가 생쥐에서 혈관신생과 간암 세포주 성장에 미치는 영향

대한소화기학회지 2000;36:235 - 244

4)

접수: 2000년 4월 12일, 승인: 2000년 7월 5일 연락처: 이효석, 110-744, 서울시 종로구 연건동 28번지

서울대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (02) 740-8112, Fax: (02) 743-6701

※ 본 논문의 요지는 대한간학회 제5차(1999년) 춘계학술 대회에서 구연으로 발표되었음.

서 론

종양이 성장하고 전이되는 과정에서 혈관신생 (angiogenesis)이 중요한 역할을 담당하는 것이 알려

T h a lid om ide 가 생쥐에서 혈관신생과 간암 세포주 성장에 미치는 영향

서울대학교 의과대학 내과학교실, 간연구소

김진욱・이효석・윤정환・김정룡

E ffe c t o f Th a li d o m i d e o n t h e An g i o g e n e s i s a n d In v i v o G r o w t h o f H e p a t o m a Ce lls i n t h e Mo u s e

J i n Wo o k Ki m , M.D., H yo -S u k Le e , M.D., J u n g -H w a n Yo on , M.D.

a nd Ch u n g Yo n g Ki m , M.D.

Department of Internal Medicine and Liver Research Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea

Background/Aims: Thalidomide shows an antiangiogenic effect after metabolic activation in the

rabbit, but the antiangiogenic effect in the mouse has not been established. This study was aimed to know if thalidomide shows in vitro antiangiogenic effect by mouse microsomes, and if thalidomide inhibits the growth of hepatoma cells (MH134) in the mouse. Methods: Rat aortic endothelial cells were cultured with thalidomide and/or mouse microsomes to investigate whether the formation of new microvessels is inhibited. In vitro effect of thalidomide on the growth of MH134 cells was assessed by MTT assay. The growth of subcutaneous MH134 tumors and the formation of new vessels were evaluated in C3H/He mice after oral administration of thalidomide. Results:

Thalidomide inhibited in vitro microvessel formation in the presence of mouse microsomes, whereas thalidomide or microsomes alone did not. Thalidomide did not affect in vitro growth of MH134 cells, but suppressed significantly in vivo growth of subcutaneous MH134 tumors in C3H/He mice.

The mean number of tumor-feeding vessels tended to be fewer in the thalidomide-treated group than in the control group, but the difference was not statistically significant. Conclusions: Thalidomide becomes antiangiogenic in the presence of mouse microsomes, and can retard in vivo growth of mouse hepatoma cells. (Kor J Gastroenterol 2000;36:235 - 244)

Key Words: Thalidomide, Angiogenesis, Mice, Hepatocellular carcinoma

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졌으며,1 혈관신생을 억제함으로써 종양을 치료하려 는 시도가 새로운 항암요법으로 대두되었다.2 여러 가지 항혈관형성(antiangiogenic) 물질의 항암효과를 알아보기 위한 임상시험이 진행 중인데,3 이중 thalidomide가 항혈관형성 약제로서 새로이 등장하 여 이용되고 있다.

Thalidomide는 진정제로 개발되었다가 태아에서 단지증(phocomelia)을 유발하여 이용이 중단되었던 약물이다. Thalidomide가 기형을 유발하는 정확한 기전은 아직까지 규명되지 않았는데, D' Amato 등4 은 thalidomide가 태아의 limb bud에서 혈관형성을 저해함으로써 기형을 유발하였으리라는 가설에서 출발하여, 토끼의 각막에 유발된 신생혈관의 형성을 억제할 수 있다고 보고하였다. Thalidomide가 혈관 형성을 저해하는 기전도 확실하지 않은데, thalido- mide 자체는 신생혈관을 억제하지 않으며 생체 내 대사과정에서 생성되는 대사산물이 항혈관형성 작 용을 하는 것으로 알려져 있다.4,5 Thalidomide의 대 사과정은 종(species)에 따라 차이가 있어,6 사람과 토끼의 간에서는 그 대사산물이 항혈관형성 작용을 나타내는 반면 백서(rat)에서는 이러한 항혈관형성 효과가 관찰되지 않았다.5 생쥐(mouse)에서 thali- domide의 활성화 여부는 잘 알려져 있지 않은데, 각 막에 유발된 신생혈관을 효과적으로 억제하였으나 종양 성장을 억제하는 실험에서는 상반된 결과를 보였다.7,8

간암은 과혈관형성(hypervascular) 종양으로서, 종 양의 성장과 동맥 혈류의 증가가 병행하여 나타나 고,9 간동맥화학색전술이 종양의 괴사를 유발하여 간암 성장을 억제할 수 있다는 점 등을 고려할 때 항 혈관형성 치료가 효과적일 수 있음을 예상할 수 있 다. 그러나 간암에서 전신적인 혈관형성 억제치료의 효과에 대해서는 알려진 바 없으며, thalidomide가 간 암의 성장에 미치는 영향 역시 보고된 바가 없다.

이에 저자들은 thalidomide가 시험관 내에서 생쥐 간의 마이크로솜(microsome) 분획에 의하여 혈관신 생을 억제하는 활성 산물로 대사되는지를 확인하고 자 하였으며, 생쥐 간암세포의 생체 내 성장을 억제 할 수 있는지를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

1. 재료 및 대상

Thalidomide는 Andrulis Pharmaceuticals Corp (Beltsville, MD, USA)에서 기증받았다. 생쥐 간암세 포주인 MH134 세포주는 Toshio Kudo 교수(Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku Uni- versity, Sendai, Japan)로부터 기증받았다. 실험 동물 은 체중 250g의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(대한 실험 동물)과 수컷 4주령(20-25g)의 C3H/He 생쥐(Japan SLC Inc, Japan)를 이용하였다.

2. 방 법

1) 생쥐 마이크로솜 분획의 분리

C3H/He 생쥐의 간에서 마이크로솜 분획을 분리 하였다. 생쥐를 단두(decapitation)하여 혈액을 제거 한 후 간을 무균적으로 적출하여 ice-cold 0.25 M sucrose로 세척하였다. 저온실(4℃)에서 미리 냉각시 킨 Dounce homogenizer에 간조직 2.5g을 넣고 10 mL의 0.25 M sucrose/1 mM EDTA/10 mm Tris-HCl 용액을 가한 후 teflon pestle을 이용하여 간조직 균 질액을 만들었다. 얻어진 균질액을 12,500g로 15분 간 원침하여 상층액을 얻은 후, 100,000g로 60분간 초원심분리하였다. 침전된 마이크로솜을 2 mL의 10 mM Tris buffer (pH 7.4)로 부유시킨 후 -20℃에 보 관하였다가 사용하였다. 마이크로솜 분획의 정량은 Lowry 방법을 변형하여 측정하였다.10

2) 생쥐의 마이크로솜에 의한 t ha lidom ide의 시험관 내 활성화 여부 및 혈관신생 억제효과 생쥐에서 thalidomide가 대사되어 혈관신생 과정 을 억제하는지를 알아보기 위하여, Sprague-Dawley 쥐의 대동맥 조직 절편을 배양하면서11 thalidomide 와 생쥐 간의 마이크로솜 분획을 첨가하여 모세혈 관형성 억제 여부를 관찰하였다.5 Sprague-Dawley 쥐의 흉부 대동맥을 적출하여, 수술 현미경으로 관 찰하면서 혈관 외피에 붙은 지방조직을 제거한 후, 약 0.5 mm 두께의 고리 모양으로 잘라, 1:1 DMEM/

Ham' s F12 배양액으로 8회 세척하였다. Matrigel

김진욱 외 3인. Thalidomide가 생쥐에서 혈관신생과 간암세포주의 성장에 미치는 영향 237

(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, USA)을 4℃에서 해동한 후 96-well tissue culture plate (Mi- crotest III, Becton Dickinson & Company, Lincoln Park, NJ, USA)에 well당 25 μL씩 넣고 37℃에서 1 시간 동안 고형화시켰다. 세척한 고리 모양의 대동 맥 절편을 Matrigel이 도포된 culture plate의 well 중 앙에 위치시킨 후, 그 위로 10 μL의 Matrigel을 추 가로 도포하였다. 5% 우태아혈청을 함유한 1:1 DMEM/Ham' s F12 배양액을 첨가한 후 37℃ CO2 배양기에서 7일간 배양하였다. 제7일에 위상차현미 경으로 관찰하여 내피세포가 관(tube) 모양으로 연 결되어 자라기 시작한 well들을 선택한 후, 4개의 군으로 나누어 thalidomide와 마이크로솜 분획을 첨 가한 배양액으로 배양하면서 혈관신생의 억제 정도 를 관찰하였다. 각 군당 8개의 well을 사용하여 A군 은 thalidomide나 마이크로솜을 첨가하지 않았으며, B군은 마이크로솜만을, C군은 thalidomide만을 첨가 하였고, D군은 thalidomide와 마이크로솜을 모두 첨 가하였다. 배양액은 1:1 DMEM/Ham' s F12 배양액 에 7% 우태아혈청을 첨가하여 사용하였다. 마이크 로솜은 최종 농도를 0.5 mg/mL로 맞추었다. Thali- domide는 투여 직전에 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Korea, Seoul, Korea)에 녹여 사용하였 으며, 최종 농도가 thalidomide는 25 μg/mL, DMSO 는 0.5%가 되도록 하였다. 마이크로솜 대사에 필요 한 NADPH-regenerating system의 최종 농도는 다음 과 같이 사용하였다: NADP 0.5 mM; glucose 6 phosphate 2.5 mM; glucose 6-phosphate dehydro- genase 10 U/mL; MgCl2 5 mM; Tris buffer 0.1 M, pH 7.4.5,12 배양을 시작한 후 매 24시간마다 thalido- mide (8 μg/mL), 마이크로솜(0.2 mg/mL), NADPH regenerating system을 배양액과 함께 보충하였으며 약물 투여 후 제5일째에 모세혈관 유사 구조 (capillary-like structure)의 증식 여부를 관찰하였다.

3) T halidomide의 MH134 세포주에 대한 시험관 내 증식 억제효과

Thalidomide가 간암세포의 성장에 직접적인 영향 을 미치는지를 알아보기 위하여, 시험관 내에서 배 양액에 thalidomide를 첨가한 뒤 MH134 세포주를

배양하면서 세포의 증식 정도를 정량하였다. 세포의 계측은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide (MTT) assay13를 이용하였다. MH134 세포주를 10% 우태아혈청이 포함된 RPMI1640 배 양액에서 계대배양, 원침한 후 배양액에 2×105개/

mL의 농도로 부유하여 96-well tissue culture plate 에 50 μL씩 분주하였다. 여기에 1% DMSO/thalido- mide 혼합물을 50 μL씩 첨가한 후 37℃ CO2 배양 기에서 44시간 동안 배양하였다. MTT를 2 mg/mL 의 농도로 PBS에 녹여 well마다 30 μL씩 첨가한 뒤 4시간 동안 추가로 배양하였다. Tissue culture plates 를 470g로 7분간 원침한 후, formazan crystal이 흩 어지지 않도록 주의하면서 상층액을 70 μL씩 제거 하였다. Well당 200 μL의 DMSO를 첨가한 후 5분 동안 plate를 흔들어 formazan crystal을 완전히 녹였 으며, microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡 광도를 측정하였다. Percent absorbance는 아래와 같 이 계산하였으며, 이를 세포 증식의 지표로 이용하 였다.

Percent absorbance (%)=(thalidomide가 투여된 well들의 평균 흡광도)÷(대조군 well들의 평균 흡광 도)×100

4) 생체에서 t h a lidom ide의 간암세포 성장 억제효과

생체 내에서 thalidomide가 간암세포의 성장을 억 제하는지를 알아보기 위하여, C3H/He 생쥐에 MH134 세포주를 주사하여 형성시킨 피하종양 모델을 이용 하였다.14 MH134 세포주를 배양액에 2×107개/ml의 농도로 부유하여 100 L를 측복부에 피내(intrader- mal) 주사하였다. 주사 후 4, 5일이 지나면 육안으로 식별이 가능한 종괴가 형성되었다. 이중 9마리의 생 쥐에게 thalidomide를 투여하였으며, thalidomide는 75 mg/kg의 용량을 50 L의 0.1% carboxymethyl cellulose에 부유하여 하루 2회 매 12시간마다 경구 로 투여하였다(Fig. 1). 대조군인 8마리의 생쥐에게 는 동량의 0.1% carboxymethyl cellulose를 경구로 투여하였다. 각 군에서 체중의 변화를 측정하여 전 반적인 독성 여부를 평가하였다. 종양의 크기를 매

238 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 36, No. 2, 2000

일 caliper를 이용하여 측정하였으며, 종양의 용적은 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.

V (mm3)=W2 (mm)×L (mm)÷2 (V, 종양의 용 적; W, 단경; L, 장경)

MH134 세포주를 주사한 후 제17일까지 체중과 종양의 크기를 관찰하였으며, 제17일째에 C3H/He 생쥐를 희생시켜 피하종양의 무게와 피하종양을 공

급(feeding)하는 신생혈관의 수를 정량하였다15(Fig.

2). 체중 변화와 종양의 평균 용적 및 신생혈관의 정 량적 비교는 Mann-Whitney U test를 이용하였으며, 신생혈관과 종양 용적 간의 정량적 관계는 선형회 귀분석을 시행하였다. 통계 프로그램은 SPSS for Windows ver. 7.5를 이용하여 분석하였다

결 과

1. 생쥐의 마이크로솜에 의한 t h a lidom ide의 항혈관형성 작용의 활성화(F ig . 3) Sprague-Dawley 쥐의 대동맥 조직 배양액에 약물 을 첨가하여 배양한 후 제5일째에, 대조군(Fig. 3A), 마이크로솜 단독 투여군(Fig. 3B), thalidomide 단독 투여군(Fig. 3C)에서는 전 예에서 대동맥 조직으로 부터 내피세포가 증식, 연결되어 이루어진 가지 모 양의 모세혈관 유사 구조(branching capillary-like structure)를 관찰할 수 있었다. 반면, thalidomide와 생쥐 마이크로솜을 동시에 투여한 경우에는 전 예 에서 내피세포간의 연결이 모두 단절되어 모세혈관 유사 구조가 관찰되지 않았다(Fig. 3D).

2. T h a lidom ide가 생쥐 간암세포의 시험관 내 성장에 미치는 영향(F ig . 4)

MH134세포는 thalidomide를 100 μg/mL까지 농도 를 증가시켰을 때에도 thalidomide를 투여하지 않은 대조군과 같은 정도로 증식하여, thalidomide는 MH134 세포의 시험관 내 성장에 영향을 주지 않았다.

Fig. 1. Administration scheme of thalidomide for the in vivo inhibition of the growth of mouse hepatoma cells. C3H/He mice were given 75 mg/kg of thalidomide twice daily by gastric lavage. Thalidomide was started two days before tumor implantation, and continued until day 16 post-implanta- tion. The mice were killed on day 17 for the assessment of tumor-feeding vessels.

Fig. 2. Measurement of angiogenesis around subcutaneous MH134 tumors in the C3H/He mouse. A midline incision was made on the back of the C3H/He mouse. Thereafter, the number of vessels towards the tumor (arrows) was counted under the surgical microscopic examination while the skin flap holding the tumor mass was being separated from the underlying muscle layer.

Kim, et al. Effect of Thalidomide on the Angiogenesis and Hepatoma Cell Growth in Mice 239

3. T h a lidom ide에 의한 생쥐 간암세포의 생체 내 성장 억제효과

실험 약제의 부작용을 반영하는 전반적인 지표로 서 체중의 변화를 측정하였을 때, 체중 증가는 대조 군(1.21±1.01 g)과 thalidomide 투여군(0.31±1.15 g) 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.074).

C3H/He 생쥐에서 유발된 MH134 피하종양의 성 장 속도는 주입 후 제11일까지는 대조군과 thalido- mide를 투여받은 군 간에 차이를 보이지 않았다. 그 러나, 제13일 이후에는 thalidomide 투여군에서 유의 하게 피하종양의 성장이 지연되어, 실험 종료시(제 17일)의 종양 용적은 대조군의 1,717±902 mm3에 비하여 896±389 mm3로 유의하게 감소되었다(p=

0.034, Fig. 5).

Fig. 4. In vitro effect of thalidomide on the proliferation of mouse hepatoma cells analyzed by MTT assay. The growth of MH134 cells was not influenced by the ad- ministration of thalidomide at the concentration of up to 100 μg/mL. Pecent absorbance represents relative optical absorbance of each well compared with the control well.

Means and standard deviations of six independent mea- surements are shown.

Fig. 3. Rat primary aortic endothelial cells treated with (A) control vehicle, (B) mouse microsome, (C) thalidomide, and (D) mouse microsome and thalidomide. All photographs are representative of three standardized fields from eight different aortic ring samples for each group. Endothelial cells maintained branching capillary-like stuructures in the control group, microsome-treated group, and thalidomide-treated group (A, B, C, arrowheads). Capillary-like structures were, however, totally disrupted and only clumps of endothelial cells were observed after treatment with both thalidomide and microsomal activation system (D, open arrows). Inverted microscope (A-D), 400.

240 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 2 호 2000

4. 대조군과 thalidomide 투여군에서 생쥐 간암 세포에 의하여 유도된 신생혈관의 정량적 비교

MH134 피하종양을 수술현미경하에서 박리하면 서 종양 공급혈관을 계측하였을 때, thalidomide 투 여군에서는 전 예에서 종괴가 피하조직에 국한되어 있었으므로 하부 근육층과 쉽게 박리되어, 신생혈관 을 쉽게 계측할 수 있었다. 대조군의 경우 종양의 크기가 가장 컸던 2예에서는 종양이 하부 근육층을 침습하여 유착되어 있었으므로, 유착된 부위를 제외 하고 박리가 가능했던 부분에서만 혈관의 개수를 계측하였고, 유착 소견을 보이지 않은 나머지 6예에 서는 모든 신생혈관을 계측하였다. 계측 결과, 신생 혈관의 수는 thalidomide 투여군(34.4±9.8)에서 대 조군(43.9±13.3)에 비하여 적은 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(p=0.115)(Fig. 6). 신생혈관 의 수와 종양 용적 간의 회귀분석 결과, 결정계수는 대조군의 경우 0.555, thalidomide 투여군의 경우 0.695로서 양군 모두 종양 성장과 신생혈관 증식 간 에 유의한 상관관계가 있었다(Fig. 7).

고 찰

Thalidomide가 항혈관형성 작용을 나타내기 위해 서는 생체 내 대사과정이 필요한데,4,5 사람과 토끼 에서는 항혈관형성 물질로 대사되는 반면 백서에서 는 이러한 대사과정이 결여되어 종에 따른 차이가 있음이 알려졌다.5 Thalidomide가 생쥐 각막의 신생 혈관을 억제할 수 있음이 보고되어16,17 생쥐에서도 항혈관형성 물질로 대사될 것으로 예상되었는데, 본 연구에서 생쥐의 마이크로솜이 thalidomide를 항혈 관형성 물질로 활성화 시킬 수 있음을 확인할 수 있 었다. 항혈관형성 작용을 나타내는 thalidomide의 활 성 산물은 아직 정확히 규명되지 않았는데, 최근에 대사과정에서 생성되는 반응성 산소화합물(reactive oxygen species)이 신생혈관을 억제하였다는 보고가 있다.18

최근 thalidomide의 항혈관형성 효과를 악성 종양 의 치료에 응용하는 임상시험이 전립선암,19 뇌종 Fig. 6. Quantification of feeding vessels towards subcu-

taneous MH134 tumors. The mice treated with thalidomide tended to have fewer tumor-feeding vessels than the mice of the control group (mean was 34.4 and 43.9, respec- tively, represented by horizontal bars), but the difference was not statistically significant (closed circle, control group; open circle, thalidomide group).

Fig. 5. Inhibition of in vivo growth of mouse hepatoma cells by oral administration of thalidomide (150 mg/kg/

day). The growth of subcutaneous MH134 tumors in C3H/He mice was significantly retarded (closed circle, control group; open circle, thalidomide group). Data are expressed as mean±SD.

김진욱 외 3인. Thalidomide가 생쥐에서 혈관신생과 간암세포주의 성장에 미치는 영향 241

양,20 카포시 육종,21 다발성 골수종 등22에서 진행되 고 있다. 그러나 동물실험에서 thalidomide가 종양의 성장을 억제할 수 있는지에 대해서는 상반된 결과 가 보고되었는데,7,8,23 여기에는 종에 따른 대사의 차이 외에도 thalidomide의 약동학적 요인이 영향을 주었을 가능성이 많다. 일반적으로 혈관형성억제제 가 항암효과를 나타내려면 일정 수준 이상의 혈중 농도를 계속 유지하여 내피세포의 증식을 지속적으 로 억제할 수 있어야 한다.2 항혈관형성 효과를 나 타내기 위한 thalidomide의 최소 역치는 아직 확실 히 알려져 있지 않지만, 일반적으로 실험 동물에서 태아 독성을 나타내기 위해서는 150-200 mg/kg/day 의 용량이 필요하며,24 본 연구를 포함하여 종양이 성공적으로 억제되었던 보고에서는 이 용량이 사용 되었다. Thalidomide는 투여 경로에 따라 흡수율 (bioavailability)의 차이를 보임으로써 혈중 농도에 영향을 줄 수 있으며,6 생쥐에서 복강 내에 주사하 였을 때 경구로 투여한 경우보다 항혈관형성능이 뚜렷하다는 보고들이 있다.8,16 또한 실험 동물에서 thalidomide의 반감기는 약 2-3시간으로 알려져 있 으므로,25 하루 1회 경구 투여로는 항혈관형성능을 발휘하기 위한 최적의 혈중 농도를 유지하지 못하 였을 가능성이 크다. 본 연구에서는 종양 주입 2일 전부터 thalidomide를 12시간 간격으로 투여함으로

써 간암세포의 생체 내 성장을 억제할 수 있었는데, 하루에 한 번 투약한 기존의 보고에 비하여 혈중 농 도의 변동폭을 줄인 점이 종양 억제에 기여하였을 가능성이 있다.

본 실험에서 종양에 연결된 공급혈관의 수를 종 양에 의해 유발된 신생혈관의 정량적 지표로 이용 하였으며, 종양의 성장과는 유의한 상관관계를 확인 할 수 있었다. 한편 종양 공급혈관의 수를 군간에 비교하였을 때, 대조군보다 thalidomide 투여군에서 더 적은 경향을 보였지만 통계적 유의성을 보이지 는 않았다. 종양 성장에 대한 억제효과와 신생혈관 형성 억제효과의 상관성 부족은 종양이 매우 컸던 2 마리의 생쥐에서 피하종양과 하부 근육층과의 유착 으로 인하여, 증가된 혈관수를 모두 계측하지 못하 였기 때문일 수 도 있다. 일반적으로 항혈관형성 치 료는 종양을 억제하는 데 있어 증폭효과(amplifica- tion effect)를 나타내며,2 하나의 내피세포를 억제함 으로써 100개 가량의 종양세포 사멸효과를 기대할 수 있는 점26을 고려하면, 통계적 유의성을 띠지 못 하는 정도의 신생혈관 억제효과가 증폭효과를 통하 여 유의한 수준의 종양 억제효과로 발현될 수도 있 을 것으로 생각된다. 본 연구에서 thalidomide가 간 암세포의 생체 내 성장을 유의한 수준으로 저해하 였으나 완전히 억제할 정도로 현저하지는 못하였다 Fig. 7. The relationship between the number of tumor-feeding vessels and the weight of subcutaneus MH134 tumors.

There was a positive correlation between the vessel number and tumor weight in both control group (A) and thalidomide group (B). Dotted lines indicate 95% confidence intervals.

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는 점도 혈관형성 억제 정도가 충분하지 못하였다 는 점에 기인할 것으로 생각된다.

신생혈관의 감소가 종양 억제의 원인인지 혹은 종양 억제의 결과인지를 실험적으로 직접 증명하기 는 어려우나, 본 실험에서 thalidomide가 시험관 내 에서 신생혈관을 억제한 반면 간암세포의 시험관 내 증식에는 직접적인 영향을 미치지 않았다는 간 접적인 증거들을 고려하면 신생혈관을 억제하는 기 전을 통하여 간암세포의 생체 내 성장을 지연시켰 을 것으로 추정된다. 그러나, thalidomide의 대사산 물이 간암세포의 생체 내 증식에 직접 영향을 주었 을 가능성 및 면역학적 기전을 통하여 종양의 성장 에 영향을 주었을 가능성을 완전히 배제할 수는 없 겠으며, 이에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다.

본 연구에서 thalidomide의 투여로 종양의 성장을 완전히 억제시키지는 못하였는데, 이는 기존에 보고 된 실험 결과와 일치하는 소견이다.8 이에 대해서는 다른 종류의 혈관형성억제제나 기존의 항암제를 병 용함으로써 thalidomide의 항암효과를 항진시킬 수 있을 가능성이 있으며,17 이 또한 향후 추가 연구가 기대되는 분야이다. 간암에서의 전신적 항혈관형성 치료로는 Aspergillus fumigatus로부터 분리한 물질 의 유도체인 TNP-470을 실험적 간 전이 모델과27 간내 화학발암 모델28에 이용한 연구가 보고되어있 다. 그러나 TNP-470은 신경독성이 있으며, 비경구 적으로 투여해야 하는 단점이 있다. 본 실험에서 thalidomide는 경구 투여로 간암세포의 생체 내 성 장을 지연시킬 수 있음을 알 수 있었으나, 간조직 내에서도 비슷한 효과를 보일 수 있는지에 대해서 는 추가 연구가 필요하겠다.

요 약

목적: 악성 종양의 성장에 혈관신생이 중요한 역 할을 담당하며, 신생혈관 억제요법이 악성 종양의 치료에 시도되고 있다. Thalidomide는 토끼의 간에 서 대사되어 각막의 혈관신생을 억제할 수 있음이 알려졌다. 이러한 대사과정은 종(species)에 따라 차 이가 있는데, thalidomide가 생쥐에서 혈관형성 억제 효과를 나타낼 수 있도록 대사되는지는 잘 알려져

있지 않다. 본 연구에서는 thalidomide가 생쥐에서 혈관신생을 억제할 수 있는 물질로 대사될 수 있는 지, 또한 그렇다면 생쥐에서 간암세포의 생체 내 성 장을 억제할 수 있는지를 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 백서의 대동맥 절편을 생쥐의 마이크로솜 과 thalidomide와 함께 배양하여 미세혈관의 형성이 억제되는지를 관찰하였다. MH134 생쥐 간암세포를 thalidomide와 함께 배양하여 간암세포에 대한 직접 적인 효과를 알아보았으며, MH134 세포주를 C3H/

He 생쥐에 피하 주사한 후 thalidomide를 경구 투여 하면서 종양의 성장과 신생혈관의 형성을 정량하였 다. 결과: Thalidomide를 생쥐의 마이크로솜과 함께 투여하였을 때 백서의 대동맥 내피세포의 시험관 내 신생혈관 생성이 억제되었으나, thalidomide나 마 이크로솜을 단독으로 투여하였을 때에는 억제되지 않았다. Thalidomide는 시험관 내에서 MH134 세포 주의 성장을 억제하지 않았으나, 생쥐에게 경구로 투여하였을 때에는 MH134 피하종양의 성장을 유의 하게 감소시켰다. MH134 피하종양에 의하여 유도된 신생혈관의 수는 thalidomide를 투여받은 생쥐에서 더 적은 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다.

결론: Thalidomide는 생쥐에서 대사되어 혈관신생 억 제작용을 보이며, 이를 경구로 투여하였을 때 생쥐 간암세포의 생체 내 성장을 억제시킬 수 있다.

색인단어: Thalidomide, 혈관신생, 생쥐, 간암

참 고 문 헌

1. Folkman J, Shing Y. Angiogenesis. J Biol Chem 1992;267:10931-10934.

2. Folkman J. Antiangiogenic therapy. In: DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA, eds. Cancer: Principles and Practice of Oncology. Philadelphia: Lippincott- Raven, 1997:3075-3085.

3. Nelson NJ. Inhibitors of angiogenesis enter phase III testing. J Natl Cancer Inst 1998;90:960-963.

4. D' Amato RJ, Loughnan MS, Flynn E, Folkman J.

Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:4082-4085.

5. Bauer KS, Dixon SC, Figg WD. Inhibition of

Kim, et al. Effect of Thalidomide on the Angiogenesis and Hepatoma Cell Growth in Mice 243

angiogenesis by thalidomide requires metabolic activation, which is species-dependent. Biochem Pharmacol 1998;55:1827-1834.

6. Schumacher H, Smith RL, Williams RT. The metabolism of thalidomide: the fate of thalidomide and some of its hydrolysis products in various species. Br J Pharmacol 1965;25:338-351.

7. Gutman M, Szold A, Ravid A, Lazauskas T, Merimsky O, Klausner JM. Failure of thalidomide to inhibit tumor growth and angiogenesis in vivo.

Anticancer Res 1996;16:3673-3677.

8. Kotoh T, Dhar DK, Masunaga R, et al. Antian- giogenic therapy of human esophageal cancers with thalidomide in nude mice. Surgery 1999;125:536- 544.

9. Bhattacharya S, Davidson B, Dhillon AP. Blood supply of early hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 1995;15:390-401.

10. Peterson GL. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem 1977;83:346-356.

11. Nicosia RF, Ottinetti A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quanti- tative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest 1990;63:115-122.

12. Miller KJ, McGovern RM, Ames MM. Effect of a hepatic activation system on the antiproliferative activity of hexamethylmelamine against human tu- mor cell lines. Cancer Chemother Pharmacol 1985;

15:49-53.

13. Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrazolium-based se- miautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 1987;47:936- 942.

14. Sano H, Sato S, Shima J, Tada T, Fujiwara H, Hamaoka T. Selective suppression of the generation of anti-tumor L3T4+ but not of Lyt-2+ T cell- mediated immunity in the tumor-bearing state. Jpn J Cancer Res 1988;79:857-865.

15. Kreisle RA, Ershler WB. Investigation of tumor angiogenesis in an id mouse model: role of host-

tumor interactions. J Natl Cancer Inst 1988;80:849- 854.

16. Kenyon BM, Browne F, D' Amato RJ. Effects of thalidomide and related metabolites in a mouse corneal model of neovascularization. Exp Eye Res 1997;64:971-978.

17. Verheul HM, Panigrahy D, Yuan J, D' Amato RJ.

Combination oral antiangiogenic therapy with thali- domide and sulindac inhibits tumour growth in rab- bits. Br J Cancer 1999;79:114-118.

18. Sauer H, Gunther J, Hescheler J, Wartenberg M.

Thalidomide inhibits angiogenesis in embryoid bodies by the generation of hydroxyl radicals. Am J Pathol 2000;156:151-158.

19. Figg WD, Raje S, Bauer KS, et al. Pharmaco- kinetics of thalidomide in an elderly prostate cancer population. J Pharm Sci 1999;88:121-125.

20. Fine HA, Figg WD, Jaeckle K, et al. Phase II trial of the antiangiogenic agent thalidomide in patients with recurrent high-grade gliomas. J Clin Oncol 2000;18:708.

21. Fife K, Howard MR, Gracie F, Phillips RH, Bower M. Activity of thalidomide in AIDS-related Ka- posi' s sarcoma and correlation with HHV8 titre. Int J STD AIDS 1998;9:751-755.

22. Singhal S, Mehta J, Desikan R, et al. Antitumor activity of thalidomide in refractory multiple mye- loma. N Engl J Med 1999;341:1565-1571.

23. Pollard M. Thalidomide promotes metastasis of prostate adenocarcinoma cells (PA-III) in L-W rats.

Cancer Lett 1996;101:21-24.

24. Schumacher H, Blake DA, Gurian JM, Gillette JR.

A comparison of the teratogenic activity of thalido- mide in rabbits and rats. J Pharmacol Exp Ther 1968;160:189-200.

25. Schumacher H, Blake DA, Gillette JR. Disposition of thalidomide in rabbits and rats. J Pharmacol Exp Ther 1968;160:201-211.

26. Arap W, Pasqualini R, Ruoslahti E. Chemotherapy targeted to tumor vasculature. Curr Opin Oncol 1998;10:560-565.

27. Tanaka T, Konno H, Matsuda I, Nakamura S, Baba

244 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 2 호 2000

S. Prevention of hepatic metastasis of human colon cancer by angiogenesis inhibitor TNP-470. Cancer Res 1995;55:836-839.

28. Ikebe T, Yamamoto T, Kubo S, et al. Suppressive

effect of the angiogenesis inhibitor TNP-470 on the development of carcinogen-induced hepatic nodules in rats. Jpn J Cancer Res 1998;89:143-149.