Hy b r i d o ma와 細胞融合 技術 S - 19
Hybridoma 와 細胞融合 技術
김 원 배
(동아제약(주) 책임 연구원)
I. 서 론
1975년 K b h le r 와 M ils te in 의 h y b rid o m a te- chn iqu e 의 발견은 b io te c h n o lo g y를 급속하게 발전시키는 계기의 하나가 되어 현재 이의 실용 화가 활발히 추 진되고 있다.
H y b rid o m a tec hnique 은 s p e c ific antib ody 를 생산하는 p la s m a cell 과 영원히 분열증식할
수 있는 m yelom a 의 유전자를 공유하는 잡종세
포를 만들어냄으로써 단일 항원결정기에 대한 sp e c ific a n tib o d y를 대량으로 만들 수 있는 길을 열었다.
현재 세포융합기술을 이용하여 수많은 hyb- rid o m a cell 이 수립되었고 여기서 얻은 m ono
c lo n a l antib ody (M eA b) 는 im m u n o a s s a y를 이 용한 질병의 진단, 미량 생리활성물질의 정제, d r u g ta rg e tin g 및 r e c e p to r 의 화학구조규명，
c a n c e r 의 치료등에 유력한 수단으로 그 응용범
위를 넓혀가고 있다.
본 글에서는 M c A b를 만들기 위한 hy b rid o m a
technique 의 기술적 배경 전반을 고찰하고 아
울러 M c A b의 약학적 이용의 실례에 대하여 기
술하고져 한다.
II. Hybridoma 이론및 practical technique
[1] Hybridoma의 제 조 1 . Myeloma cell lines
대부분의 h y b rid o m a technique 은 주로 m o
u se s y s te m내에서 이루어지고 있으며，hum an
h y b rid o m a tec hnique 의 경우에는 적당한 m ye
lom a cell line 의 개발이 초기단계이며 이제 시
작단계라고 할 수 있다.
H y b r id o m a의 지속적인 분열 성장은 m yelom a
cell 의 성질에서 유래되며， m y elo m a ce ll 중 h y b rid o m a te c h n iq u e 에 이용되려면 크게 두
가지의 성질을 가져야 우수한 c e ll lin e 이라 할 수 있다.
첫째로 선택적 marker를 가져야 한다. 즉 ， 세포융합후 hybrid cell만을 선 택 적 으 로 선 별 하 기 위해서는 융합되지 않은 myeloma는 선택적 으로 사 멸시키는 것이 간 편하고도 유 리 하 다.
Marker로는 약제내성세 포 주가 사 용 되 고 있으 며 대표적인 것이 8-azaguanine내성 (H P R T -) 및 2. 6-diaminopurine 내성 (A R R T -) 세포주이 다(내.
둘째로 im m u n o g lo b u lin을 생산하지 않아야 한다. 만약 m yelom a 자체에서 im m u n o g lo b u lin 을 생산한다면 h y b rid o m a c e ll 에서 원하는 spe~
cific antibody 이외에 h ybrid im munoglobulin°|
나 m yelom a 자체의 im m u n o g lo b u lin 을 생산하 게 되므로 A b정제시 s p e c ific A b를 정제해야 되는 번거로움이 따르기 때 문 이 다. 주로 많이 쓰이는 m yelom a ce ll lin e은 .T a b le 1에 나타 내었다.
2 . S p le e n c e ll
lym ph o id ce ll 은 splee n, lym ph node, 골수 등에 분포되어 있으며, ly m p h o id c e ll 중 새 를
생산할 수 있는 능력을 가진 것은 B lym pho-
cyte 이다. A g에 의하여 자 극 을 받은 B lym- phocyte 는 blastoid* ce ll 상태로 된후 분열을 시 작하게 되며 이때 각각의 세 포 는 한 종류의 spe- cific Ab를 생산하기 시작 한다.
수 차례의 분열후 B lymphocyte는 memory cell과 plasma cell로 변하게 된다. 세포융합에 가장 적절한 세포는 blast형의 plasma cell 이 며, 세포를 준비하는 과정에서 이들 세포의 viability를 높여야 높은 빈도의 융 합 을 유도할
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Table 1. M ouse and Rat m yelom a lines used fo r cell fusion.
Nane Parental
Derived from Phenotype
tumor
lg Drug resistance
Mouse lines
4TO. 2 MPC-11 45. 6TG1. 7 IgG2b(K) 6-Thioguanine
1.0-mM ouabain
P3-X63/Ag8 MOPC 21 P3K IgGl(K) 8-Azaguanine
N Sl/l.Ag4.1 MOPC 21 P3-X63/Ag8 (K) Non-secreted 8-Azaguanine
FOX-NY MOPC 21 NS-1 None 8-Azaguanine
2.6-Diaminopurine
SP2/0 MOPC 21 P3-X63/Ag8 None 8-azaguanine
X63-Ag8.653 MOPC 21 P3-X63/Ag8 None 8-Azaguanine
Rat lines
Y3-Agl.2.3 SR 210 210.RCy3.Agl (K) 8-Azaguanine
IR938F SR 210 Y3.Agl.2.3 None 8-Azaguanine
수 있다. Plasma cell 로는 lymph node, 골수 둥을 사용할 수도 있지만 spleen 에는 많은 B cell 이 존재 하며 취급이 용이 하여 가장 많이 이 용되고 있다.
Hybridoma cell 이 Ab를 생산하는 능력은 plasma cell 에 의존하므로 면역조작후 항체 가가 최고치에 달하였을 때 spleen cell 을 수집 하는 것이 좋다. 따라서 융합실시 3 〜 4일 전에 정 맥 내로 항원을 주사하여 spleen 내 의 lympho
cytes 를 자극시키는 방법 이 많이 이용된다(3>.
면역조작시에는 항원의 양，주사시기등이 결정 되어야 하는데 사용되는 항원의 양은 항원의 종류 및 실험자에 따라 다르나 너무 많은 양을 투입시 에는 immunotolerence 가 유발될 수 있으 므로 고려 하여 야 한다. 항체 생 산을 촉진 하기 위하여 Adjuvant 가 사용되는데, 처음 면역시에 는 Complete Freund’ s adjuvant를 그 이후에 는 Incomplete Freund’ s adjuvant를 사용하는 것이 효과적이며 정맥주사시에는 adjuvant 를 사용하지 않는 것이 원칙 이다.
위와 같은 생체내 면역조작이외에 생체외에 서도 면역조작을 행할 수 있다. 생체외에서의 면역조작시 primary response는 극소량의 Ag 에 의하여 유도될 수 있으며, 이 방법은 원하는
isotype, 적 당한 specificity, affinity 의 Ab 를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있다(4>.
이 방법을 간략히 살펴보면， 쥐의 thymus cell 의 단세포현탁액을 supplemented DMEM 배지상에서 약 2 일 정도 배양후 세포를 제거하 여 thymus cell conditioned medium (TCCM) 을 만들고» 면역조작을 하지않은 쥐의 spleen 을 분리후 단세포현탁액으로 만들어 적당량의 Ag 이 들어 있는 50% TCCM, 50% supplemen
ted DMEM 배 지 상에 서 2〜 4 일 정 도 배 양후 fusin에 이용한다. 생체의 면역조작에서 얻을 수 있는 McAb는 거 이 lg M type 으로 보고되어 있다^ 최근에 hybridoma효율을 높이기 위한 새로운 면역조작방법이 소개되었다^
첫째로 면역된 쥐의 spleen을 단세포 현탁액 으로 만든후, 이를 X-ray를 조사한 syngenic mouse의 꼬리정맥에 adoptive transfer를 한 후 즉시 항원을 복강주사하고 4 일정도후 spleen 을 제거하여 융합에 사용하는 방법과， 둘째로 면역된 쥐의 spleen을 제거한 후 융합전에 Ag 이 들어있는 배지에서 2〜 3 일간 배양후에 융합 에 사용하거 나 polyclonal activator 인lipopoly- saccharide가 함유된 배지에서 spleen cell 을 3〜 4 일간 배 양하여 lymphoblast의 숫자를 증가
Hy b r i d o ma오ᅡ細胞融合 技術 S-21
시켜서 융합에 사용하는 방법이 있다.
위와같은 조작에 의하여 A g에 대한 specific Ab를 생산하는 hybridoma의 비율이 10~50 배 증가되는 것으로 보고되고 있다.
3. 세포융합방법
cell fusion은 자연적으로 일어나기도 하지만 10_s~ l ( r 7정도로 효율이 극히 낮기 때문에 fu
sion 효율을 높이기 위하여 여러 방법이 시도되 었다. 초기에는 fusion을 유도하는 물질로써 sendai virus 가 사용되 었으나 1974 년 Kao등(81 에 의하여 식물세포융합시 polyethylene glycol (PEG) 이 사용된후, 1975년 Pontecorvo에 의 하여 동물세 포융합시 에 도 PEG 가 효과적 이 라 는 것이 밝혀 진후 현재 거의 모든 cell fusion 에는 PEG 가 주로 쓰이고 있다.
PEG 의 작용기작은 정확히 밝혀져 있지는 않 지만 융합효율에 미치는 영향에 대하여서는 많 이 연구되어져 있다예. 일반적으로 융합효율은 P E G 의 분자량, 농도, 처리시간등에 의하여 영 향을 받는다고 보고되어 있다.
P E G 의 최 적 농도는 40~50 %이 며 이 경 우 physical free water는 거의 없는 상태이다. 그
러나 P E G 농도가 높은 경우에는 삼투압이 높아 지므로 이를 낮추기 위하여 P E G 용액에 Dime
thyl sujphoxide (DMSO) 를 첨 가해 순다191.
DMSᄋ가 과량 들어 가는 경우에는 bicellular fusion 이외에 다수의 세포간에 융합이 일어나게 되므로 적당한 농도는 bicellular fusion 효율이 높고 mulficellular fusion효율이 낮은 점 이다.
보편적으로 40~50% P E G 와 5~10%의 D M Sᄋ가 사용되고 있다.
본 연구실에서 확립한 fusion 방법은 아래와 같다.
Spleen cell과 myeloma cell을 10 : 1 에 서 5 ： 1정도로 섞어 원심분리후 침전물을 얻고 여 기에 37°C 로 가온된 PEG 40% (PEG 1450, DM- S ᄋ 10%) 1 m/ 을 lm //m in 의 속도로 가한早 DMEM배지 lm / 을 같은 속도로 가하고 5분간 에 걸쳐 15 m/ 의 DMEM배지를 첨가하며 서서 히 흔들어 준다. 그후에 37°C 항온수조에서 5 분간 방치한 다음 원심분리 하고 상등액을 버린
후 침 전물에 conditioned HT 배지 를 첨 가하여 현 탁시 킨후 96 well 에 분주한다.
한편 최근에 새로운 융합방법으로 electric field - induced fusion법이 소개되 었다 1패111. 이 방법의 장점은 효율이 높고 융합과정을 현미경 상에서 주적할 수 있기 때문에 hybrid cell 을 쉽게 동정할 수 있으며 경손 변이주의 사용이 불필요하다는 것이다. 융합조작이 끝나면 20%
fetal bovine serum 이 함유된 배지로 희석 하여 96 well 에 분주하는데 이때 96 well 은 전 날 미 리 동종의 쥐의 macrophage를 분리, 분주배양 후 상등액을 제거한 상태에서 사용한다.
4 . H y b rid o m a 선별
세포융합후 배지내에는 여러종류의 세포가 존 재하게 된다. 따라서 융합되지 않은 cell, 원하 지 않는 hybrid cell과 원하는 hybridoma가 혼 재되어 있는데서 원하는 hybridoma만을 선별하 여야 한다. 융합되지 않은 spleen cell 은 세포 분열을 할 수 없으므로 배양상에서 사멸하게 되 지만 융합되지 않은 myeloma는 계속 생육하므 로 선택 marker를 이용하여 선별하여야 한다.
많이 쓰 이 는 m y e lo m a는 일 반 적 으 로 O u a b e in 내성 (12>, 8 - a za g u a n in e 내성，6 - th io g u a n in e 내 성131 및 2. 6 -diaminopurine 내 성 변 이 주 이 며 이 특 성 을 이용하여 융합되지 않 은 m y e lo m a를 선 택적으로 사멸시킬 수 있다. 8-azaguanine 과 6 - th io g u a n in e에 내성인 c e l l은 h y p o x a n th in e p h o s p h o r ib o s y l tr a n s fe r a s e ( H P R T ) 가 결핍된 세 포 이 므 로 이들의 선별에는 H A T (h y p o x a n th in e， aminopterine, thymidine) 배지를 사용할 수 있 다. 즉, 세 포융합후 2 4시 간 정 도 는 2 0 % F B S 가 함유된 D M E M 또는 R P M I 배지상에서 배양 하고 그 후부 터는 H A T성분이 들 어 있 는 배지로 2 ~ 3 일 간격으로 갈아주면 H A T 성 분 중 a m in o p te r in e 은 folic a c id r e d u c ta s e 의 활성을 저
해하는 물질로써 p u rin e 의 생합성 경로인 de
novo 경로를 억제한다. HPRT 를 가진 세포는 s a lv a g e 경로를 통해서 배지내의 h y p o x a n th in e 을 이용하여 nucleic acid를 생산하여 생존할 수 있으나 HPRT 가 없는 myeloma는 hypo
xanthine 을 이용할 수 없으므로 nucleic acid
S - 2 2 김 원 배
를 생산하지 못하게 되어 결국 사멸하게 된다. 따라서 H P R T를 지닌 p la sm a c e l l의 성격과 계속 분열증식할 수 있는 m yelom a c e ll의 성격 을 동시에 지닌 h y b r id c e l l만이 살아남게 된다. 2. 6 - d iam in o p u rin e 내성인 변이주의 경우에는 ad en in e p h o s p h o rib o sy l tr a n s fe r a s e ( A P R T ) 결 핍 주 이 다(2>. 이 세포는 a z a s e r in e을 함유한 배지에서는 p u r in e을 생성하지 못하고 사멸된다. 따라서 이 경우에는 AAT (adenine, azaserine, thy m id in e) 배지를 사용하면 h y b r id c e ll 만을 선별할 수 있다. T a g g a r t등은 N S - 1 의 자연변
이주인 F o X - N Y를 분리하였는데 이 세포주는
H P R T A P R T -인 double m u t a n t이었다. 이 m y e lo m a를 이용하여 h y b r id o m a선별시에 A P - R T에 의한 선별과 H PRT에 의한 선별방법을 비 교하였다.
이 결과에 의하면 A A T배지를 이용한 1우에
H A T 배지를 이용한 경우보다 더 많은 안정된
h y b r id o m a를 얻을 수 있다고 보 고 하 였 다^ 이 밖에 o u a b ain 은 p las m a m e m b ra n e 의 N a + — K + a c tiv a te d A T P a s e의 저해제이며 이것에 대한 s e n s it iv it y는 species 에 따라 다르다. 이 현상 을 이용하여 K o z b o rn2)는 m u rin e m yelo m a cell 과 h u m an B ce ll 을 융합하였다.
최근에 F e i t등(13>은 h y b r id o m a선별시 H A T
배지만을 사용하는 것보다는 H A T배지에 in s u
lin 을 10 _1〜 1으3u / m/ 정도 첨가하여 사용한 경 우 h y b rid o m a clone 의 숫자및 크기가 상당히 증 가 되며 ， A b 를 생산하는 clone 의 총 수도
H A T를 사용한 경우보다 약7배정도 증가했다
고 보고하였다. 이들은 이러한 in s u lin 의 효과
는 g lu c o s e 대사가 향상됨에 따라 생기는 것으
로 추측하였 다.
선택 m a r k e r에 의하여 선별된 h y b r id c e l l중 에서 원하는 s p e c ific A b를 생산하는 clo ne 만 을 선별하여야 한다. 이 경우 im m u n o assay 를 통하여 항체가를 즉정하여야 하는데 즉정방법의 선택기준은 가능한 짧은 시간에 손쉽게 많은 검체를 처리할 수 있어야 하며 미량의 항체를 검출할 수 있는 측정법이어야 한다. 주로 많이 쓰이는 방법에는 E L I S A와 R I A 법이 있다. 그 러나 방사성 동위원소를 이용하는 R I A는 사용
상 단점이 많으므로 주로 E L I S A 법이 많이 사
용 되고 있다<14).
E L I S A 의 원리는 항원이 부착된 plate 에 배
양액을 가하고 일정시간 반응후 세척하고 여기
에 효소로 표지되어 있는 anti- m ouse immuno-
g lo b u lin을 첨가하여 반응후 세적하고 기질을
가하여 발색정도를 비교하는 것이다. 5 . Cloning
H y b r id c e l l은 분열을 거치는 동안 염색체수 의 변화가 일어나서 p o ly c lo n a lity를 나타내게 되거나， 혹은 원하지 않은 h y b r id c e ll과 목적 의 h y b r id c e l l간에 경쟁이 일어날 위험성이 존 재하 므 로 、sp e c ific A b를 생산하는 w ell 이 결정 되면 가능한 빨리 단세포로 분리하는 과정을 행 하여야 하며 이 과정을 c lo n in g 이라 한다. 이
방법에는 하나의 세포를 하나의 w ell 에 증식시
키는 lim itin g d ilu tio n 법(3)과 a g a r p la t e상에서 분산， 배양하는 so ft a g a r c lo n in g 법(3，15)이 있
다. 이러한 c lo n in g과정을 거쳐서 하나의 세포
가 증식하여 형성한 것이 m onoclone 이며 이것
이 생산하는 A b 가 m onoclonal an tib ody 이다. 그러나 전자의 경우에는 항상 진정한 의미의
M c A b가 생산되는 것은 아니며 후자의 경우
cell 의존성이 있으며 o v e rla p p in g 의 문제점을 포함하고 있다.
최근에 su c tio n 장치를 부착한 모세관을 이용
하여 c lo n in g하는 새로운 방법이 소 개되 었다(18).
이 방법의 장점은 많은 수의 c근11을 효과적으로 c lo n in g할 수 있고 단세포의 tr a n s fe r 가 눈으로
확인되며 o v e r la p p in g의 문제점이 생기지 않는
데 있다. 그러나 기술습득에 다소 어려움이 있
고 c lo n in g할 때 시간이 많이 걸리는단점이 있다
〔2〕Me새 의 characterization
H y b r id o m a가 얻어[지면 목적이 맞는 이상적
인 c lo n e을 선정해야 하므로 각각의 c lo n e이생
산하는 M c A b의 tite r , a ffin ity , s p e c ific ity , is o ty p e등을 검토하여야 한다.
1 • Titer
T i t e r의 정의는 측정방법에 따라 조금씩 다
르다. R I A 경우에는 lab e le d A g 의 50 % bind- in g을 나타내는 a n tis e ru m 의 희석배수를 나타
Hybri doma 오ᅡ細胞融合 技術 S - 23
내며 H A (Hemagglutination) 의 경우에는 응집 이 일어나는 최대 희석배수를 나타낸다. E IA 경우에는 음성대조액의 값 이상을 나타내는 최 대 희석배수로 결정하는 end-point tite r 와 표 준곡선을 가지고 결정하는 standard curve ti- ter 의 2 가지로 구 분된다1171. 그러나 후자의 경 우에 항원을 측정할 때는 문제점이 없으나 항체 량을 측정시 Ab a ffin ity에 따른 변화때문에 부 적합하므로 항체측정시에는 end-point tite r 를 사용하는 것이 좋다. Ab titer 자체는 큰 의미 를 가지지는 않지만 c lo n in g과정중 항체생성정 도의 즉 도로, 또 한 hybridoma 배양시 Ab 생성 량을 측정하는데 이용된다.
2 . A ffin ity
일반적으로 A b 의 affin ity 는 큰 것이 좋지 만 im munoaffinity p u rific a tin과 같은 경우에는 a ffin ity가 다소 낮은 것이 유리하다. 이러한 affinity 는 A g - A b 반응의 평형상수로써 식(1) 로 표현된다.
[Ag-Ab]
[Ag] [Ab] K2 Keq
(Ag] ! C oncentration of free antigen [Ab] ! C oncentration of free antibody [Ag*Ab] I C oncentration of Ag-Ab complex K u K2 : The rate of association and dis
sociation
Keq : The equilibrium constant or a ff i
nity of the Ab.
이때 K e q값은 competitive R I A에 의한 결과 를 가지고 식(1)로 부터 변형된 식(2)에 대입하 고 S c atc h ard p lo t에 의하여 구할 수 있다.
| - = K e q (q-B) (2)
B ! Concentration of bound Ag F •• Concentration of free Ag
q : T otal concentration of Ab binding sites.
즉 B /F 와 〔미 를 plot할 때 나타나는 기울기 가 Keq (unit: //M) 이며 x 축과 만나는 점 이 다 (unit: M//) 이다. 그러나 많은 hybridoma 가 생긴 경우 각각의 affinity를 측정하는 것은 복 잡한 일이다. 최근에 손쉽게 많은 McAb 의 af~
Inhibitor (M/L) Fig. 1. D eterm ination o f the 5 0 % in h ib itin val^
in the com petitive radioim m unoassay.The [IJ for monoclonal antibody DBF405 and DBF208 is 1.8x 10"loM and 5.5x 10"9M. Thus the affinity constants of DBF405 and DBF208 is 1.5 x lO 10 and 4.8x10®. At then, total tracer concentration
is 5xlO-12M.
fin ity를 구 하 는 방법이 소 개 되 었 다(18>. 이 방법 은 a sc itic flu id나 culture su p e rn a ta n t 를 정 제하지 않고서 사용할 수 있으며 com petitive R I A를 확립하면 바로 a ffin ity를 구 할 수 있는
장점이 있다. 즉 Fig. 1에서 보 는 바 와 같이 50
% in h ib itio n을 나타내는 in hibitor 의 농 도 [It]
가 구해지면 식(3)에 의하여 K e q를 구 할 수 있다
Keq = 8 ⑶
3 ( C I O - ( T O )
[Tt] ! Total amount of tracer
특히 이 방법은 Scatchard plot시 직선을 구하 기 어려운 경우에 유용하게 사 용 할 수 있다.
3 . Specificity
A f f in ity 가 우수하여도 s p e c ific ity 가 좋지 않
은 M c A b는 사용상에 문제가 많다. 따라서 Mc-
A b를 선 별 하 는 작업중에서 가장 큰 비중을 차 지하는 것이 s p e c if ic it y면이라 할 수 있다.
C r o s s re a c tio n 정도는 s p e c if ic ity 를 나타내 는 측도로써 competitive R IA를 이용하여 즉정 하는 것이 일반적이다. 이때 cross r e a c tiv ity (% ) 는 la b e le d 쇼용을 50% displacement할 수 있는 A g과 유사물질 (cross r e a c t a n t ) 의 무게 백분율로써 표시된다. 그러나 c r o s s r e a c tiv ity 는 assay sy ste m 에 따라 다른 양 상 으 로 나타 날 수 있다. 실례로 W a d a등 ^ 은 A n ti- /9 h C G
S - 24 김 원
no 5003 MeAb를 사용한 경우 competitive RIA 에서는 1% 미만의 cross reaction 이 일어나지 만 sandwith EIA에서는 8. 3 %의cross reac- tion 이 일어났다고 보 고하였으 며, 이는 sand
wich 법은 competition 법과 달리 1st Ab (coat- ing 용) 가 과량이므로 생기는 것이라고 설명하 고 있다. 따라서 sandwich법의 경우에 speci
ficity 가 우수한 McAb를 사용하지 않으면 com- petition 법을 적용할 때보다 심 각 한 문제점이 생기므로 clone선정에 세심한 주의가 필요하다.
4.Ab 으I isotype 결정
얻어진 M c A b의 m o n o c lo n a lity를 알아보는 방법중의 한가지가 is o ty p e을 결정하는 것이다. Mouse 새의 isotype으로는 I gGw I gG,a> lg G,fc, l g G j , IgM, Ig A , I g E둥이 존재한다. 보 고된 m ouse M c A b의 is o ty p e은 주로 I g G 이며 그중 특히 I g G ^ l 많다. 한예로 R e im e r등(20) 은 human Ig G에 대한 31개의 McAb를 얻었는 데 IgG:a가 8 개 IgG:6가 3개, IgG, 와 IgM 이
1 개씩이었고 IgG, 이 19개였다.
Ab의 isotyping 방법으로는 RIA, EIA, immu- nodiffusion등이 사용되고 있으며 kit 화되어 시 판되는 것도 있다. 이중에서 E L IS A에 의한 방 법을 소개하면, 우선 96 well 을 ^ 으 로 coating 한 후 ascitic fluid나 배양액을 가한후 37"C 에 서 4 ~ 6시간 반응후 P B S로 세척한다. Rabbit anti-mouse subclass specific antiserum을 가 하고 2 시간 반응후 P B S로 세척하고 peroxi
dase- labeled goat anti — rabbit Ig G를 가하 고 3712 에서 30분반응후 기질용액을 가하여 반 응 시 킨 다. 30분간 반응후 반응을 중지 시키고 흡광도를 읽는다. 이때 양성반응으로 나타나는 것이 subclass 가 되는 것이다.
본 연구실에서 제조한 hCG specific McAb 인 D B F의 경우 8 개의 McAb중 6 개가 IgG, 이고 2 개는 IgG2a이었다.
〔3 〕McAb 으| 대량생산
Hybridoma cell 의 배양방법은 필요에 의하 여 결정되는 것이 이상적이다. 진단용이나 보 편적인 연구용으로는 mouse ascites를 이용하
는 것이 간편하지만 치료제로써의 M c A b 익 경 우에는 정제시 따르는 오염물질에 인한 a lle r g ic r e a c t io n때문에 cell c u ltu re (in v itr o ) 를 이용 해야 한다. 특히 많은 양이 필요한 경우에는 효 율적인 ce ll c u ltu re sy s te m이 요구된다.
1 • 생체내 배양
사 용 한 m yelom a ce ll 이 자랄 수 있는 개체를 쓰는 것이 일반적이다. 주로 m ouse ce ll line 이 많이 사용되므로 m ouse a s c it e s가 많이 사용되 고 있다. A s c it e s에 h y b rid o m a c e l l을 이식하 기 전에 m in e ra l oil 을 주입하면 tu m o r 형성률 이 향상된다고1111 알려져 있으며 일반적으로 10 일 전쯤 p r is t a n e을 복강내에 주사하고 5 X 105 정도의 h y b rid o m a ce ll 을복강내 주입하는 방법
이 많이 쓰이고 있다. 이때 얻어지는 a s c itic
flu id s에는 보통 1 ~ 2 0 m g /m / 의 세 가포함되어
있다. 그러나 이때 얻어진 im m unoglobulin 은
A b이외에 정상쥐의 p e rito n e a l, se ru m im mu -
n o g lo b u lin등이 섞여 있으므로 엄밀한 의미에서
M c A b로 보기는 어렵다. 한편 a s c it e s에서 얻어 지는 t it e r는 배양액의 t it e r보다 100- 100 0 배가 량 높다고 알려져 있다. 본 연구실에서 얻은 H B sA g sp e c ific h y b rid o m a인 H 4- 5 D의 경우 a s c itic flu id의 t it e r는 8 X 107(P N A tite r ) 로 써 배양액 t i t e r의 1000배 가량 되었다.
2. 생체외 배양
생체외 배양시에는 배양액중 보통 l~ 1 0 0 / / g / m/ 의 새 를 얻을 수 있으며 이때 생 산량 은 배 양조건에 크게 좌우된다. 특히 계대가 지연되는
경우에는 염색체의 손실이 생겨서 변이 h y b r i
dom a 가 생길수 있으므로 주의하여야 한다.
T able 2에서 보는 바와같이 생체외 배양시
에는 a s c it e s를 이용한 경우에 비해 몇가지 단
점이 있지마는 대량의 A b가 필요할 때 따르는
동물관리 및 쥐형질의 동일성 유지등 문제점 때 문에 생체외 배양이 많이 이용되고 있다. 생체 와 배양시 작은 규모에서는 flask , r o lle r bo ttle , m ic r o c a r r ie r b e a d둥이 사용되나 A b 필요량이
l g 이상일 경우에는 적합하지 않은 것으로 알려
져 있다. 따라서 대량생산시에는 다음과 같은 효율적인 배양기술이 필요하게 된다.
Hybr i do ma와 細胞融合 技術 S - 25
Table 2. Com parisiᄋn o f various ce ll culture technique.
Property Mouse ascites Roller bottle Micro carrier
bead
Micro encap
sulation
Hollow fiber Cells/ml
medium 107-109 7.5x10* 10 x10s 107-108 107-108
Operation
mode Batch Batch Batch Batch Continuous
Culture
life time 1-2 weeks 5-10 day 5-10 day 5-10 day up to.
2 months Cell/medium
seperation No No No Yes Yes
Irrelevant lg
0.5-lmg/ml None None None None
Labor
intensity + + + + + + +
(1) M ic r o e n c a p s u la tio n (23)
H ybrido m a cell 을 se m ip e rm e a b le m e m b ra ne <^1 e n c a p s u la tio n 하여 c o n tr o lle d co nd itio n 에서 2 〜 3 주간 배양하면 to ta l c e l l수가 증가 하여 3 X l 0 8c e ll/m / 정도가 되며, 배양하는 동 안 A b농도가 c a p s u le m /당 10mg에 이르게 된 다. 이농도는 전래의 배양법에 의해 얻는 양의 50〜 100배가 된다. 이때 영양성분은 ca psu le 을
통하여 안으로 들어갈 수 있으며 생산된 A b 는
m ic ro c a p s u le안에 남아 있게 된다. M ic ro e n - c a p su la tio n 법에 의해 생산되는 A b는 높은 농
도를 가지면서도 40〜7 5 %의 A b순도를 갖게되
며 ion exchange c h ro m a to g ra p h y 같은 간단한
분리법으로도 9 5 %이상의 순도로 A b를 얻을수
있고 9 0 %이상의 s p e c ific a c tiv ity를 갖는다. 따
라서 이 방법은 고농도의 A b를 얻을 수 있으며
정제가 용이할뿐아니라 동물의 관리가 불 필요 한 것이 장점이다.
(2) H ollo w f i b e r (23)
H ollow fib e r c u ltu re u n it는 c a r t r i g e의 원 통 양끝에 연결되어 빽빽히 꼬여져 있는 수백, 수천의 fib e r 묶음으로 구성되어 있으며 이 car
trid g e 내에서 h y b rid o m a ce ll 이 모세관벽에 근 접， 고착하여 존재하게 됨으로써 h y b rid o m a
c e lls과 배지사이에 효율적인 상호 교 환 현상이
일어나게 된다. 배지 용액이 p u m p in g 에 의해
c a r tr id g e 내에 주입되면 모 세 관 벽 을 관통하여 e x tr a c a p illa r y c h a m b e r i 'i ：0] hybridom a cell 을 거쳐 흐른 후 fib e r w a ll 을 통해 lu m in a 로 돌아가게 된다. 결국 이러한 과 정 을 통해 gas
와 영양분이 직접 ce ll 에 공급이 된 다.
한편 각 f ib e r의 lu m e n에 배열되어 있 는u l t r a f ilt r a t io n la y e r는 h y b rid o m a c e l l과 배지사 이의 물리적 방벽역할을 하면서 c e ll 이 분 비 하 는 A b가 e x tr a c a p illa r y ch a m b e r 에 잔 류 할 수 있도록 조 절 한 다. 따라서 제한된 공 간 내 에 A b 가 농축되어 존재하게 됨으로 손쉽게 대량의 M c A b를 생산할 수 있다. H o llo w f ib e r culture bioreactor 10개를자동조절장치에부착하여 M c A b
를 생산할 때 하루에 0. 3〜4. 0 g의 새 를 생산
할 수 있다는 보 고(24) 가 있다. 보 통 b io r e a c t o r 에 10* c e l ls을 접종하여 6〜 15일 배 양 하 면 10*
c e l l s / m /이상이 되며， 이때 2 m / / h r / b i o r e a c t o r 의 속 도 로 연속적으로 배양액을 모 을 수 있 다. 이때 A b농도는 0. 5〜6. 7 m g / m /정도이고 50〜 9 0 %의 순도를 갖는다. 또한 m e d ia를 효 율 적 으
로 조절하여 s e r u m사용량을 줄 일 수 도 있다.
이상으로 M c A b 의 생산을 위한 몇가지 배양
