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서 론
슬관절의 안정성에 기여하는 중요 구조물인 전방십자 인대는 손상 후 부적절한 치유반응을 나타내는 반면에 내 측측부인대는 상대적으로 단기간에 걸쳐 기능적으로 잘 치유되는데, 이런 치유 능력의 차이에 대해 혈액공급, 해 부학적 위치, 내재된 세포 자체의 특성 등 많은 요인들이 제기되었다2-5,15,16). 그리고, Hefti 등11)은 완전히 절단된 전방십자인대들이 1년이 경과해도 전혀 재생 소견을 보 이지 않고, 오히려 인대의 잔여 부분들이 흡수되며, 관절
이 퇴행성 변화를 일으켰다고 보고하였다.
조직의 흡수 및 재형성 과정은 조직의 손상 후 필수적 인 치유 과정 단계이다. 세포외 기질의 시기 적절한 분해 와 새 기질의 침착이 중요하며, 이 과정에 기질 금속단백 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)들이 밀접 하게 관여한다. MMP는 중성에서 작용하는 아연-의존성 (zinc-dependent) 내부단백분해효소(endoproteinase) 로 세포외 기질 단백질 대부분을 가수분해하며, 성장인 자, 호르몬, 세포인자, 세포의 형질변형 등에 의해 조절
슬관절 전방십자인대 신연 손상에 따른 기질 금속 단백 분해 효소(MMP)-2의 발현
우영균․송석환․권순용․이화성․김영훈
가톨릭대학교 의과대학 정형외과학교실
Matrix Metalloproteinase (MMP)-2 Expression Related to Stretch Injury of the Anterior Cruciate Ligament in the Knee
Young Kyun Woo, M.D., Seok Whan Song, M.D., Soon Yong Kwon, M.D., Hwa Sung Lee, M.D., and Young Hoon Kim, M.D.
Department of Orthopedics, St. Mary's Hospital, The Catholic University, Seoul, Korea
P u rp o s e : Tissue remodeling is essential for the natural healing of damaged tissue. The matrix m etalloproteinases (M M Ps) that degrade the extracellular m atrix to play a central role in this process. This study w as designed to exam ine the basic relationship betw een M M P-2 and anterior cruciate ligam ent (ACL) injury.
M a te ria ls a n d M e th o d s : After the femur-ACL-tibia complex was harvested from rats, the conti- nuous release of MM P-2 in the stretch group was evaluated. The com plexes were divided into three groups. To stretch the com plexes, in group I, 5 and 12 N w eights w ere used for 10, 30, and 60 m inutes. In group II, 5 and 15 N weights were used for 5, 10, 30, 60, and 120 m inutes. And in group III, 5, 8, 10, 12, and 15 N weights w ere used for 30 and 60 m inutes. M M P-2 activity w as evaluated using 0.05% gelatin zym ography.
R e s u lts : MMP-2 was expressed and the signal intensity was increased according to the stretch duration and m agnitude. In the tissue analysis, active M M P-2 w as m arkedly present and the ex- pression w as increased in response to the stretch in the supernatant sam ples.
C o n c lu s io n : MMP-2 was released immediately after ligament injury and its activity was increased in proportion to the stretch duration and m agnitude. It is believed that M M P-2 expression plays an im portant role in the rem odeling process after an ACL injury.
K e y W o rd s : Knee, Anterior cruciate ligament, Stretch injury, Matrix metalloproteinase
통신저자：이 화 성
서울시 영등포구 여의도동 62 가톨릭대학교 성모병원 정형외과
TEL: 02-3779-1192․FAX: 02-783-0252 E-mail: [email protected]
Address reprint requests to Hwa Sung Lee, M.D.
Department of Orthopedics, St. Mary's Hospital, The Catholic University, 62, Yeouido-dong, Yeongdeungpo-gu, Seoul 150-713, Korea Tel: +82.2-3779-1192, Fax: +82.2-783-0252
E-mail: [email protected]
된다6,7,14). 정형외과의 분야에서도 MMP에 관한 연구들 이 이루어져 왔는데, 추간판의 변성 변화나 인공관절 치 환물의 해리, 관절염에서의 관절면 손상 등과 밀접하게 관련성을 가지고 있으며, 근래에는 인대의 섬유아세포들 이 조직의 재형성, 복원, 세포외 기질의 분해 같은 일련의 과정들에 관여하는 많은 MMP들을 생산하는 것이 밝혀 졌다9,10,12,17)
.
본 실험에서는 자연 치유 능력이 미약한 전방십자인대 의 손상 시 조직의 재형성 과정에 관여하는 MMP가 손상 정도에 따라 어떻게 발현되는지 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 실험군 및 신연 손상 방법
평균 약 400 gm의 생후 4개월된 쥐의 양 다리에서 각각 대퇴골-전방십자인대-경골 복합체를 획득하였으며, 대 퇴골 및 경골에 골 견인을 할 수 있도록 구멍을 내어 겸자 를 걸고 골시멘트와 같이 수압 하중 장치(hydraulic load frame, Instron Inc., USA)에 고정하여 신연을 시킬 수 있도록 하였다(Fig. 1). 우선 MMP-2가 수상 후 인대로 부터 지속적으로 발현이 되는지를 알아보기 위해 쥐 5마 리의 양 다리에서 인대 복합체를 얻어 한측은 손상을 가 하지 않은 정상 대조군으로, 한측은 실험군으로 하여 30 분 동안 15N의 힘으로 인대를 신연시키고 비교하였다.
다음 실험으로 30마리의 쥐로부터 인대 복합체를 얻어
세 실험군으로 나누었다. 제1군은 인대에 가해진 손상 시 간이나 힘의 크기에 따른 변화를 알아보기 위해 8마리 16 개 인대 복합체를 이용하여 각각에 10, 30 및 60분 동안 5N과 12N의 힘으로 신연 손상을 주었다. 제2군은 주로 손상시간에 변화를 주어 이에 대한 MMP-2의 반응을 관 찰하고자 하였고, 11마리 22개 인대 복합체를 얻어 5, 10, 30, 60 및 120분으로 시간의 변화를 주며, 5 및 15N 의 힘을 가하였다. 제3군은 가해지는 힘의 크기에 따른 MMP-2의 변화를 알아보기 위해 11마리 22개 인대 복합 체에 각각 5, 8, 10, 12 및 15N의 서로 다른 힘을 가하고, 손상 시간은 30분 및 60분으로 하여 검사하였다.
2. 표본 수집
신연 손상 완료 후 즉시 인대만 박리하여 PSF (peni- cillin 100 U/ml, streptomycin 100μg/ml, fungizone 0.25μg/ml)-PBS (phosphate-buffered saline)로 세 번 세척하고, 200 ul 10% FBS-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)을 이용하여, 37oC, 5% CO2
조건하에서 배양하였다. 우선 MMP-2의 지속적 발현 여 부를 조사하기 위하여 배양액에서 100 ul씩 1주 동안 24 시간 간격으로 채취하였다. 각 군에 대해서는 제1군은 배 양액에서 100 ul를 배양 12 및 24시간 후 얻었고, 이전 실험의 결과에 근거하여 제2군과 제3군에서는 배양 24시 간 후에 100 ul씩 배양액을 채취하였다. 배양액에 대한 채취가 모두 끝난 후에는 인대들을 꺼내어 가능한 한 아 주 작게 자르고 갈아서 균질되게 한 다음, 200 ul Lae- mili 완충 시약(62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 25% gly- cerol, 2% sodium dodecyl sulfate, 0.01% bromophe- nol blue)과 혼합하였다.
3. MMP-2 발현 분석
0.05% gelatin zymography를 이용하여 MMP-2의 발현 정도를 평가하였다. 배양 상층액 표본에서 각각 10 ul씩 채취하여 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)- polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 이용하 여 전기 영동 분리하고, 1.5시간 동안 Triton X-100으 로 세척하였다. 그 후 단백질 분해 완충제(proteolysis buffer, 50 mM CaCl2, 0.5 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7.8)에 담가 37oC, 5% CO2 조건으로 16시간을 배양하였 다. 배양 후에는 0.25% Coomassie Brilliant Blue로 완 Fig. 1. Schematic diagram of the stretch chamber.
Clamps Polycarbonate
medium chamber
Femur Ligament
Tibia
Medium
Bone
전히 염색시킨 다음, MMP-2를 의미하는 흰색의 밴드 모양이 나타날 때까지 탈염색을 시켰다. 인대 조직 자체 의 발현 관찰은 표본에서 각각 20 ul씩 채취하여 시행하 였으며 실험 방법은 상층액 과정과 동일하게 시행하였다.
각 밴드의 광학 밀도(optical density)는 NIH 영상 J 1.3 프로그램을 사용하여 평가하였고, 통계적 검증은 MMP-2 의 발현을 정상군과 비교하는 실험은 independent t-test, 각 군의 발현되는 양상에 대한 수치는 repeated
measure of ANOVA을 이용하여 시행하였다. 유의 수준 은 p=0.05로 하였다.
결 과
1. MMP-2의 발현
인대에 신연 손상을 준 후 관찰한 1주일 동안 배양액에 서 MMP-2를 검사한 결과, 1주일 동안 인대 조직으로부 터 계속적으로 MMP-2의 발현이 있었으며, 발현 강도는
Fig. 3. (A) The supernatant sample of the group 1. The signal of pro-MMP-2 bands was increased according to the stretch time and amount. The change was definitely present in the 24-hour collection sample. (B) The ligament tissue sample. Both of the pro- and active forms of MMP-2 were observed and the signal intensity of the band in the 12 N-stretched group was increased according to the injured time, compared with the 5 N-stretched group.
0 10 min. 30 min. 60 min.
Image measurement
Stretch time 200
220 240
A 260
pro-MMP-2
pro-MMP-2
Control 10 min
30 min 60 min
10 m in
30 min 60 min
5 N 12 N
12 hr collection
24 hr collection
12 hr. collection of supernatant
5 N 12 N
0 10 min. 30 min. 60 min.
Image measurement
Stretch time 180
200 220 240
24 hr. collection of supernatant
5 N 12 N
Control 10 min 30 min 60 min pro-MMP-2
Active-MMP-2
pro-MMP-2 Active-MMP-2
5 N stretch
12 N stretch
0 10 min. 30 min. 60 min.
Image measurement
Stretch time 50
100 200 250
Ligament tissue sample
150
pro-form (5 N)
pro-form (12 N) Active-form (5 N) Active-form (12 N)
B
Fig. 2. Comparison of stretch and non-stretch groups. Pro- and active MMP-2 in the super- natant was released continuou- sly for a week and the signal was gradually increased over time. The change was more evident in the stretch group.
No stretch
15 N/30 min.
1 day 2 day 3 day 4 day 5 day 6 day 7 day
pro form of MMP-2
pro form of MMP-2 Active form
시간의 경과와 함께 점차적으로 증가되었다. 신연 손상을 가하지 않은 정상 대조군에서도 시간이 지나며 약간의 증 가 소견이 관찰되지만, 실험군에서 더욱 뚜렷이 나타나는 것을 볼 수 있었고, 활성형(active form) MMP-2의 경 우 실험군에서는 관찰이 되었지만, 대조군에서는 전구형 (pro form)만이 나타났다(p＜0.05, Fig. 2).
2. 제1군
배양액의 MMP-2 발현에서는 인대에 가해진 손상 시 간이 증가함에 따라 전구형의 발현 강도가 증가하였고, 또한 주어진 힘의 크기에 대해서도 5N에 비해 12N의 표 본에서 더 강하게 나타났다. 표본 채취 시간에서는 12시 간보다 24시간 표본에서 더 뚜렷이 관찰되었다(p＜0.05, Fig. 3A). 인대 조직 분석에서는 활성형의 발현이 배양액 결과와 달리 뚜렷이 관찰되었으며, 시간이나 가해진 힘에 대한 전반적인 MMP-2의 발현 양상은 비슷한 결과를 보 였다(p＜0.05, Fig. 3B).
3. 제2군
15N의 신연 손상을 받은 표본의 MMP-2의 발현은 손
상 시간이 10분인 표본부터 시작하여 전구형의 발현 강 도가 증가되기 시작하였으며, 손상 시간이 증가함에 따라 더 강해졌다. 그러나, 5N의 표본에서는 MMP-2의 발현 은 손상 시간이 보다 더 많은 60분이 지나서야 변화가 뚜렷이 나타났다(p＜0.05, Fig. 4A). 인대 조직 표본에 서는 전구형 및 활성형 MMP-2가 모두 관측되었으며, 손상 시간이 지남에 따라 증가되는 발현 강도는 동일하였 다. 그렇지만 발현의 시작이 5N의 표본에서는 10분, 15N에서는 5분의 표본에서 이미 변화가 나타나기 시작 하는 것을 관찰할 수 있었다(p＜0.05, Fig. 4B).
4. 제3군
가해지는 힘의 크기가 증가할수록 발현되는 MMP-2 의 강도도 증가하였다. 5N의 힘이 가해진 경우 배양액 검사에서는 대조군과 비교적 비슷한 정도의 전구형 MMP-2가 발현되었으며, 8N의 표본에서부터 MMP-2 의 발현이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(p＜0.05, Fig. 5A). 인대 조직 관찰에서도 30분 손상 시간 표본에 서는 5N 힘 표본에서는 큰 차이가 없었다. 그러나 60분 손상 시간 표본에서는 5N의 힘에서도 전구형, 활성형 모
Fig. 4. (A) The supernatant sample of group 2. There was a slight increase of pro-MMP-2 level in the 5 N-stretched groups. In the 15 N-stretched groups, it was obviously increased according to the increase of the stretch time. (B) The ligament tissue sample. Both of the pro- and active MMPs-2 were observed and the level was increased with a greater strain, similar to the supernatant evaluation.
0 5 min
10 min
30 min 1 hr 2 hr Image measurement
Stretch time 220
240 260
A 280
pro-MMP-2
pro-MMP-2
Control
5 N stretch
15 N stretch
24 hr. collection of supernatant 5 N
15 N 5 min 10 min 30 min 60 min120 min
5 min 10 min
30 min 1 hr 2 hr Image measurement
Stretch time 50
100 200
B 250
pro-MMP-2 5 N stretch
15 N stretch
Ligament tissue sample 5 min 10 min 30 min 60 min 120 min
Active-MMP-2 pro-MMP-2 Active-MMP-2
150
pro-form (5 N)
pro-form (15 N) Active-form (5 N) Active-form (15 N)
두 발현이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(p＜0.05, Fig. 5B).
고 찰
조직의 재형성 과정은 정상 조직이나 손상된 조직에서 항상 일어나고 있으며, 오래되거나 손상된 조직들은 분해 되어 새로이 형성된 조직들에 의하여 교체된다. 이 과정 은 MMP와 이의 억제제(tissue inhibitor of metallo- proteinase, TIMPs)에 의해 조절된다. MMP는 기질 특 이성(substrate-specificities)에 따라 3종류로 나눈다.
원섬유 교원질(fibrillar collagen) I, II, III 형을 분해시 키는 교원질 분해효소(collagenase) 군으로 MMP-1, 8, 13, 18이 있고, 단백다당(proteglycan)들과 교원질의 비 나선형(non-helical) 영역을 분해하는 MMP-3, 10, 11 의 스트로멜리신(stromelysin) 군과 교원질 분해효소와 스트로멜리신에 저항적인 교원질 Ⅳ, Ⅴ 및 XI형과 이미 분해된 교원질을 분해시키는 MMP-2, 9의 젤라틴 분해 효소(gelatinase) 군으로 분류한다6).
MMP들은 대식세포, 호중구, 섬유아세포, 영양모세포, 자궁내막세포, 상피세포 및 여러 종양세포 등 다양한 세
포들에 의해 발현된다. 이 효소들은 연골 등 결체조직과 활액에도 또한 존재하고 있다13). Foos 등9)은 많은 MMP 와 TIMP가 전방십자인대에서 발현된다고 보고하였다.
전방십자인대는 소수의 섬유아세포들이 존재하며, 치밀 하고 규칙적인 배열을 지닌 결체조직으로, 혈관의 분포가 적어 단백질과 저분자 물질은 확산에 의하여 세포외 공간 으로 이동한다. 전방십자인대를 싸고 있는 활액막 조직은 섬유아세포와 대식세포양 활액세포(macrophage-like synoviocyte)의 두 가지 주요 세포로 구성되어 있다. 활 액막 조직과 전방십자인대 조직 사이에는 기저판이 없어 섬유아세포와 활액세포에서 분비되는 물질은 자유스럽게 인대 조직으로 확산되어 작용을 할 수 있으므로, 이들 세 포들에 의해 분비되는 MMP와 TIMP는 전방십자인대 강 도에 영향을 끼치는 조직 재형성 과정에 관여하게 된다9). 세포 간질의 교원질 분해효소는 교원질 분자의 α-사 슬에서 Gly-Ile/Leu 결합을 가수분해시킴으로써 삼중 나선형의 교원질을 3/4- 및 1/4- 크기의 교원질 조각으 로 분열시키고, 이 분열된 교원질은 변성된 교원질과 파 손된 교원질을 신속히 분해시키는 젤라틴 분해효소에 쉽 게 이환되어 다시 분해된다6). MMP-2는 또한 가용성 자 Fig. 5. (A) The supernatant sample of the group 3. There was no significant difference between the control and 5 N-stretch groups.
In the 8 N-stretch group, the pro-MMP-2 level was slightly increased according to the increase of the stretch amount. (B) The ligament tissue sample. The pro- and active MMPs-2 levels in the ligament tissue were increased with increasing strain.
0 15 N
Image measurement
Stretch amount 100
150 200
A 250
pro-MMP-2
pro-MMP-2
Control
30 min
24 hr. collection of supernatant 30 min.-stretch
60 min.-stretch 5 N 8 N 10 N 12 N 15 N
0 5 N 8 N 10 N 12 N 15 N Image measurement
Stretch amount 100
150
B 200
pro-MMP-2 30 min. stretch
60 min. stretch
Ligament tissue sample
Active-MMP-2
pro-MMP-2 Active-MMP-2
pro-form (30 min. stretch) pro-form (60 min. stretch) Active-form (30 min. stretch) Active-form (60 min. stretch) 12 hr. collection
60 min
12 hr. collection 5 N 8 N 10 N 12 N
Control 5 N 8 N 10 N 12 N 15 N
연 I형 교원질(soluble native type I collagen)을 교원질 분해효소에 의해 특징적으로 만들어지는 3/4- 및 1/4- 크기의 조각들로 분열할 수 있고, 재구성된 제I형 교원질 원섬유(reconstituted type I collagen fibril)를 분해할 수 있다. 그러나 같은 젤라틴 분해효소인 MMP-9는 동 일한 조건하에서 교원질을 분해할 수 없어 MMP-2의 이 와 같은 작용이 젤라틴 분해효소의 일반적인 성질은 아닌 것으로 생각된다1). 그리고 MMP에 대한 일반적인 억제 인자를 사용하여, 24시간 배양 후에는 40%까지, 72시간 후에는 80%까지 교원질의 분해를 억제하였고, 젤라틴 분 해효소에 대한 억제로 48시간 후에 90%까지 교원질 분 해를 감소시킬 수 있었다8). 이와 같은 사실로 미루어 보아 세포 간질의 교원질 분해효소와 젤라틴 분해효소와의 상호 작용이 염증성 및 침습성의 병 경과 과정 중에 결체조직에 서 교원질을 제거하는 데 중요한 요소라 할 수 있다.
본 실험에서 저자들은 전방십자인대가 손상된 후 MMP-2의 발현 상태를 평가하려고 시도하였다. MMP- 2 발현 정도는 인대에 가해지는 손상의 규모에 비례하여 증가되었다. 5 N의 힘이 가해졌을 때는 10분의 손상 시 간이 지난 후에 MMP-2의 변화가 관찰된 반면에 15N의 신연 손상에서는 5분의 시간에도 증가가 뚜렷이 나타난 것으로 보아 충분한 힘으로 인대에 손상이 가해지면 짧은 시간에도 MMP-2가 즉시 발현되는 것을 알 수 있었고, 같은 5N의 다소 약한 손상 강도라도 손상 시간의 증가에 따라 발현 강도가 커져 인대에 가해지는 손상 시간 역시 중요한 MMP-2의 발현 요소라 할 수 있다. 그리고 신연 손상을 주지 않은 대조군에서는 활성형의 MMP-2가 발 현되지 않았고, 실험군에서도 장기간의 배양 후에는 활성 형이 배양액 검사 결과에서 보였으나, 단기간 배양 검사 결과에서는 인대 조직 표본에서만 활성형 MMP-2의 발 현이 있었다. 이는 인대가 손상을 받으면, 전구형의 MMP-2가 우선 분비되며 배양액으로 흘러나오고, 이후 시간이 지나면서 인대 조직 내에서 전구형을 활성형으로 전환시키고 분비하는 것으로 여겨진다. 이 같은 사실에 비추어 보아 전방십자인대의 손상이 일어나면 MMP에 의해 조직의 흡수가 일어나며, 연속되는 재형성 과정에 영향을 끼쳐 파열된 인대의 치유 과정과 관련이 있을 것 으로 생각된다. 따라서 MMP 발현에 관여하는 세포내 신 호 전달 경로를 확인하여, 이를 차단함으로써 인대 손상 후 치유 과정에 도움을 줄 수 있을 것으로 추측된다. 후속
적인 검사가 더 요구되며, MMP의 작용에 대해 중요한 조절 기능을 갖고 있는 TIMP의 관련성에 대해서도 본 실 험에서는 이루어지지 않아, 이에 대한 더 정밀한 실험이 연구되어야 할 것으로 생각된다.
결 론
전방십자인대의 손상 시 조직의 흡수 및 재형성 과정에 관여하는 MMP가 가해지는 힘의 세기와 노출되는 시간 에 비례하여 발현 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있었 다. 손상이 심할수록 MMP의 발현이 증가되는 결과를 보 여, 이에 대한 억제 및 조절 기전에 대한 후속 연구를 시 행함으로써 전방십자인대 손상 후 치유 과정에 유효한 방 법을 제시할 수도 있을 것으로 생각된다.
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= 국문초록 =
목 적: 조직 재형성 과정은 손상된 조직의 자연 치유에 필수적이다. 세포외 기질 분해에 관여하는 기질 금속단백 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)가 이 과정에서 중요한 역할을 하는데, 본 연구는 전방십자인대의 손상에 따른 MMP-2의 발현을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법: MMP-2의 지속적인 발현 여부를 파악하기 위해 쥐에서 대퇴골-전방십자인대-경골 복합체를 얻어 신연 손상을 가한 후 1주일간 관찰하였다. 그 후 인대 복합체를 세 군으로 나누어, 제1군은 5 N 및 12 N으로 10, 30, 60분 동안, 제2군은 5와 15 N의 힘으로 5, 10, 30, 60 및 120분 동안, 제3군에서는 5, 8, 10, 12 및 15 N 하에 각각 30 및 60분 동안 손상을 주었다. MMP-2의 발현은 0.05% gelatine zymography를 이용하여 검사하였다.
결 과: 인대 손상 후 MMP-2의 지속적인 분비를 관찰할 수 있었으며, 발현 강도는 손상 받은 시간이나 가해진 힘의 크기에 비례하여 증가하였다. 인대 조직 자체의 검사에서는 배양액의 결과보다 전구형의 발현 강도는 미약 했으나, 활성형은 더욱 뚜렷이 나타났으며, 손상 시간 및 크기에 따라 발현 정도는 역시 증가하였다.
결 론: MMP-2는 인대 손상 후에 즉각적으로 발현되었으며, 강도는 손상 시간이나 가해진 힘에 비례하여 증가하 였다. MMP-2의 발현이 인대 손상 후 진행되는 조직 재형성기 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
색인 단어: 슬관절, 전방십자인대, 신연 손상, 기질 금속 단백 분해 효소
