인체 두피 모낭의 장기간 배양을 위한 기관 배양 배지의 개발
유보영·윤희훈·신연호·서영권·이두훈·송계용*·황성주**·박정극† 동국대학교공과대학생명화학공학과
100-715 서울시중구필동 3가 26
*중앙대학교의과대학병리학교실
140-757 서울시동작구흑석동 221
**황성주털털피부과
135-887 서울시강남구신사동 513-1 동원빌딩 4층
(2005년 12월 10일접수, 2006년 1월 20일채택)
Development of Organ Culture Medium for Long Term Culture of Human Hair Follicle
Bo-Young Yoo, Hee-Hoon Yoon, Yeon-Ho Shin, Young-Kwon Seo, Doo-Hoon Lee, Kye-Yong Song*, Sung-Joo Hwang** and Jung-Keug Park†
Department of Chemical and Biochemical Engineering, Dongguk University, 3-26, Pil-dong, Chung-gu, Seoul 100-715, Korea
*Department of Pathology, Chung-Ang University, 221, Heukseok-dong, Dongjak-gu, Seoul 140-757, Korea
**SJ Hair Hair Clinic, Dongwon Btd, 513-1, Sinsa-dong, Kangnam-gu, Seoul 135-887, Korea (Received 1 December 2005; accepted 20 January 2006)
요 약
본연구에서는인체두피조직에서미세수술법을이용하여모낭을성공적으로분리하였으며다양한조건으로액침 기관배양을수행하였다. 우태아혈청첨가시모낭의길이성장이저해되는것으로확인되어무혈청배지조성을시도 하였다. 무혈청배지로는모낭기관배양에널리이용되는 Williams’E medium을기본으로하는 Philpott medium과자 체개발한고농도아미노산과비타민(B군) 조성의 DHGM(Dongguk hair growth medium)을이용하였다. 그리고 IMDM
은 DHGM의비교대조군으로이용하였다. 연구결과 Philpott medium과 IMDM으로배양한모낭은구조상으로는길 이성장이각각 9일과 12일정도에멈추며, 낮은알카라인포스파테이즈발현, CK19 발현이거의없는것으로보아 세포사멸에의한퇴화(regression)가빠르게일어나는것으로판단되었다. 반면, DHGM으로배양한모낭은상대적으로 긴기간동안성장기의구조를보이며 25일까지지속적인길이증가및 3배높은알카라인포스파테이즈발현, 전반
적인 CK19 발현을나타내었다. 따라서고농도의아미노산및비타민배지조성이생체외에서모낭을장기간배양하
는데중요한역할을하는것으로판단된다. 이러한배양방법은장기간검사를필요로하는모낭에대한기초생물학 적연구뿐만아니라새로운탈모치료제의효능평가분야에이용될수있을것이다.
Abstract −We successfully isolated human anagen hair follicles from human scalp skin by microdissection and tried to culture them under various conditions. First we confirmed negative effect of serum on human hair follicle organ cul- ture. As a next step serum-free medium compositions, Philpott medium, IMDM, and DHGM (Dongguk hair growth medium) were tried. Philpott medium is a general medium for hair organ culture based on Williams’ E medium and DHGM is a special self-developed medium containing high amino acids and vitamins (B group) composition. As results, hair follicle in Philpott medium and IMDM showed anagen phase morphological structure, but rapid loss of hair elon- gation, low alkaline phosphatase expression, and very low expression of CK19. It is thought these hair follicles rapidly regressed from apoptosis. However, hair follicles in DHGM showed long term anagen phase morphological structure, continuous hair elongation, high alkaline phosphatase, and CK19 expression. These results demonstrate that high amino acids and vitamins (B group) composition are essential to in vitro long term human hair follicle organ culture and this culture medium will be useful in basic study of hair biology or application study to the development of alopecia treat- ment drugs.
Key words: Hair, Organ Culture, Medium, Hair Length, CK19, Alkaline Phosphatase
†To whom correspondence should be addressed.
E-mail: [email protected]
1. 서 론
모낭은비록작지만외배엽(ectoderm)과중배엽(mesoderm) 유래
의다양한세포가층상구조를이루는복잡한하나의기관(organ)이
다. 또한, 모낭은풍부한피부줄기세포의저장고로서이세포들이
증식, 이동, 분화되어재생이나상처의치유에관여한다[1]. 특히모
유두(dermal papilla)와모기질(matrix) 사이의상피-진피간상호작용
(epidermal-dermal interaction)에의해성장기(anagen), 퇴행기(catagen),
휴지기(telogen)로이루어지는세단계의주기(life cycle)를거치면 서모발의교체가일어나게된다. 이와같이모낭의성장과유지를
조절하는모유두는태생기에형성되어 15~20회의주기를거치며점
차퇴화되는기관으로알려졌다[2].
그러나이러한성장기, 퇴행기, 휴지기주기에관련된정확한분 자생물학적기작은아직알려져있지않다. 특히탈모와관련된기 작은 남성형 탈모에 한정되어 남성 호르몬인 테스토스테론
(testosterone)이 5α-환원효소(5α-reductase)에의해디하이드로테스 토스테론(dihydortestosterone, DHT)으로전환되고, 이것이안드로
젠수용체(androgen receptor)와결합하면모유두가퇴화되고모발
이탈락하게되는것만이밝혀져있다[3].
따라서발모및육모제등과같은탈모치료제의효능을평가하는 데있어상당한제약이따르게되며, 분자생물학적인분석보다는동 물을이용한생체내실험이주를이룬다. 그러나털이많이존재하 는동물들(설치류등)을이용할경우종(species) 차이가심하게발 생하며[5, 20], 인간과유사한자연적인 대머리동물(stumptailed
macaque)의경우에는비용이상당히많이들어사실상평가하기가
쉽지않다[19]. 그뿐만아니라최근동물보호차원에서동물시험이
사회적으로비판을받고있는실정이다.
따라서이러한평가를위하여인체모낭을생체외에서기관배양
(organ culture)하려는많은노력이시도돼왔다. 특히최적의환경
을제공하기위하여다양한배지조성들을연구하였는데, 혈청
(serum)은부정적인효과를유발하는것으로알려져대부분의연구
자가무혈청배지조성으로실험을진행하고있다.
혈청에는모낭세포의 성장을저해하는 transforming growth
factor-β(TGF-β)가포함되어있어생체외에서모낭의조기퇴화를
유발하는것으로알려졌다. 1~20％송아지혈청을첨가후배양한
경우보다무혈청배지로배양한경우길이성장기간이눈에띄게 증가하는것을확인할수있었으며혈청농도가높은경우에는혈 청내세포부착인자로인해기관배양시모낭이배양용기바닥에 부착되어외측모근초에서세포가분리되면서모낭구조의변형을가 져오기때문에모낭기관배양에무혈청배지가필수적이다[5, 6, 7].
1992년이후로보편적으로사용되는배지는 Philpott 등[6]이개발한 것으로기본배지인 Williams’E medium에 10 ug/ml insulin, 10 ug/ml transferrin, 10 ng/ml sodium selenite 그리고 10 ng/ml hydrocortisone
을첨가한조성이다. 이밖에 Kealey 등[5]은 Philpott medium에글 루타민(L-glutamine)을 2 mM보다높은 4 mM로첨가하여배양했
을때모낭내세포들의 ATP 합성량이증가하는것을보고하였다.
그러나이와같은노력에도현재의배양기술로는장기간배양이 어려워, 오랫동안의효능평가가있어야하는경우에있어상당한 제약이된다.
이러한문제를해결하기위해우리는몇가지가정을하였는데 특히영양분공급의제한이라는것에초점을맞추었다. 모낭은작
지만하나의복잡한기관으로서그내부에는외배엽유래의외측모 근초(outer root sheath), 내측모근초(inner root sheath), 모기질
(matrix), 멜라닌세포(melanocyte)들이, 그리고중배엽유래의모유 두(dermal papilla), 결직초(dermal sheath) 세포들이존재한다. 따라 서싸이토카인(cytokine)이나성장인자(growth factor)를통한근접 신호전달(paracrine signaling)뿐만아니라직접적인세포-세포간 상호작용(direct cell-cell interaction)은생체외에서도어느정도유 지될것으로가정하였고다만생체외로옮겨지면서혈관으로부터 의능동적인영양공급이차단되고단지확산에의한약하고미흡 한수동적인영양공급으로인하여장기간배양이어려울것이라 가정하였다. 즉, 기존의연구들은대게이미조성이알려진배지에 여러성장인자등을첨가하여모낭의생존기간을연장하려는연구 였으나본연구에서는모낭의장기간배양용배지자체의조성을 개발하려고하였다. 이러한가정을뒷받침해주는하나의근거로서 미식품의약품안전청(USA FDA)의허가를받은혈관확장제인미
녹시딜(Minoxidil)의효과로서, 모낭에충분한혈류를흐르게함으
로서모발을유지시키는것으로알려졌다[8]. 그리고미녹시딜은생
체외에서모유두세포의배양시모낭성장을촉진하는 vascular
endothelial growth factor(VEGF)의생산을자극하여모낭세포의증
식을촉진하는것으로알려졌다[4]. 그리고다른조직에서보고된
몇가지예로서, 장간막허헐(mesenteric ischemia)인경우에비필 수아미노산의하나인글라이신(glycine)를첨가하면 pro-apoptotic gene product인 bax와 caspase-3 발현을낮춰주며 anti-apoptotic gene product인 bcl2 발현을높인다는것이보고되었다[18]. Tanaka 등[24]
은 L-세린(L-serine)이신경세포의생존을유지시키며, L-세린과글 라이신이 anti-apoptotic gene product인 Bcl-w를증가시켜 apoptosis
를저해시킨다는것을확인했다. 이밖에도하이브리도마세포배
양시다양한비타민이 bcl-2 발현을증가시켜 apoptosis를저해한다
는보고가있다[23].
그리고대외적으로그조성이공개되고있지는않지만, 첨가되는 혈청의양을줄이거나또는특정세포(조혈모세포등)를무혈청조 건에서배양하기위한목적으로개발된다양한상업적배지들도고 농도의아미노산및비타민을함유하는것으로여겨지고있다.
이러한근거를바탕으로우선필수아미노산과비필수아미노산이 모두포함돼있는 IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s medium) 기 본배지조성을바탕으로아미노산과비타민(B군)을 2배로함유하 는고농도배지인 DHGM (Dongguk hair growth medium)을개발 하였다. 일반적으로생체외에서세포들이에너지원으로포도당
(glucose)보다는글루타민(L-glutamine)을이용하므로포도당의농도 는 2,000 mg/L로낮추고글루타민의농도를 4mM로증가시켰다[11].
생체내모낭의모유두주변조직에서축적된 Cu2+와결합하는 구리결합펩타이드에의해모발의길이성장을확인할수있는데,
생체외에서는주변조직의부재로인한 Cu 결핍을보완하기위해
10-4µg/ml의농도로첨가하였다[10, 11, 12]. 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)은 Cu와결합하여 peroxyl radical trap 작용을 하는것으로알려져있어 peroxide에의한 apoptosis를저해시킬것 으로판단된다[11].
모발을형성하는모기질세포는가장빠르게증식하는세포중 하나이며포유동물중손상에가장민감한조직이므로 DNA 안정 성과 치유에중요한 작용을하는 Zn이필수적이며[13, 14, 15],
endonucleases의저해제로모낭퇴행기에일어나는각질형성세포
(keratinocyte)의 apoptosis 작용을억제하는작용을통해퇴행기로의 진행을더디게만들수있을것으로판단되어배지에첨가하였다
[13, 16].
그리고기본적인세포배양에이용되는 insulin, transferrin, sodium selenite 그리고 hydrocortisone 등은 Philpott medium과같게첨가하 였다. 이렇게개발된배지를이용하여모낭기관배양을하였으며,
모낭의형태, 길이성장, 알카라인포스파테이즈정량, 조직학적분 석을하였다.
2. 실험재료 및 방법 2-1. 모낭의 분리
인체두피모낭은모발이식술시노출된모발의길이가짧아식 모기장착이어려운후두부모낭이나외과시술시제거되는두피조 직에서시술환자의동의를얻어사용하였다.
분리된두피조직을기관배양용배지에담아실험실로이송후
Philpott 등[5]의방법을응용하여모낭을분리하였다. Scalpel blade No. 10을이용하여표피(epidermis)와유두층(papillary dermis)을제거 후육안을통해망상진피(reticular dermis)와피하지방층(hypodermis)
에서모낭을분리하였다. 모낭을두피조직으로부터분리한후입체 현미경을통해남아있는주위조직을세밀하게제거하였다. 기관배 양에는현미경상으로관찰하였을때모유두와진피초의손상이없 는성장기모낭만을사용하였으며모발의성장이미비한경우는결 과에서제외하였다.
2-2.액침배양법을이용한인체두피 모낭의기관배양
24-well plate(SPL, Korea)에모낭 1개씩을넣고배지 500µl를 첨가하여액침배양을실시하였으며 2일간격으로배지를교환하였 다. 이때사용한배지는 Philpott medium, IMDM, DHGM으며첨 가물은별도의표기가없을경우 Sigma 제품을사용하였다. Philpott medium은 Williams’E medium(Gibco BRL, USA)에 10µg/ml insulin, 10 ng/ml hydrocortisone, 10µg/ml transferrin, 10ng/ml sodium selenite
그리고 50 U/ml gentamicin(Welgene, Korea)을넣어제조하였다. 먼 저혈청의효과를확인하기위하여 Philpott medium에 5％우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)를 첨가하여 배양하였다. 그리고
IMDM(Welgene, Korea)과 DHGM에는앞의첨가물외에 4 mM(최 종농도) L-glutamine, trace elements(10−4µg/ml cupric sulfate, 10−4µg/ml zinc sulfate, 10−4µg/ml manganese sulfate, 2×10−4µg/ml iron sulfate, 20mg/l bovine serum albumin)를추가로넣어 주었다.
이세 가지 배지의기본 조성은 Table 1과 같다. 세 가지조건
모두사진촬영은배지교체시에수행하였으며 이때모구형태 와모낭길이증가변화량그리고외측모근초세포성장에대해 서관찰하였다.
2-3. 실체현미경을통한모낭의구조적변화와길이성장측정 모낭의길이성장은입체현미경을통해다음과같이관찰하였다. 2배의접안렌즈와 10배의대물렌즈를사용한입체현미경(stereoscope,
KSZ, Korea)를이용하여위상차를없애기위해배지제거후관찰
하였으며실험시작일을 0일로하여 25일까지사진을찍어비교하 였다. 모낭의길이는모구끝에서모간절단부까지총길이를측정 하였으며모낭의건조를막기위해배지제거후신속하게디지털
Table 1. Composition of Philpott medium, IMDM, and DHGM Philpott medium IMDM DHGM INORGANIC SALTS
CaCl2 200 165 165
CuSO4²5H2O 0.0001 - -
Fe(NO3)²9H2O 0.0001 - -
KCl - 330 330
KNO3 - 0.076 0.076
MgSO4 97.67 98 98
MnCl2·4H2O 0.0001 - -
NaCl 6800 4800 4800
NaHCO3 2200 3024 3024
Na2HPO4 140 111 111
ZnSO4·7H2O 0.0002 - -
OTHER COMPONENTS
D-Glucose 2000 4500 2000
Glutathione 0.05 - -
Methyl Linoleate 0.03 - -
Sodium Pyruvate 25 110 110
HEPES 2383 5958 2383
Phenol Red 10 15 15
AMINO ACIDS
L-Alanine 90 25 50
L-Arginine·HCl 50 50 100
L-Asparagine(anhydrous) 18.86 25 50
L-Aspartic acid 30 30 60
L-Cystine 40 - -
L-Cystine·2HCl 26.10 91.2 182.4
L-Glutamic acid 50 75 150
L-Glutamine 292 584 584
L-Glycine 30 30 60
L-Histidine·HCl·2H2O 15 31.05 62.1
L-Isoleucine 50 105 210
L-Leucine 75 105 210
L-Lysine·HCl 87.5 146 292
L-Methionine 15 30 60
L-Phenylalanine 25 66 132
L-Proline 30 40 80
L-Serine 10 42 84
L-Threonine 40 95 190
L-Tryptophane 10 16 32
L-Tyrosine·2Na·2H2O 50.70 - -
L-Tyrosine - 104 208
L-Valine 50 94 188
VITAMINS
Ascorbic acid 2 - -
Biotin 0.5 0.013 0.026
D-Ca Pantothenate 10 4 8
Choline Chloride 1.5 4 8
Ergocalcipherol 0.1 - -
Folic acid 1 4 8
i-Inositol 2 7.2 14.40
Menadione Sodium Bisulfate 0.01 - -
Niacinamide 1 4 8
Pyridoxal·HCl 1 4 8
Riboflavin 0.1 0.4 0.8
α-Tochopherol Phosphate, Disodium 0.01 - -
Thiamine·HCl 1 4 8
Vitamin A Acetate 0.1 - -
Vitamin B12 0.2 0.013 0.026
카메라로사진촬영후일정한배율로확대하여오차범위가작은 자를이용하여길이를측정하였다(오차범위±5µm).
배지조성에따른모낭의퇴화정도를확인하기위해배지교체 시기에디지털카메라로촬영한모낭의모구상태를육안으로관찰 하였다. 지속적인모발성장이관찰되고, 모유두와매트릭스조직이 잘연결되어있는성장기모낭과모유두와매트릭스조직간의결 합이분리되기시작하며모유두와매트릭스조직을연결해주는
epithelial strand가형성되는퇴행기모낭, 모유두와매트릭스간의 연결이관찰되지않는휴지기모낭으로분류하여초기배양군대비 측정일의각주기의비율을백분율로나타내었다.
2-4.모낭의알카라인포스파테이즈양측정
모발유도능력이있는모유두에만선택적으로발현되는알카라 인포스파테이즈(alkaline phosphatase) 양을분석하기위해기관배 양을마친모낭에서미세수술법(microdissection)을이용하여모유 두만을분리하였다. 분리해낸모유두를단백질추출용액인 PRO- PREP(Intron, Korea) 100µl에모유두 10개를넣은뒤조직분쇄기 를이용하여모유두를분쇄하였다. 그리고 −20oC 에서 20분간반 응시켜모유두내에존재하는알카라인포스파테이즈를추출하였다.
추출된알카라인포스파테이즈는 96-well plate(bottom black, SPL, Korea)에 well 당 20µl의추출된알카라인포스파테이즈용액을첨 가후 20µl의 MgCl2와 160µl의 fluorescence assay buffer를첨가 하였다. 미리일정한농도로희석해두었던 4-methylumbelliferyl phosphate 기질을 well 당 1µl 첨가후잘섞이도록흔들어준뒤
fluorometer(Victor 3, Perkin Elmer, USA)를이용하여 excitation 파 장은 340 nm로, emission 파장은 440 nm로측정하여효소의활성 을측정하였다[17].
2-5.조직면역학적분석
액침배양을실시한모낭을 10％포르말린에고정한후파라핀블 럭을제조하고조직학적염색이가능하도록초박절편으로박절하여 슬라이드에부착시켜서 H/E 염색(hematoxylin/eosin staining)을실 시하여광학현미경으로관찰하였다.
활발한증식능을가지고있으며모낭내존재하는표피줄기또 는전구세포로추정되는세포에염색되는특이단백질인 CK19의 발현을관찰하였다[21, 22]. 고정된조직절편슬라이드를 0.3％ H2O2
용액에넣어 endogeneous peroxidase 활성을억제하고, 2％양혈청 과 0.5％말혈청을사용하여비특이성항체들을막아주었다. 이렇게 준비된조직절편슬라이드를 1차항체인 RCK108(DAKO, USA)로 상온에서 2시간동안반응시키고, 2차항체로는 biotinylated horse anti-mouse IgG(1:200 dilution, Vector, USA)를사용하여약 30분간 반응시켰다. 이들단계마다 Tris 완충용액으로 5분간 3번세척하였다.
그리고 avidin-biotin(Zymed Lab, USA)를결합시키고 daiaminobenzidine (DAB)으로발색하였다. Hematoxylin으로대조염색을하고, 3％
glutaraldehyde 용액으로고정하여 gel-mount(Biomedia, USA)로봉 입하고광학현미경하에서관찰하였다.
3. 결과 및 고찰 3-1.모낭의분리
병원으로부터이송된두피조직을분리직전까지기관배양용배지
에담아냉장보관하였으며 4시간이내에모낭을분리하였다(Fig. 1).
그결과성장기모낭을 80％이상의수율로분리할수있었으며입 체현미경으로확인한결과모낭구조의파괴나손상이없음을확인 할수있었다. 따라서이러한운반및분리조건이모낭분리에적 합함을알수있었다. 그리고분리된모낭을입체현미경으로검사 하여모유두와모기질세포세포가연속적으로연결되어있는구조 를지니는모구의손상이없는모낭을성장기모낭으로(80％이상,
Fig. 2(a)), 그리고비연속적으로되어있거나모유두와모기질세포
가탈락되어있는모낭을퇴행기및휴지기모낭으로분류할수있 었다(Fig. 2(b), (c)).
3-2.장기간배양용배지를이용한 인체두피모낭의 기관배양 우선 5％ 혈청의효과를 확인한결과, 선연구자들의연구결과 와마찬가지로모유두를감싸고있던매트릭스조직의과증식이 관찰되었으며 배양 4일째에는매트릭스와모유두가분리되면서 퇴행기에서 관찰되는양상인매트릭스부위가곤봉모형태로바 뀌면서모유두가분리되는구조상의변형이관찰되었다(Fig. 3).
Fig. 1. Schematic diagram of procedure to isolate hair follicle from scalp dermis.
Fig. 2. Microscopy of isolated human hair follicle (a: anagen phase, b: catagen phase, c: telogen phase).
이러한구조적 변형은저농도(1％)의 혈청에서도배양 4일에서
7일째사이에동일하게나타나는 것으로보아혈청농도에비례
하여모낭의퇴화가진행되는것으로판단되었다. 따라서혈청은 모낭의장기간배양에부적합한것으로판단되어이후실험에는 배제하였다.
장기간배양용배지조성이인체두피모낭의성장에미치는효
과를확인하기위해기존여러연구자가사용했던 Philpott medium
을대조군으로사용하였다. 배양동안의상태를확인하기위해입
체현미경(X30)에연결된디지털카메라로사진촬영을하였는데, 입
체현미경으로부터발산되는빛으로인하여촬영소요시간이 5분정 도경과하면상당히건조되어심각한모낭손상을유발하였다. 따 라서이를보완하기위해배지를첨가하여촬영을하였으나, 배지 의양이많게되면모구부분이아래쪽으로향하고모발부분이위 쪽으로향하게되어위상차가발생하게되고길이측정에오류가발 생하게되었다. 따라서기존의배지를제거한후새로운배지를배 양용기의바닥에적셔지는정도의양(10µl/cm2)만을첨가하여촬영 함으로써문제를해결하였다. 배양 2일째부터두가지배지에서모 두외측모근초와모발의성장을동시에확인할수있었으며배양전
보다일시적으로모구가팽윤되는것을확인할수있었다(Fig. 4, 5, 6).
생체내에서와달리액침배양에서는주위조직의부재로인한공간 적인한계가없기때문에일시적으로미각질화된모피질과모수질 이길이성장이아닌모구의부피증가양상으로나타났으며앞으 로콜라젠젤등에삽입되어있는형태의 3차원조직모델을이용 하여주위조직의치밀성으로공간적인한계를부여한다면해결될 것으로판단된다.
모발길이증가경향을보면 Philpott medium의경우배양 9일째
Fig. 3. Regression of hair bulb structure caused by fetal bovine serum after 4 days of organ culture (a: Philpott medium only b: Philpott medium with 5％ FBS).
Fig. 4. Morphology of organ cultured hair follicles in Philpott medium, which is Williams’E medium supplemented with 10ng/ml hydro- cortisone, 10 µg/ml insulin, 10 µg/ml, transferrin, 10ng/ml sodium selenite, and 0.2％ BSA (Arrows indicate starting points).
Fig. 5. Morphology of organ cultured hair follicle in IMDM supple- mented with 10 ng/ml hydrocortisone, 10 µg/ml insulin, 10 µg/ml transferrin, and 10 ng/ml sodium selenite, 0.2％ BSA, and trace elements (Arrows indicate starting points).
Fig. 6. Morphology of organ cultured hair follicles in DHGM supple- mented with 10 ng/ml hydrocortisone, 10 µg/ml insulin, 10 µg/ml transferrin, and 10 ng/ml sodium selenite, 0.2％ BSA, and trace elements (Arrows indicate starting points).
부터는길이증가가전혀나타나지않았다. 배양기간(9일) 동안의 평균길이증가율은 0.273 mm/day로확인되었다. 그리고 IMDM의 경우배양 12일째까지만지속적으로증가하였으며(Fig. 7), 12일동 안의평균길이증가율은 0.312 mm/day로측정되었다. 반면 DHGM
의경우비록배양 20일째부터모발의길이증가가둔화하지만배 양 10일째까지의길이증가율은 0.372 mm/day로생체내길이증
가속도인 0.4 mm/day와큰차이를보이지않았으며 25일째까지
길이증가를관찰할수있었다. Philpott medium으로배양한모낭
과비교하여최종적으로는약 2배이상의모발길이증가를나타내
었다(Fig. 7). 실험에사용한각군의모낭은같은기증자로부터제
공된모낭을사용하였으므로개체차이에따른변수는없었을것으 로판단된다.
배양중간에모낭이퇴화하는경우가있으므로모발길이증가가
나타나는시기인성장기의비율을 Table 2에나타냈다. 모든조건에
서배양기간이길어짐에따라성장기모낭의비율이감소하는경향
을관찰할수있었으며 IMDM과 DHGM의경우성장기모낭의감
소경향이 Philpott medium에비해더디게나타나는것을확인할
수있었다. Philpott medium의경우배양 2일째부터성장기모낭의 비율이감소하며배양 12일째는 29.2％로 IMDM의경우 54.2％,
DHGM의경우 66.7％인것에비해크게차이가나는것을확인할
수있었다(Table 2).
새로운모낭을유도할수있는모유두에만발현되는것으로알려 진알카라인포스파테이즈의정량분석을수행한결과배양 4일째부 터 Philpott medium에비해 DHGM의경우발현량이 3배이상증 가한양상을나타냈으며이러한경향은배양 12일째까지유지되었 다(Fig. 8).
액침배양한모낭의내부구조변화를확인하기위해 H/E 염색과 모낭줄기세포에특이적으로나타나는 CK19에대한면역조직화학 염식을실시하였다[11, 12]. 일반적으로모낭에존재하는상피전구 세포또는줄기세포가 CK19를발현하며, 성장기초기에는협부, 팽 윤부, 모구부근에서발현된다고알려졌고, 퇴행기로진행됨에따라 팽윤부의외측모근초의전구세포들이모구쪽으로이동하게되고외 측모근초의최외각에전체적으로분산되어나타나는것으로알려졌 다. Philpott medium으로 10일배양한모낭에서는거의발현되지않
았던 CK19가 DHGM으로배양한모낭에서는외측모근초의최외각
에서발현되는것을확인할수있었다(Fig. 9(b), (d)). 이러한전반
적인 CK19 발현으로보아모낭이초기퇴행기(early catagen phase)
에있는것으로판단되어상대적으로퇴화가덜일어나는것을확 인하였다.
4. 결 론
종합적으로살펴보면일반배지조성을기본으로하는 Philpott
medium이나 IMDM으로배양한모낭은구조상으로는초기성장기
처럼보이지만길이성장이없으며, 낮은알카라인포스파테이즈발
현, CK19 발현이거의없는것으로보아모낭내세포의세포사멸
에의한퇴화(regression)가빠르게일어나는것으로판단되는반면
DHGM으로배양한모낭은상대적으로긴기간동안성장기의구 조, 지속적인길이증가및높은알카라인포스파테이즈발현그리
고전반적인 CK19 발현을나타내었다. 따라서고농도의아미노산
및비타민배지조성이생체외에서모낭을장기간배양하는데중 요한역할을하는것으로판단되며, 이러한배양방법은장기간검
Fig. 7. Increase of hair length of organ cultured hair follicles in Philpott medium, IMDM and DHGM (*p<0.01).
Table 2. Number of hair follicles at growth phase
Day of culture
3 6 9 12
Media Philpott medium 19/24(79.2％) 14/24(58.3％) 12/24(50.0％) 7/24(29.2％)
IMDM 20/24(83.3％) 18/24(75.0％) 13/24(54.2％) 13/24(54.2％)
DHGM 24/24(100％) 20/24(83.3％) 19/24(79.2％) 16/24(66.7％)
Fig. 8. Alkaline phosphatase expression of organ cultured hair folli- cles in different medium (*p<0.01).
사를필요로하는모낭에대한기초연구뿐만아니라새로운탈모 치료제의효능평가분야에이용될수있을것이다.
감 사
본 연구는산업자원부산업기초기술연구개발사업(과제번호
10000030)의지원에의해수행되었으며이에감사드립니다.
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Fig. 9. Histological analysis of organ cultured hair follicles at 10th day (a, b: in Philpott medium; c, d: in DHGM) (Brown color indicates CK19-positive cells).
