대한임상병리사회지 : 제 22 권 제 1 호 1990
가토에 있어서 정상인 혈청단백에 대한 면역응답과 그 면역혈청의 응용에 관하여
원광보건전문대학 임상병리파
오재세·김신무·신상희·최영자
1 . 서 론
면역(immune) 이란 무거운 짐이나 세금에서 면제 된다는 lmmunis란 라틴어에서 유래된 말이다. 실제 적인 면역실험은 영국의사인 Jenner, E(1796) 가
Phipps, J라는 소년에게 우두를 접종한 후 실험적으 로 천연두의 감염성 물질을 그 소년에게 피내로 소 량 접종하므로써 시작되었다
항원항체반응의 기본적인 침강반응의 하나인 gel 확산법은 가용성 항원파 그 항원에 특이적인 항체가
agar gel 내에서 서로 확산해서 최적비로 만나는 자
리에서 침강대 (precipitation arc) 를 형성한다 .Ouch
terlony(1949) 1)에 의 해 서 고 안된 Ouchterlony douhle immunodiffusion test는 agar gel에 wells:을 파내고 한쪽 well에는 항원을， 다른 한쪽 well에는 항혈청을 넣고 moist chamber 내에 수평으로 유지 하고 실온(혹은 40C) 에서 면역확산시키면 두 반응물 의 똥도， 분자의 크기， 확산도 등에 의해서 만나는 자리가 달라서 항원성 물질이 단일물질이라면 하나 의 침강대가 생기고， 항원이 복합물질이라면 여러
개의 침강대가 형성하게 된다.
이 방법을 써서 항체의 역가 혹은 항원의 종류 및 역 가를 정 량적 으로 측정 할 수 있 다 . Ouchterlony double immunodiffusion test보다 더 발전 된 면 역 학적 방법인 전기영동법 ( electrophoresis) 은 용액 내의 하전된 (charged) 분자가 전장 (electric field)
에 있을 때 한쪽 전극으로 이동한다는 원리에 의해 서 복합물질을 분획하는 방법이다. 가장 널리 이용 되고 있는 전기영동법은 zone 전기영동법이라 부른 다. 이 방법에서 분석할 검체는 여지 (paper) , agar, agarose, starch, cellulose, acetate film 및 acrylamide gel과 같은 지 지 체 를 써 서 분석 할 수 있 다. 모든 전기영동계는 전장 (electric field), 전기적
으로 유도되는 매체 (medium), 매체 내의 하전된 입 자로 이루어진다. 전기영동법에서 약간의 인자들은 분리를 증진시키는 인자와 지장을 초래하는 인자가 있기 때문에 주어진 조건하에서 결과를 예측하기는 곤란하다
전기영동법은 가장 정확하고 재현성이 높은 결과 를 가져오도록 정립하여야 한다. 여지전기영동법은 Tiselius, A (1937) 2) 에 의해서 처음으로 고안되었 다. 그래서 여지전기영동법은 Tiselius 방법으로 인 용된다. 시간이 길게 걸리는 결점이 있는 여지전기 영동법을 Kohn (1960) 3)은 cellulose acetate film을 쓰므로써 시간을 단축시켜 개선하였다. 현재 환자의 혈청단백의 변화에 따라 임상진단을 하는데
cellulose acetate film을 쓰는 Kohn, J (1960) 3 ，4)의 전기영동이 가장 널리 이용되고 있다. 또한
Grabar, P와 Williams Jr C.A(1953 )5，6) 에 의해서
개발된 agar gel 전기영동법에 면역확산법을 병합시
킨 면 역 전 기 영 동 법 (immuno - electrophoresis) 을 응용하여 혈청단백 분획을 더 많이， 즉 항원성물질 을 더 자세하게 많이 분리시키는 획기적인 연구를 하게 되 었 다 . Microslide에 agarY- agarose를 피 막 하여 실시하는 면역전기영동법에서 전기영동후 면 역확산 시간은 Scheidegger, J. J ' (1955) 7) 에 의해서
12 내지 24시간으로 단축시키게 되었다
Grabar와 Burtin (1960) 8，9)은 환자의 체 액 , 주로 혈청 (혈장) , 소변 그리고 뇌척수액의 임상진단을 위 해서 면역전기영동법을 이용하였다. 그리고 Heremans와 Schultze (1963) 는 면역전기영동법을 이용하여 혈청단백 중의 면역글로불런 (immunoglo.
bulins) 에 대해서 광범위하게 연구하였다
본 실험은 정상인의 혈청단백을 alum 처리하여 가토에 면역접종하는 방법 10， 1 1)에 따라 각 가토의 면 역응답에 의한 항인면역혈청의 역가를 Ouchterlony
g ω
double immunodiffusion test에 의해서 측정하고 NHS) 을 수 집 혼 합 한 pooled normal human 면역전기영동상을 관찰하므로써 그들 면역혈청을 serum의 총단백량은 표 1과 그림 1에 나타낸 것처럼 anti - globulin test (Coombs test) 에 anti - globulin 7.2 g/ d l이고 A/G ratio는 1. 6:1이었으며 혈청단 serum (Coombs serum) 대 신 쓸 수 있 는지 를 검 정 하 백 분획 albumin은 62.1, ι -globulin은 4.3, a2- 여 용혈성 질환을 진단할 수 있는 Coombs test에 응 globulin은 9.6, β-globulin은 7.7 그리고 y- 용할 목적으로 연구하였다 globulin은 16.3이었다. 이 혼합 정상인 혈청을 가토
(rabbit) 에 alum 처 리 하여 면 역 접 종하였 다 .
면역전기영동에는 고순도의 agar를 필요로하므로 정 상 인 혈 청 (pooled normal human serum, Difco 회 사의 purified agar를 다음과 같이 정 제 하 여 사용하였다11) 1, 000 ml f1ask에 3차증류수 490 ml를 가하고 purified agar 10 g를 넣 고 autocIave 에 서 1 kg/cm2 압력 으로 15분간 멸균하였 다 Tray 에 두께가 약 1cm가 되도록 부어서 응고시킨 후 가 로 세 로 1cm 간격 으로 agar를 cutter로 잘라서 입 방한천 (cubic agar, 1 cm3 agar) 으로 만들고 이 것 을 linger병 에 옮겨 넣 고 입 방 agar가 충분히 잠기 도 록 10% KOH 용액을 가하고 24시간 처리하면 노량 게 발현된다. 고무호스를 연결하여 흐르는 수돗물로 72시간 세척하였다. 그런 뒤 증류수를 가끔 갈아주 면서 48시간 세척하였다. 증류수를 버리고 parafilm 으로 막고 냉장고 (40-60C) 에 보관하면 1 년간 사용 할 수 있다. 사용시에는 100 ml병에 입방한천 50 g 을 평 량하여 넣 고 veronal buffer, pH 8.6 50 ml를 가하여 끓이 면 1% agar가 되 는데 이 agar를 560C 정도로 유지하고 5 ml pipette을 써서 slide당 2ml 씩 을 피 막시 켜 moist chamber에 보관하고 면 역 전기 영동을 할 때마다 사용하였다.
II. 실험재료 및 방법 1. 정상인 혈청
16.3 7.7 9.6 4.3 62.1 Fig. 1. Cellulose acetate electrophoretic pattern
of normal human serum
2. Agar으| 순수정제
Table 1. Normal range of protein fractions of normal serum and tested serum by cellulose acetate electrophoresis
TP A/G percent of serum protein fractions(%)
Sex (g/dl) ratio albumin αl-glob. α2 -glob. β-glob. y-glob.
Male, mean 7.2 2.0 66.0 2.5 7.5 10.3 13.7
:t2SD 0.5 5.6 0.8 2.3 1.9 5.0
Female, mean 7.0 1.8 63.2 2.5 7.9 10.7 15.3
:t2SD 0.5 6.6 1.0 2.8 4.6 6.0
Total, mean 7.1 1.9 64.7 2.5 7.7 10.6 14.5
:t2SD 0.5 6.8 0.8 2.4 2.2 5.6
Serum tested 7.2 1.6 62.1 4.3 9.6 7.7 16.3
TP ; total protein, A/G ratio ; albumin/globulin ratio
N ormal range ; Tipton Golias : Helena electrophoresis manual 1976 -1979 이 ”
3. 항혈청 (anti-human immune serum,
polyvalent) 의 면역
N ew Zealand rabbit 4마리 에 정 상인 혈청 (총단 백 7.2g/d l)을 다음과 같이 처리하여 면역계획에 따라 면역접종하였다 10， 11) 증류수 80ml를 가한 500 ml flask를 stirr {model Ther - mix, 제 일화학기 기)위에 올려놓고 stirring하면서 정상인 혈청 25 ml 를 서서히 가한다. 그리고 다시 10% alum 90 ml를 서서히 가하였다. pH meter{HM -5ES, 일제)의 전극을 beaker의 내용물에 담그고 5N-NaOH 용 액 을 점 적 (dropping) 하면서 pH를 6.5로 조정 하였 다. 이때 pH가 4.5정도가 되면 침강물이 생기기 시 작하며 pH 6.5에서 침강물이 많이 형성된다. pH를 6.5로 조정한 후 실온에서 30분간 stirring하였다.
그리고 침강물을 2,000 rpm으로 15분간 원심하고 상청을 버런후 적당량의 생리식염수로 부유하고 원 심하여 침강물을 2회 세척하였다. 최종적으로 침강 물을 생리식염수로 100ml까지 부유시켰다. 이
alum 처리혈청을 첫날 가토의 양쪽 엉덩이
(buttocks) 에 근육내 로 10 ml 씩 주사한다 . 제 14 일 에 각 가토에 첫날파 같이 주사한다. 그리고 제 24 일 에 원혈청 1ml씩을 복강내 주사하였다. 제 34일에 예비시힘을 위하여 귀 정맥 또는 심장에서 약 4ml 씩 채혈하였다. 그리고 역가를 측정하였다.
4. 항인면역혈청의 희석
4개의 항인면역혈청의 역가측정을 위하여 시험관 대 (rack, 4 x 10 holes) 의 4개 열의 1번 hole에 서 4번 hole에 Wassermann tube를 꽂고 2번 부터 4번 시 험 관에 생리식염수 1ml씩을 가하였다. 정상인 혈청을 가토 (N ew Zealand rabbit) 에 면 역 하여 얻 은 각 항 인면역혈청 (AHS-1, -2, -3 및 -4) 을 각열의 1
번과 2번 시험판에 1 ml씩을 가하고 pipette{l ml 용)로 2번 시험관의 내용물을 빨았다 불었다하며 4
번 시험관까지 계단희석하였고 Ouchterlony immu- nodiffusion test와 면 역 전기 영 동법 으로 역 가측정 하 고 확인검사를 하였다.
5. Ouchterlony 이원면역확산법에 의한 역가측정
1% agar를 피 막한 slide에 5mm 간격 으로 well
(직경 6mm) 을 파내고 항인면역혈청들의 각 희석혈 청 (1배， 2배， 4배 및 8배 희석혈청)과 정상인 혈청 (NHS) 을 각각 지정된 well에 0.1 ml씩을 가하고
moist chamber 내에 수펑으로 유지하고 실온에서 18시간 면역확신시켰다. 면역확산시킨 후 slide들올 N -saline을 넣은 tray에 담가서 24시 간 투석 하였 다. 투석.하는 동안 N -saline을 3회 갈아주었다. 이 조작은 첨강을 일으킨 단백 이외의 단백을 투석하여 염색을 선명하게 하려는 것이다. 투석이 끝난 slide
들은 표면에 여파지 혹은 한지를 접촉시켜서 건조시 킨 후 염색하였다.
6. 면역전기영동에 의한 황인면역혈청의 확인
정상인 혈청단백의 각 단백성분 (albumin， <<1 -,
<<2-' β- 과 'Y - globulin) 에 대응하는 항체가 항인
면역혈청 내에 각각 생성되었는지를 확인하기 위하 여 1% agar 피 막 slide에 그림 5와 같이 cutter로 찍 어서 자국을 내고 검체인 정상인 혈청을 넣을 둥근 부분의 agar를 흡입 제 거 하였 다 . 5장의 slide를 완충 액이 들어있는 전기영동함 내의 전극이 연결된 두
Veronal buffer, pH 8.6 chamber 사이에 걸쳐놓고 slide와 완충액 사이를 두 겹의 gauze로 연결하고 통 전 (50 volt, 15 mA) 하고 2내 지 3분간 기 다혔 다가 agar를 제거한 well에 검체를 27G 주사바늘을 끼운
tuberculin 주사기 로 well에 채 웠 다 . 그리 고 60분간 통전 후 slide를 꺼 내 고 가운데 도랑 (trough) 을 파내 고 해당 항인면역혈청을 도랑을 넘지 않도록 채우고
moist chamber에 수평 으로 유지 시 키 고 24시 간 면역 확산시켰다.
다음날 아침에 tray에 N -saline을 충분히 가하고 slides를 수평으로 넣어 비반응 단백을 투석하여 제 거하였다. 장시간 내에 2내지 3회 N -saline을 갈아 주었다. 투석이 끝나면 agar 표면에 한지 (혹은 앓은 여과지)를 붙여서 건조시킨 후 한지를 주의갚게 떼 어내었다. 그리고 단백염색액인 Ponceau 3R액을 염색 jar에 넣 고 건조시 킨 slides를 slide carrier에 끼 우고 염색하고 탈색한 후 흡지로 탈색액을 흡수시키고 건 조시켰다.
7. Coombs test에 항인면역혈청의 응용검사
Anti - D serum을 22% bovine albumin과 N- saline으로 각각 1 : 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1: 16파 1 : 32 항혈청희석액 1 ml에 2% Rh 양성 O형 적혈 구 식염수 부유액 1 ml씩을 가하여 항온수조 (3TC) 에서 60분간 감작시킨 후 N -saline으로 3회 세척하 고 항인면역혈청 (AHS-4) 의 1 : 1, 1: 2, 1: 4,
1 : 8, 1: 16, 1: 32 및 1 : 64 희 석 액 과 반응시 켜 서 결과를 표 3과 표 4에 나타내었다.
- 38-
III. 실험 성적
1. 정 상 인 혈 청 (pooled N-human serum,
NHS)으| 분석
면역에 사용한 정상인 혈청의 총단백량은 7.2 g/
dl이었으며， cellulose acetate 전기영동상과 각 분 획의 백분율은 표 1과 그립 1에서 보여주는 것과 같 이 albumin은 62.1%, tXl -globulin은 4.3%, tX2 -
globulin은 9.6, β-globulin은 7.7 그리고 y-
globulin은 16.3으로서 모든 단백 분획 은 정 상범 위 였 으며 albumin/ globulin ratio는 1.6 : 1이 었 다 .
2. 황인면역혈청 (anti-human immune serum, p이yvalent ; AHS) 의 전기영동상
표 2와 그립 2와 그립 3에서 보여주는 것과 같이
면역혈청인 항인면역혈청 (AHS) 의 전기영동상은 AHS-2와 AHS-4가 AHS-1이나 AHS-3보다 면 역 글로불런 (immunoglobulins) 이 함유되 어 있 는
y-globulin 분획이 상당히 증가되었음을 확인할 수 있었다. 특히 AHS-4의 y-globruin 분획은 30.
4% 로써 파면역 (hyperimmunization) 된 것을 전기 영동상으로 관찰할 수 있었다.
3. Ouchterlony 이원면역확산법에 의한 황인 면역혈청의 역가측정
그림 4에 나타낸 것처럼 4개의 항인면역혈청
(anti - human immune serum ; AHS -1, AHS - 2,
AHS-3파 AHS-4) 의 1 : 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8 희 석 항혈청과 정상인 혈청의 Ouchterlony double immunodiffusion test 결과에 서 AHS-1과 AHS-
3은 1 : 1과 1:2 희석혈청에서 침강대를 나타내어
Table 2. Comparison of protein fractions of immunized rabbit sera by cellulose acetate electrophoresis
Immunized percent of serum protein fracrions (%)
rabbit No. albumin tXl -glob. tX2 -glob. β-glob. y-glob.
1 55.9 9.8 6.8 12.0 16.5
2 51.6 9.6 5.2 10.2 23.4
3 52.5 9.4 4.6 12.0 21.5
4 43.0 8.5 6.1 12.0 30.4
EP pattern of AHS - 1
16.5 12.0 6.8 9.8 55.9
EP pattern of AHS - 2
23.4 10.2 5.2 9.6 51~'6
Fig. 2. Comparison of the cellulose acetate electrophoretic patterns of polyvalent antisera(AHS-1 and -2) to the pooled normal human serum
n
EP pattern of AHS - 3 EP pattern of AHS - 4
21.5 12.0 4.6 9.4 52.5 30.4 12.0 6. 1 8.5 43.0 Fig. 3. Comparison of the cellulose acetate electrophoretic patterns of polyvalent
antisera (AHS - 3 and - 4) to the pooled normal human serum
1:2 1:8 1 : 2 1 : 8
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Titration of AHS - 3 Titration of AHS - 4 Fig. 4. Titration of anti - human immune sera (AHS -1, - 2, - 3 and - 4)
by Ouchterlony double immunodiffusion test
AHS-1파 AHS-3의 항체 가는 1 : 2 였 으며， IgM) 에 대응하는 각각의 항체를 확인하기 위하여 AHS-2와 AHS-4는 1 : 1, 1: 2와 1:4 희석항혈 정상인 혈청의 전기영동을 길게 (50 volts, 2시간)하 청에서 침강대를 나타내어 AHS-2와 AHS-4의 고 항인면역혈청 (AHS-4) 을 도랑 (trough) 에 가하 항체가는 1:4 인 것으로 증명되었다(그림 4) . 고 면역확산을 하여 IgG, IgA와 IgM에 대한 침강대
를 그림 5와 같이 명확하게 관찰할 수 있었다
4. 정상인 혈청 (NHS) 내 면역글로불린의 면역 그리고 이종동물에 면역원으로 면역접종하였을 전기영동상 때 항체는 면역한 동물혈청의 y-globulin 분획에
함유되어 있다는 사실을 증명하기 위하여 면역혈청 정상인 혈청 (NHS) 의 면역글로불런(IgG， IgA, (면역한 가토혈청)을 전기영동하여 혈청단백 분획
- 40-
IgA IgM IgG
“ ‘
II1II'-
-
Fig. 5. Immuno - electrophoretic patterns of im- munoglobulins (IgG, IgA, IgM) of norm- al human serum protein
을 분리시킨 후 도랑에 면역원으로 사용하였던 정상 인 혈청을 가하고 면역확산을 시켜서 확인한 바 y-
globulin 분획 영역에만 여러 개의 침강대가 생성된
것을 그림 6과 같이 관찰할 수 있었다.
5. 항인면역혈청 (AHS) 의 면역전기영동상의 비교
4 개의 항인면역혈청 (AHS-1, AHS-2, AHS
AHS-1
anti-human serum-4
Fig. 6. Precipitation bands in y - globulin fract- ion of rabbit serum protein are shown the corresponding antibodies against normal human serum
3파 AHS-4) 의 면 역 전 기 영 동상을 살펴 보면 Ouchterlony double immunodiffusion test에 의 한 항체가 (antibody titer) 가 1:2로 나타난 AHS-l과 AHS-3의 면역전기영동상은 y-globlin 분획 영역 에 albumin에 대 한 침 강대 는 약하고 y-globulin에 대한 침강대는 나타나지 않았고 항체가가 1:4로 나 타난 AHS-2와 AHS-4의 면역전기영동상은 albumin, aj - globulin, a2 - globulin, β globulin
파 y-globulin에 대응하는 모든 항체가 생성되었으 므로써 모든 혈청분획에 대응하는 침강대가 나타난 것을 그림 7에서 관찰할 수 있었다.
AHS-2
NHS NHS
AHS-3 AHS-4
Fig. 7. Immuno - electrophoretic patterns of anti - human immune sera (AHS -1, - 2, - 3 and - 4)
” 와
6. Coombs test에 항인면역혈청의 응용
Anti-D serum을 22% bovine albumin으로 2배 계단희석한 각 희석액에 동량의 2% Rh 양성 O협 적혈구 식염수부유액을 가하여 감작 (3iC ， 60분) 시 킨 후 면역혈청인 AHS-4의 2배 계단희석액파 반 응시킨 결과 표 3에 나타낸 것과 같이 anti-D
serum의 1 : 32 희석액에 감작시킨 적혈구가 AHS-4의 1 : 16 희석액과 반응하였으며， anti-D
serum의 1 : 8 희석액과 감작시킨 적혈구와 AHS-
4의 1 : 32 희석액은 잘 반응하였으나 anti-D
serum 의 1 : 16 희석액파 감작시킨 적혈구와 AHS-4의 1 : 32 희석액은 반응하지 않았다.
그리고 표 4에 나타낸 것파 같이 anti - D serum을 N -saline으로 2배 계단희석한 각 희석액에 동량의
2% Rh 양성 O형 적혈구 식염수 부유액을 가하여
감작시킨 후 면역혈청인 AHS-4의 2배 계단희석액 과 반응시 킨 결과 anti - D serum의 albumin 희 석 액 의 검사결파와 대동소이하였다. 즉， anti-D의 1 : 32 희석액에 감작시킨 적혈구와 AHS-4의 1 : 16
희석액은 잘 반응하였고 anti - D serum의 1 : 8 희 석액에 감작시키고 AHS-4의 1 : 32 희석액에 반응 시컨 것은 약반응을 일으켰으나 anti - D serum의
1 : 32 albumin 희석액에 감작시킨 척혈구와 anti- D serum의 1 : 32 식염수 희석액에 감작시킨 척혈구 모두 AHS-4의 1 : 16 희석액과 잘 반응하였으므로 AHS-4는 Coombs test anti - globulin serum 을 대신해서 사용할 수 있음이 증명되었다.
IV. 고 찰
면역 실험은 Jenner, E. (1 796) 에 의해서 생체 실 험이 이루어진 이래 계속되었다. 그리고 면역체의 증명 방법 인 침 강반응을 Oudin, J. (1947) 1)이 고안하 였 고 Ouchtelony, O. (1947) 1)가 agar gel 내 에 서
double immunodiffusion test를 발전 시 키 므로써 면 역학적 반응인 항원항체반응을 더욱 고도로 특이적 인 방법으로 여러 학자들이 발전시켰다. Tiselius, A. (1 937)2)에 의해서 최초로 전기영동법이 개발되어 사람의 혈청단백의 성분을 분리하는데 기여했고 그
Table 3. The reactivity of diluted anti - human immune serum against the sensitized cells(RBC+ Alb-dil. anti - D)
Dil. of anti - D Dilutions of anti - human immune serum
in sensi - cells 1x 2x 4x 8x 16x 32x
1x +十 +十+ +++ +++ +++ +++
2x +++ ++ ++ +++ 十++ +++
4x +++ ++ ++ +++ +十+ ++
8x ++十 ++ ++ +++ +++ +
16x ++十 ++十 +++ +++ +十
32x +++ ++ ++ ++ ++
Table 4. The reactivity of diluted anti-human immune serum against the sensitized cells (RBC + Sal- dil. anti - D)
Dil. of anti - D Dilutions of anti - human immune serum
in sensi - cells 1x 2x 4x 8x 16x 32x
1x ++ +++ +++ +++ +++ ++十
2x ++ ++ ++ ++ +++ +++
4x ++ ++ +++ +++ +十+ ++
8x ++ +++ +++ +++ ++
16x ++ ++ ++ ++ ++
32x ++ ++ ++ ++ ++
- 42-
64x ++
+
64x ++
+ +
후 Grabar, P. 와 Williams, Jr .C.A. (1953)5 ，6) 에 의해서 개발된 agar gel 전기영동법에 면역확산법을 병 합시 킨 면 역 전 기 영 동법 (immunoelectrophoresis) 을 이용하여 혈청단백 분획을 더 많은 성분으로 분 리 동정 하게 되 었 다 . 그리 고 Grabar, P. 파 Burtin, P. (1960) 8，9)은 환자의 혈청， 소변 및 뇌척수액의 임 상진단을 위해서 면역전기영동법을 이용하여 혈청 단백 중외 면 역 글로불런 (immunoglobulins) 에 대 해 서 광범위하게 연구하였다. Kröll, J. (1968) 3)는 정 량적인 면역정량법에 의해서 혈청단백을 면역학적 으로 상이한 15 내지 20개의 단백이 있음을 발표하 였다. Alan solomon(1969) 12)은 면역글로불런에 저 분자단백 인 7S y - globulin과 고분자단백 인 19S
y-globulin이 정상인 혈청에 존재함을 동정하였고，
Kröll, J. (1969) 3 ， 4) 는 서 로 다 른 polyvalent
antiserum 줌의 항체량을 면역전기영동법에 의해서
정 량 적 으 로 비 교 하 였 다 H ansson, U. B 와
Laurell, C. B (1969) 13)는 면역전기영동법을 이용하 여 19S, IgM globulin 중에 M-성 분이 함유된 것 을 발견하였다.
본 실험은 정상인 혈청 (총단백 7.2g/dl, A/G ratio 1. 6 : 1) 을 alum 처 리 하여 가토 (N ew Zealand white rabbit) 에 근육내 혹은 복강 내 로 면 역 접 종하 여 가토 4마리 각각의 면역응답에 의해서 생성된 항 인 면 역 혈 청 의 역 가 를 Ouchterlony double immunodiffusion test에 의 해 서 측정 한 결파 1번 과 3번 가토에서 생성된 항인면역혈청 AHS-1파 AHS-3은 1:2 이었으며， 2 번과 4번 가토에서 생산 된 항-인면역혈청 AHS-2와 AHS-4의 항체가는 1:4이었다. 이 결과는 표 2에서 나타낸 것처럼 cellulose acêtate 전 기 영 동상에 서 도 y-globulin의 비교에서 같게 나타났다. 특히 AHS-4의 y- globulin 분획은 30.4% 나 되었다.
그리고 4개의 항인면역혈청 AHS-1, -2, -3
파 -4의 면역전기영동상의 비교에서도 AHS-l파 AHS-3은 y-globulin 영역의 anti - globulin 항체 가 생성되지 않은 것을 볼 수 있었으며 AHS-2파 AHS-4의 면역전기영동상에서 면역글로불런 (lgG，
IgA, IgM) 의 침강대가 명확하게 생성된 것을 관찰 할 수 있었다. 그러므로 이들 항인변역혈청 중 AHS-4를 Coombs testω) 에 쓰이는 anti - globulin serum (Coombs serum) 으로 대 치 해 서 쓸 수 있 는지 를 실험하였다. 22% bovine albumin으로 2배 계단 희석한 anti - D serum의 각 희석액으로 감작시킨 2% Rh 양성 O형 적혈구와 2배 계단희석한 AHS- 4의 각 희석액간의 실험결과 AHS-4의 1 : 16 희석
액 은 1 : 1로부터 1 : 32의 anti - D serum으로 감작 시킨 감작혈구와 모두 응집 반응을 일으켰고，
AHS-4의 1 : 32 희석액은 1 : 1로부터 1 : 8의
anti - D serum으로 감작시킨 감작혈구와만 응집하 였다. 그러고 N -saline으로 2배 계단희석한 anti- D serum의 각 희석액으로 감작시킨 2% Rh 양성 O
형 적혈구와 AHS-4의 2배 계단희석액과의 반응결 과는 AHS-4의 1 : 32 희석액은 anti-D의 1 : 4 희 석액으로 감작시킨 감작혈구와 반응했고， AHS-4
의 1 : 16 희석액은 anti-D의 1 : 1로부터 1 : 32 희 석액으로 감작시킨 감작혈구와 만족할만한 반응을 보 였 다 . 원 종 덕 과 김 경 희 14， 15.16)는 anti - globulin serum (Coombs serum) 의 1 : 1로부터 1 : 32 희 석 액 이 anti-D의 1 : 32 희석액으로 감작시킨 감작혈구 와 반응하면 anti - globulin serum으로 쓸 수 있 다 고 기술하였으나 본 시험 결과 AHS-4의 1 : 16 회 석액이 anti-D의 1 : 32 희석액으로 감작시킨 감작 혈구와 만족할만한 반응을 나타냈으므로 AHS-4의 1 : 16 희 석 액 으 로 anti - globulin test (Coombs
test) 를 수행할 수 있다고 사료된다.
V. 결 과
Alum으로 처리한 정상인 혈청단백에 대한 가토의 면역응답파 면역접종으로 생성된 항인면역혈청
(anti - human immune serum, polyvalent) 의 항체 가 측정과 그 변역혈청의 Coombs test 응용에 관한 실험 결과는 다음파 같다.
1. 항인면역혈청 AHS-1, AHS-2, AHS-3와 AHS-4의 cellulose acetate 전 기 영 동상에 서 항체 를 함유하고 있는 면역혈청의 y-globulin 분획의 농도를 살파보면 AHS-1은 16.5%, AHS-3은 2 1. 5% 로 비교적 낮았으며 AHS-2는 23.4% 이었고 AHS-4는 특히 30.4% 로써 높았다.
2. 4개 의 항 인 면 역 혈 청 AHS-1, AHS-2,
AHS-3 파 AHS-4 의 Ouchterlony double immunodiffusion test 에 의 한 항 체 가 (antibody titer) 는 AHS-1과 AHS-3은 1:2이 였 으 며，
AHS-2와 AHS-4는 1:4이 었다.
3. 항인면역혈청 AHS-1, AHS-2, AHS-3와 AHS-4의 면역전기영동상에서 정상인 혈청단백에 대한 각 분획에 대응하는 항체가 AHS-2와 AHS- 4는 생성되었음이 증명되었으나 AHS-1파 AHS- 3은 y-globulin에 대한 항체가 생성되지 않았다.
4. 항인면역혈청 AHS-4의 Coombs test에 응용 을 위 한 실험 에 서 22% bovine albumin과 생 리 식 염
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A Study for the Immunologic Response to Normal Human Serum Protein in Rabbits and the Application of Anti- Human Immune Serum
Oh, J. S., Kim, S.M., Shin, S. H., Choi, Y. J.
Dept. of Clinical Pathology Wonkwang Public Health junior College
ABSTRACT
The immunologic response against alum treated human serum protein in 4 rabbits and the titration of antibodies in anti- human immune sera (polyvalent) produced by immunization were studied by Ouchterlony double immunodiffusion test and immunoelectrophoresis technic and the application of anti- human immune sera (polyvalent) substitute for anti- globulin serum (Coombs serum) was evaluated by Coombs test.
The test results were as follows.
1. In cellulose acetate electrophoretic patterns of anti-human immune sera AHS-1, AHS-2, AHS-3 and AHS-4, y-globulin fraction level (%) contained antibodies in AHS- 1 was 16. 5%, that level of AHS-3 was 21.5% and that level of AHS-2 was 23.4%, AHS-4 was particularly
30.4%
2. Antibody titer of anti- human immune sera AHS -1 and AHS- 3 was 1 : 2 by Ouchterlony double immunodiffusion test and that of AHS- 2 and AHS-4 was 1: 4.
3. In immunoelectrophoretic patterns of anti- human immune sera AHS -1, AHS- 2, AHS- 3 and AHS-4, antibodies corresponding to each fraction of normal human serum protein were produced in AHS- 2 and AHS- 4 but antibody corresponding to y-globulin of human serum protein was not produced in AHS -1 and AHS- 3.
4. In the study for application of anti- human immune serum, polyvalent (AHS- 4) into the Coombs test, it is proved that Rh- positive 0 cells sensitized by 1 : 32 dilution of anti- D serum diluted by 22% Bovine albumin and N- saline were agglutinated by 1 : 16 dilution of AHS-4 substitute to anti- globulin serum (Coombs serum) .
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