-9
20
Activation (fold)
Time (hrs) 0
0 12 24 36
18 16 14
10
6 12
8
4 2
B Caspase-3
20
Time (hrs) 0
0 12 24 36
18 16 14
10
6 12
8
4 2
Caspase-9
Fig. 4. Chemotherapeutic agents regulated the activity of p53 protein.
HCT-116 cells were treated with dox (0.5μg/ml) plus lova (5μM/ml) (A) or dox (0.5μg/ml), lova (5μM/ml), or both (B) for the indicated times. Western blot performed with anti-phospho-p53 (ser15) and specific antibodies as indicated.
A
Dox Lova
- -
+ -
+ -
+ -
+ -
+ +
+ +
+ +
+ +
0 8 16 24 (hr)
p53
P-p53 (ser15)
p21WAF
P-p53 (ser15)
B
Dox Lova
- -
- +
- +
- +
- +
+ +
+ +
+ +
+ + 0 4 8 12 24 4 8 12 24 (hr)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 타내었다.
7) Exip과 MKK6 D/D 형질전환 세포에서 세포고사 특징 및 caspase 활성
각 유전자 과다발현에 의한 세포독성의 증가가 세포고사 와 직접적으로 연관이 있는가를 genomic DNA 분절의 분석 을 통하여 알아본 결과, 항암제 처리 36시간 후, 각각의 형 질전환 세포에서 항암제에 대한 genomic DNA 분절이 증가 되었고, DNA 분절도 lova에 의하여 현저한 증가가 일어났 다(Fig. 7A).
MKK6 D/D로 형질 전환된 HT-29 대장암 세포주의 경우 대조군(pcDNA3.1)으로 형질전환된 세포주에 비해 각각의 항암제에 의해 많은 PARP의 절단이 일어났으며 병용처리 시 명확하게 85 kDa의 분절이 확인되었다(Fig. 7B). 이는 p38 MAP kinase의 upstrem에 있는 MKK6가 구조적 활성형 으로 작용하는 것으로 보인다. 따라서 MKK6 D/D가 p38의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 형질전환 세포를 Dox와 Lova로 병용처리하고 cell lysate의 단백질을 추출하 여 western blot을 수행하였다. p38의 인산화는 병용처리 후 2시간에서 최고의 활성을 보이며 이후 점차 감소하는 것으
Fig. 5. p38 MAPK inhibitor regulated the apoptosis of colon cancer cells induced by chemotherapeutic agents. (A) HCT-116 (Left) and HT-26 Cells (right) were treated with SB203580, a inhibitor of p38 MAPK, for 2 hrs before treatment of dox (0.5μg/ml), lova (5μM/ml), or both for 36 hrs. Cell viability was determined by MTT assay. (B) p38 MAPK inhibitor increased PARP cleavage.
HCT-116 cells were treated with SB203580 for 2 hrs before treatment of chemotherapeutic agents as indicated. Protein extracted from cells was subjected to western blot analysis with anti-PARP antibody.
W/SB W/O 120
Viability (%)
0
- + - +
100
60 80
40
20
A HCT-116
120
0
- + - +
100
60 80
40
20
HT-29
Dox Dox
- - + + - - + +
Lova Lova
B SB - - - +
- - + +
Lova
- + + +
Dox
116 kDa
- - +
- + +
+ + +
- - +
- + +
+ + +
85 kDa
0 8 16 24 (hr)
Time
로 나타났다(Fig. 7C).
MKK6 D/D1 클론에 Dox 처리 시 caspase-3와 caspase-9 활성도는 유의성 있는 증가가 없었으나, Lova 처리 시 대조 군에 비하여 약 5배와 2.5배가 증가하였다(Fig. 7D). 병용처 리 시 caspase-3와 caspase-9은 약 2.3배와 2배 증가하였으나, Lova 단독처리에 의한 증가율보다 크지 않았다. 특히 Lova 에 의한 세포고사와 caspase-3 활성도 증가가 현저히 증가된 결과로부터, MKK6 D/D 과다발현으로 p38 MAPK 활성화가 세포고사를 증가시킴으로 p38 MAPK가 생존인자로 작용하 고 있는 것으로 생각된다.
고 찰
Lovastatin (Lova)은 Aspergillus species에서 추출된 물질로 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-CoA) reductase inhibitor (HRI)로서 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA의 mevalonate로 전환을 저해함으로써 콜레스테롤 생합성을 감소시킨다.
Lova 처리에 의한 ras, rho와 rab을 포함하는 작은 G 단백질 들은 세포 증식, 세포분화 및 세포고사의 신호전달 체계의 중요한 조절자로서 세포의 생리활성에 중요한 기능을 수행 한다. Lova는 세포의 이러한 기능을 변형시킴으로써 세포 에 영향을 준다. HRIs는 잠정적 항암제로서 세포증식을 억 제하고, 세포고사를 유발시킨다.(7-10) 세포의 증식을 억제 하고 세포고사를 증가시키는 데 필요한 것으로 추정된 농 도는 정상 세포에 독성을 나타내므로, 암 특히 고형종양 치 료에 HRI의 사용은 부적당하다. 최근에 Lova은 대장암 세 포주에서 항암제로 유도된 세포고사를 증가시키는 효능이 있는 것으로 밝혀졌다.(11,12) 그러나 Lova로 유도된 세포고 사의 분자수준의 기전은 명확하게 밝혀져 있지 않다.
본 연구에서는 lovastatin (lova)을 대장암 세포주인 HCT- 116에 처리 시 세포고사를 유발하는 것으로 나타났다. 특히 doxorubicin (dox)과 병용 처리 시 p53이 정상적으로 발현하 는 HCT-116뿐 아니라 p53 돌연변이형인 HT-29에서도 세포 고사가 유도되는 것으로 보인다. 대부분의 암에서 발견되 Fig. 6. Expretssion of p53, MKK6 D/D and Exip gene in HT-29 cells. Cells were transfected with p53, MKK6 D/D and Exip then selected
with G418. (A) Western blot analysis was performed with anti-Flag antibody. (B) Expression of HA-hExip gene was determined by RT-PCR with specific primers. (C) HCT-116 with the p53 transfectants were treated with dox (0.5 μg/ml), lova (5 μM/ml) and both for the indicated times. Control vector and agents were used to pcDNA3.1(+) mammalian expression vector and DMSO solvent. (D) Transfected HT-29 cells were treated with dox, lova, or both during 48 hrs after absence (left) or the presence (right) of SB203580-pretreated. Cell viability was determined with MTT assay. Results were represented as mean±S.D of triplicates.
pcp53-F pcDNA3.1 120
Viability (%)
0 DMSO Dox Lova Dox/Lova 100
60 80
40 20
C HCT-116 (30h)
A
Clone 1 2 3 4 5 6
Flag-hMKK6D/D
Anti-Flag blot
pcp53-rev 120
0 DMSO Dox Lova Dox/Lova 100
60 80
40 20
HCT-116 (40h)
MEK6 D/D1 pcDNA3.1 120
Viability (%)
0 - + - +
100
60 80
40 20
D B
Clone # 1 2 3 4 5 6 HA-h Exip
Exip3
120
0 100
60 80
40 20 P38Exip
β-actin Exip Vector
- - + +
- - +
- + +
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
는 p53의 돌연변이형은 대략 50%를 차지하고 있는 반면에 대장암에서는 그 빈도가 65%에 이르고 있다. 지금까지 연 구 발표된 많은 논문이나 연구 자료에서 암세포의 치료에 UV 조사, X-ray 조사, 항암제 등과 같은 DNA 손상유발 물 질을 처리하여 치료하고자 하였고 이들에 의해 암 억제 유 전자 p53의 발현과 활성화를 유발하는 것으로 밝혀져 있 다.(13-15) p53 단백질은 세포주기 진행을 억제하는 p21 유 전자, DNA 수복과 세포고사 등에 관련된 유전자 발현을 조 절하는 전사조절 인자로도 작용을 한다.(16-18) 그러나 p53 이 세포고사를 진행시킨다는 명확한 기전은 잘 규명되어 있지 않고, p53이 전사조절 인자로서 세포고사를 촉진하는 Bcl-2 계열 단백질 Bax, 활성화 산소종(reactive oxygen spe- cies; ROS), Fas/APO-1와 DR5/Killer를 포함하는 death 수용 체의 전사활성을 조절함으로써 이들에 의하여 세포고사가 진행될 것이라는 가능성이 제시되고 있다.(19-24) 대부분 암 세포에서 p53 암 억제 유전자의 돌연변이가 밝혀졌고, p53 유전자를 이용한 암의 유전자 치료가 성공적으로 이루 어졌음이 보고되었다.(1,2) Dox와 cisplatin을 포함하는 일부 항암제는 DNA에 결합하여 세포고사를 유발하는 것으로 밝 혀졌고 이들로부터 유도되는 세포고사 신호전달 경로를 규
명하는 연구가 활발하고 심도 있게 이루어지고 있다. 또한 세포고사에 관련하여 p53의 활성화를 조절하는 조절자의 탐색연구로부터 MAP (mitogen-activated protein) kinase인 p38, ERK, JNK 등이 조절자로 추정되는 연구결과들이 보고 되고 있다.(3)
본 연구에서는 p53 유전자형이 다른 두 대장암 세포주에 서 항암제 단독 및 병용처리에 의하여 유도되는 세포고사 와 각각의 항암제에 의해 유도되는 신호전달경로를 규명하 여 궁극적으로 각 항암제의 표적 분자를 탐색하고자 하였 다. 위 연구를 위하여 DNA 손상을 유발하는 항암제 dox와 ras, rho 등에 의한 세포주기, 세포증식 등에 관여하며 전립 선암, 림프구, 백혈병세포 및 간세포에서 세포고사를 유발 하는 것으로 알려진 항암제 lova을 사용하였다.(7-10) 각각 의 항암제를 단독처리 시 p53 유전형에 무관하게 세포독성 을 유발하였고, 각각의 항암제에 대한 감수성은 정상인 p53 유전형을 지닌 HCT-116 대장암 세포에서 큰 것으로 나타났 다(Fig. 1A). 또한 저농도의 dox와 lova를 병용처리 시 각각 을 단독처리하여 유발된 세포독성보다 크게 나타났으며, 이때의 세포독성도 정상 p53 세포주인 HCT-116에서 2배 이 상 크게 나타났다(Fig. 1C). Dox와 lova로 유도된 세포독성 Fig. 7. MKK6 D/D or Exip overexpression augmented the DNA fragmentation. (A) Transfectants were treated with dox (0.5μg/ml), lova
(5μM/ml), or both for 36 hrs. DNA was isolated from cells and subjected to electrophoresis in 1.5% agarose gel. (B) Protein extracted from cells was subjected to western blot analysis with anti-PARP antibody. (C) MKK6 D/D transfected HT-29 cells were treated with dox (0.5μg/ml) plus lova (5μM/ml) for the indicated time periods. Western blot was performed with anti-p38 (specific phospho-p38 and p38 specific) antibodies as indicated. (D) Cells were treated with dox (0.5μg/ml), lova (5μM/ml), or both for 36 hrs. Caspase-3 (left) or Caspase-9 (right) activity was determined with the method described in Materials and Methods.
Results were one from three independent experiments with similar results.
C A
MKK6D/D1 pcDNA3.1 10
Casp-3 activity (fold)
0 - + - +
6 8
4 2
D B
Lova - -
HT-29/
pcDNA3.1
116 kDa 85 kDa
Dox (0.5 g/ml)µ
- - + +
Lova (5 g/ml)µ
+ + - - + +
Dox - + - + - + - +
HT-29/
MKK6 D/D1 Lova - - + + - - + + Dox - + - + - + - +
- - + + - + - + pcDNA3.1 Exip-3 MKK6D/D1
P-p38
p38
0 1 2 4 8 12
HT-29/pcDNA3.1
0 1 2 4 8 12
HT-29/MKK6D/D1
10
Casp-9 activity (fold)
0 - + - +
6 8
4 2
- - + +
(hr)
은 세포고사의 기전에 의한 것임이 DNA 분절, PARP 분절, 미토콘드리아로부터 cytochrome c 방출 등의 실험결과로 확 인할 수 있었다(Fig. 2). Effector caspase-3와 -6의 활성화 여 부를 분석한 결과에서 caspase-3만 활성화되는 결과를 얻었 고(Fig. 3A), Caspase-3 활성화는 dox와 lova를 병용처리 시 상승적으로 증가하는 것으로 나타났다. 특히 Fig. 3B의 결 과에서도 돌연변이 p53 유전자를 갖는 HT-29 세포보다 정 상인 p53 유전자를 갖는 HCT-116에서 활성화는 약 3배가 증가되었다. Caspase-3 protease 활성을 조절하는 조절자는 death 수용체와 상호작용으로 활성화되는 caspase-8과 미토 콘드리아로부터 방출된 cytochrome c와 세포질 존재하는 Apaf-1이 복합체를 이루고 이것에 의하여 활성화되는 caspase-9 로 잘 밝혀져 있다.(25-27) 미토콘드리아로부터 cytochrome c 방출은 death receptor와 무관한 내적 세포고사 신호전달 경 로에 주요한 사항으로 작용하고 있다. p53에 의한 세포고사 에서 caspase 활성화의 관련성 여부에 관한 연구가 진행되 었고, 최근에는 발암유전자로 형질전환시킨 생쥐 배아 섬 유아세포의 p53 의존적 세포고사에서 Apaf-1 혹은 caspase-9 이 관여하고 있는 결정적인 연구결과가 보고되었다.(28-30) Dox와 lova로 유발된 caspase-3 단백분해효소 활성화를 조 절하는 조절자를 탐색한 결과, HCT-116 세포에서 capase-9 가 각각을 병용처리 시 약 8배 증가되었으나, caspase-8 단 백분해효소는 활성에 유의성 있는 변화가 없었다(Fig. 3A).
항암제에 의한 세포고사는 정상인 p53 유전자형 세포주에 서 상당히 진행되었고, caspase-3와 -9도 보다 많이 활성화 되는 결과와 caspase-9의 활성화에 영향을 주는 미토콘드리 아 cytochrome c 방출도 정상 p53 유전자형 HCT-116에서 보 다 많이 일어나는 결과로부터 dox와 lova는 p53 의존적 세 포고사를 유도하는 것으로 생각되었다(Fig. 3B).
위의 결과들로부터 dox와 lova가 정상 p53 유전자형 HC-119 세포에 p53의 발현을 조절하는 양상을 Western blot 분석법으로 수행하였다. DNA 손상을 유발하는 항암제인 dox는 p53 단백질의 세포 내 축적과 활성화를 4시간부터 유 도하였다(Fig 4A). Ras와, rho의 활성 억제제로 알려진 lova 는 dox로 유도된 p53의 활성화를 억제하는 것으로 나타났 다(Fig. 4B). 이 결과는 dox 단독처리로 p53이 활성화되고, lova와 병용처리 시 세포고사는 더욱 증가되었는데, p53 활 성화는 감소되고 24시간에는 완전히 억제되었다. 따라서 lova의 표적 분자가 p53의 활성화를 조절하고 이것이 어떻 게 p53을 경유하는 세포고사 신호전달경로를 조절하는 가 에 대한 연구는 현재까지 보고되지 않았고, 위 실험 결과만 으로는 그 기전을 알 수 없었다. 또한 G 단백질계의 저분자 단백질들인 ras, rho등은 MAPK의 활성을 조절한다. 따라서 p38 MAPK 억제제인 SB203580을 전처리한 후, dox와 lova 의 단독 혹은 병용처리한 세포에서 세포고사를 연구한 결 과, 활성화된 p38 MAPK가 lova에 의한 세포고사를 p53과 무관하게 억제시키는 결과로 나타났다(Fig. 5). 그러나 p38
MAPK의 영향도 정상인 p53 유전자형에서 큰 것으로 나타 났다.
Mammalian MAP kinase의 신호전달 경로에 대하여 많은 연구가 보고되었으며, 이들의 최종기작에 대하여 ERK의 경우는 주로 세포의 성장과 분화에 관여하는 반면에 JNK와 p38 MAP kinase는 세포고사와 관련되어 있다. p38 MAPK가 p53의 활성화를 조절하는 pro-apoptotic factor로 작용한다는 보고와, p38 MAPK가 anti-apoptotic factor로서 세포생존에 관여한다는 상반된 보고들이 최근 대두되고 있다. 특히 p38 MAPK 억제제의 처리 결과로부터 lova에 의한 세포고사에 서 p38 MAPK의 기능을 분석하기 위하여 상위구조에 해당 하는 MKK6의 활성형인 MKK6 D/D와 작용기전을 밝혀져 있지 않지만 p38의 alternative splicing variant로 pro-apoptotic 기능을 갖는 Exip에 대한 mammalian expression vector와 p53 유전자를 클로닝하여 그 발현을 확인하였다. p53유전자의 발현에 의한 항암제 감수성을 분석한 결과 HCT-116뿐 아니 라 p53돌연변이형인 HT-29에 pcDNA3.1 vector에 sense와 anti-sense로 클로닝하여 형질전환 세포에서 차이점을 발견 할 수 없었다(Fig. 6C). 그러나 p38 MAPK의 상방구조에 해 당하는 MKK6의 활성형인 MKK6 D/D와 p38의 alternative splicing variant로 pro-apoptotic 기능을 갖는 Exip로 형질전환 하여 각각 stable 형질전환 세포주를 확인하고 HT-29 세포 에서 항암제에 대한 감수성을 확인한 결과 세포독성이 증 가함을 보였다(Fig. 6D). MKK6 D/D와 Exip으로 형질전환된 HT-29 세포에 항암제 처리 시 세포독성이 세포고사의 증가 에 의한 것임을 MTT 분석, DNA 분절, PARP 분절, p38의 활성화 및 caspase 활성 분석(Fig. 7) 등의 결과로 알 수 있었 다. MKK6 D/D 형질전환세포에서 lova에 의한 세포독성은 HCT-116의 세포독성 수준으로 세포고사가 증가되는 결과 를 나타냈으나, PARP cleavage도 대조군에 비해 더욱 증가 하는 것으로 나타났다. 아울러 p38에 대한 인산화 반응은 2시간 이후부터는 점차 감소하는 것으로 보인다. Dox와 병 용처리 시 caspase-3, caspase-9의 활성은 HCT-116 수준으로 증가하지 않았다. 위의 결과는 lova에 의한 세포고사의 신 호전달은 미토콘드리아와 또 다른 경로에 의하여 유발됨을 시사하고 있다. 또한 MKK6 D/D 형질전환세포와 SB203580 에 의한 HCT-116 세포고사는 lova 처리 시 효과가 크게 나 타난 결과로부터, lova에 의해 유도된 세포고사는 p38 MAPK를 경유하며, p38 MAPK는 세포고사에서 생존인자 로 작용하고 있음을 보여주었다.
돌연변이 p53 암 억제 유전자형 MKK6 D/D/HT-29 형질 전환 세포에서 dox와 lova에 의한 세포고사는 증가와 정도 차이의 결과와 HCT-116 세포에서 dox와 lova의 병용처리 시 세포고사는 증가하나 p53의 활성화는 감소되는 결과로 부터 lova 유도 세포고사의 주된 신호전달경로는 p53과 무 관하며, p53과 p38 MAPK는 서로 다른 경로로 대장암 세포 의 세포고사를 조절하고 있음을 보여주고 있다. 위의 결과
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의 dominant negative 형의 플라스미드의 제조 및 형질전환 세포에 대한 선별과정과 이들의 기능분석을 토대로 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
결 론
Dox와 lova로 유도된 세포독성은 세포고사의 기전에 의 한 것으로, 각각의 항암제를 저 농도로 병용처리 함으로써 세포독성을 높은 수준으로 유발할 수 있는 것으로 생각된 다. 또한 p38 MAPK가 lova로 유도된 세포고사의 신호전달 경로에서 중요하게 세포고사를 조절하는 것으로 생각된다.
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