Effects of Leejung-tang (理中湯) on MIA-Induced Osteoarthritis Rat

理中湯이 골관절염 유발 생쥐에 미치는 영향

국길호⋅오민석

대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Effects of Leejung-tang (理中湯) on MIA-Induced Osteoarthritis Rat

Kil-ho Kook, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D.

Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Dae-jeon University

RECEIVED December 17, 2013 REVISED December 31, 2013 ACCEPTED January 3, 2014

CORRESPONDING TO

Min-Seok Oh, Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Dae-jeon University, 1136, Dunsan-dong, Seo-gu, Daejeon 302-869, Korea

TEL (042) 470-9424 FAX (042) 470-9005 E-mail [email protected]

Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives This study intends to clarify how Leejung-tang (here in after reffered to LJT) affect Wistar Rat whose osteoarthritis was induced by MIA.

Methods Osteoarthritis was induced into rat by injecting MIA in its knee joint. Rats are divided into a total of 4 groups (n=6). Normal group are not treated at all without inducing osteoarthritis whereas control group were induced for osteoarthritis by MIA and oral medi- cated with 2 ml of physiological saline per day. Positive comparison group (Indomethacin) was injected with MIA and after 7 days, 2 mg/kg of Indomethacin was medicated.

Experimental group (LJT) was injected with MIA and after 7 days that was medicated with 23 mg/kg of LJT. Indomethacin and LJT were oral medicated for each substance a total of 4 weeks with one time per day. After experiments (from 1 week after injection of MIA to 4 weeks elapsed), Hind paw weight bearing ability, Functions of liver and kidney, Serum prostaglandin E

, TNF-α, IL-1β, IL-6, Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB

and amount of cartilage were measured and histopathological variations for knee joint structures were observed.

Results 1) Hind paw weight bearing ability of LJT administration group was increased but there was no statistical significance. 2) Functions of liver and kidney were not affected. 3) Serum prostaglandin E

, IL-1β, Osteocalcin, MMP-9 were significantly decreased and TNF-α, IL-6, TIMP-1, LTB

were also decreased but there were no statistical significance.

4) In H&E staining and Safranin-O staining, there were small histopathological changes in LJT administration group than control group. 5) In micro CT (computed tomography)-ar- thrography, cartilage destruction was more suppressed in LJT administration group than control group.

Conclusions Based on all results mentioned above, Leejung-tang (LJT) is believed to be meaningful for suppressing the progress of osteoarthritis and its treatments because of its anti-inflammatory effects and alleviation of pain with histopathological effective efficacy. (J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45)

Key words Leejung-tang (LJT), Osteoarthritis, MIA-induced osteoarthritis, Cytokine, Indomethacin

서론»»»

골관절염은 성인에서 가장 흔한 관절 질환으로 퇴행성

관절염 또는 퇴행성 관절질환이라고도 불리운다. 주로 체

중부하 관절을 많이 침범하여 관절 연골의 국소적인 퇴행

성 변화, 연골하골의 비대, 주변 골연골부의 과잉 골형성,

Name of herb Pharmacognostic name Amount (g)

人蔘 Ginseng Radix 6

白朮 Atractylodis Rhizoma White 6

乾薑 Zingiberis Rhizoma 6

甘草 Glycyrrhizae Radix 6

Total amount 24

Table I. The Prescription of Leejung-tang (LJT) 관절의 변형 등을 특징으로 하며 임상적으로는 반복적인

동통, 관절 강직감 및 점진적인 운동 장애 등을 초래한다 ¹⁾ . 골관절염의 병인적 요인에 근거하여 질환의 경과를 바 꿀 수 있는 다양한 약물들이 소개되고 있지만 아직 뚜렷 한 효과를 보이는 약물은 없는 실정이며 ²⁾ , 만성적이고 진 행성인 질환의 특성상 ³⁾ 더욱 효과적인 치료 방법이 요구 되고 있다.

한의학에서의 골관절염은 關節痺證에 속하며, 인체에 風·寒·濕의 邪氣가 침범하여 유발되는데 關節酸楚, 疼 痛, 重着, 腫大 그리고 활동장애를 주요 특징으로 한다.

치료법은 氣血宣通이며, 風寒濕痺는 辛溫한 약으로 陽氣 를 고조시켜 邪氣를 축출하고, 風熱濕痺는 散風淸熱祛濕 시키며, 虛하고 久痺한 者는 溫通溫散하거나 滋陰하도록 한다 ¹⁾ .

한의학계에서도 monosodium iodoacetate, papain, collagenase, carrageenan 등을 투여하여 유발된 관절염 동물 모델에 한약 ^4-10) , 침구 ^11,12) 및 약침 ^13,14) 을 활용하여 항염 및 진통 효과를 실험적으로 입증한 연구들이 많이 발표되고 있다.

理中湯은 漢代 張仲景이 저술한 ｢傷寒論·辨癨亂病脈 證幷治｣ ¹⁵⁾ 에 理中丸으로 처음으로 기재된 처방으로 “治 心下痞鞕 小便不利 或急痛 或胸中痺者” ¹⁶⁾ 라 하여 裏가 虛하고 冷하며 水가 있는 虛寒症을 다스리는 처방이다 ¹⁷⁾ . 따라서 노령화에 따라 유병률이 높아지는 골관절염의 특 성상 正氣가 부족하고 虛寒해진 상태 ¹⁾ 에서 발병한 골관 절염에 대한 치료효과가 기대되나 현재까지 이에 관한 연 구는 거의 없는 실정이다.

이에 저자는 골관절염에 대한 理中湯의 효과를 규명하 고자 RAW 264.7 세포를 이용하여 염증 사이토카인에 미 치는 영향을 측정하였고, monosodium iodoacetate (이하 MIA)로 유발된 골관절염 rat 모델을 이용하여 뒷발 체중 부하, 간·신장기능, 염증 사이토카인, osteocalcin, pros- taglandin E 2 , TIMP-1, MMP-9, LTB 4 및 활막조직관절의 병리조직학적 변화에 미치는 영향 등을 측정한 결과 유의 성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 세포

실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 구입하였다.

2) 약재

본 실험에 사용한 理中湯 ( Leejung-tang 이하 LJT)의 구성 약재들은 대전대학교 둔산한방병원에서 구입하여 정선 후 사용하였고, 그 내용과 분량(1첩)은 ｢傷寒論｣ ¹⁵⁾ 에 근거하였다(Table I).

3) 동물

실험에 사용한 동물은 수컷 6주령의 Wistar Rat (170~200 g)로 (주)오리엔트바이오(Seong-nam, Korea)에 서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(5L79, 오 리엔트바이오, Seong-nam, Korea)를 충분히 공급하고 온 도 22±2 ^o C, 습도 55±15%, 12시간 명암주기(light-dark cycle)의 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였 다. 본 실험은 대전대 동물실험윤리위원회의 승인(승인번 호-DJUARB2012-011)을 받아 동물윤리준칙에 의거하였다.

4) 시약

Lipopolysaccharide (LPS), dimethylsulfoxide (DMSO),

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)는 Sigma-Aldrich

사(st. Louis, MO, USA)에서, Dulbecco’s Modified

Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS),

Penicillin 및 Streptomycin은 Hyclone사(Logan, Ut,

USA)에서, Cell viability assay kit은 Daeillab sevice사

(Seoul, Korea)에서, Nitric Oxide detection kit은 Intron

Biotechnology사(Suwon, Korea)에서 구입하였다. Cyto- kine Milliplex Map Immunoassay kit은 Millipore사(Bell- erica, MA, USA)에서, HPLC 분석에 이용된 water와 ace- tonitrile은 Ducksan사(Ansan, Korea)에서, Rat Total MMP-9 kit, LTB 4 Kit, Rat TIMP-1 Kit, Rat IL-6 Kit, Rat TNF-α Kit, Prostaglandin E 2 Kit, Rat IL-1β Kit은 R&D System사(Minneapolis, USA), 주정 추출에 이용된 주정 은 (주)대한주정판매(Jeon-joo, Korea)에서 구입하였다.

양성대조군에는 Indomethacin (Sigma사, USA), 골관절염 유발 주사제로는 Monosodium iodoacetate (MIA) (Sigma.

Chemical사, Cat. No. I2512, USA), 마취제로는 Zoletil (Virbae사, France) Rompun (바이엘코리아, Seoul, Korea) 을 사용하였다. Hematoxylin and Eosin 염색과 Safranin-O 염색에는 Hematoxylin (Merck사, Germany), Eosin Y (Wako사, Japan), Safranin-O (Merck사, Germany)를 사 용하였다.

5) 기기

본 실험에 사용된 기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer (Ilshin, Korea), ELISA reader (Molecular Devices, USA), Luminex (Millipore, USA), HPLC (Shimadzu LC-20AD, Japan), HPLC column (ACE 5 C18, 250×4.6 mm, 5μm), Flow cytometry sys- tem (BD Biosciences immunocytometry systems, USA), Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, USA), BD Ultra-Fine ll (Becton, Dickinson and Com- pany, USA), Light Microscope (Carl ZEISS AXIOSKOP-40, Germany), μ CT arthrography (SKYSCAN, Optoscan, Belgium)를 이용하였다.

2. 방법

1) 시료 추출

LJT 한 첩을 분말한 후 0.8 L의 70% 주정에 24시간 침 지 후 여과하여, 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압, 추출하여 동결 건조하였으며 추출 수율에 따른 한 첩 분량은 2.76 g이었다.

2) 관절염유발 및 실험군의 분류

마취제(Zoletil 0.5 ml＋Rompun 0.1 ml)로 rat을 마취

시킨 후 왼쪽 무릎 주변을 깨끗이 제모하고 골관절염 유 발물질인 MIA (Sigma. Chemical Co. Ltd, Cat. No.I2512) 를 인슐린주사기(1 ml, 0.28 mm (31G)×8 mm)를 사용 하여 왼쪽 무릎 관절강 내에 50μl (60 mg/ml)씩 투여하 였다. MIA 희석시에는 0.9% Saline을 사용하였다. MIA 투여 7일 후에 관절염 유발 유무를 확인하여 관절염이 유 발된 동물만을 대조군, 양성대조군(Indomethacin 투여 군), 실험군(LJT 투여군)으로 나누었으며 MIA를 투여하지 않은 정상군을 포함한 각 군당 Rat은 6마리씩 사용하였 다.

3) 약물 투여

Wistar Rat에 MIA를 주사하여 관절염을 유발시킨 후, 일주일이 경과된 이후부터 매일 오전 10시에 양성대조군 에는 Indomethacin (Sigma. Chemical Co. Ltd, USA)을 2 mg/kg/rat, LJT 투여군에는 LJT를 23 mg/kg/rat로 4주 동 안 경구투여 하였으며, 대조군에는 생리식염수를 2 mg/kg 씩 투여하였다. 정상군은 자유식이 하였다.

4) 뒷발 체중부하 측정

뒷발 체중부하는 Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, USA)를 이용하여, 플라스틱 방에 비 스듬히(기울기 60 ^o ) 세운 후 각 뒷발에 가해진 세기를 10 초에 걸쳐 평균산출 하였다. 처치된 동측의 뒷발에 분포 된 체중의 백분율은 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산 하였다.

백분율(%)=(유발된 하지의 무게/정상 하지의 무게)

×100 5) 혈액분석

최종 실험 종료 후 튜브형 주사기를 이용하여 심장에 서 채혈하였다. 전혈을 바이오톡스텍(주)(청주, 한국)에 의뢰하여 AST, ALT, BUN, Creatinine을 측정하였다.

6) 혈청 내 염증관련 매개인자 측정 (1) Prostaglandin E 2 (PGE 2 )

Calibrator Diluent RD5-56을 비특이적 결합(non-spe-

cific binging)을 한 well에 200μl, zero standard well에

150μl 넣고 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조

군, LJT투여군)을 150μl씩 넣었다. NSB well을 제외한 나머지 well에 Primary Antibody Solution을 50μl 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤 PGE 2 conjugate를 50 μl 넣고 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 수세 용액 (400μl)으로 4회 wash한 뒤 Substrate Solution을 200μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 마 지막으로 Stop solution을 100μl 넣고 microplate reader 로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(2) Tumor necrosis factor-α (TNF-α)

Diluent RD1-41을 50μl 넣은 후에 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군)을 50μl씩 넣 고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 5회 wash한 뒤 TNF-α conjugate를 100μl 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고 빛을 차단 한 뒤 30분 동안 실온에서 배양하였다. Stop solution을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(3) Interlukin-1β (IL-1β)

Diluent RD1-21을 50μl 넣은 후에 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군)을 50μl씩 넣 고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 5회 wash한 뒤 IL-1 β conjugate를 100μl 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하 였다. Substrate Solution을 100μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 배양하였다. Stop solution을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(4) Interlukin-6 (IL-6)

Diluent RD1-54를 50μl 넣은 후에 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군)을 50μl씩 넣 고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 5회 wash한 뒤 IL-6 conjugate를 100μl 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하였 다. Substrate Solution을 100μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30 분 동안 실온에서 배양하였다. Stop solution을 100μl 넣 고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(5) Osteocalcin

Biotinylated Osteocalcin을 각 well에 100μl씩 넣고 실온(18~22 ^o C)에서 30±5분 동안 배양하였다. 수세 용액 (400μl)으로 5회 wash한 뒤 Primary Antibody와 Primary Incubation Buffer를 1:100 비율로 혼합하여 각 well에 150μl씩 넣고, Standards (CAL0-5), sample (정상 군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군)을 각각 20μl씩 넣 은 후 커버를 닫고 실온에서 microplate shaker (300

rpm)로 60±5분 혼합하였다. 5회 wash 후, Secondary Antibody를 각 100μl씩 넣고 microplate shaker (300 rpm)로 60±5분 혼합하였다. 다시 5회 wash 후, Substrate Solution를 각 100μl씩 넣고 빛을 차단한 상태로 micro- plate shaker (300 rpm)로 15±2분 혼합하였다. Stop sol- ution을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로 측정 하였다.

(6) Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) Assay Diluent RD1-21을 각 well 50μl씩 넣고 Stan- dard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군) 을 50μl씩 넣고 1분 동안 가볍게 두드려 혼합한 후 커버 를 닫고, 실온(18~22 ^o C)에서 2시간 배양하였다. 5회 wash 후 Rat TIMP-1 Conjugate 100μl를 각 Well에 넣고 실온에서 2시간 배양 하였다. 다시 5회 wash 후 Sub- strate Solution 100μl씩 넣고 빛을 차단한 상태로 실온 에서 30분 배양하였다. Stop Solution 100μl씩 넣고 잘 혼합한 후 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(7) Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)

Assay Diluent RD1-34를 각 well 50μl씩 넣고 Stan- dard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군) 을 50μl씩 넣고 1분 동안 가볍게 두드려 혼합한 후 커버 를 닫고, 실온(18~22 ^o C)에서 2시간 배양하였다. 5회 wash 후 Rat MMP-9 Conjugate 100μl를 각 Well에 넣고 실온에서 2시간 배양하였다. 다시 5회 wash 후 Substrate Solution 100μl씩 넣고 빛을 차단한 상태로 실온에서 30 분 배양하였다. Stop Solution 100μl씩 넣고 잘 혼합한 후 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(8) Leukotriene B 4 (LTB 4 )

Calibrator Diluent RD5-52를 비특이적 결합(non-spe-

cific binging)을 한 well에 100μl, zero standard well에

50μl 넣고, standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조

군, LJT 투여군)을 50μl씩 넣었다. NSB well을 제외한

나머지 well에 Primary Antibody Solution을 50μl 넣고

커버를 닫은 후 microplate shaker (500±50 rpm)로

60±5분 동안 실온(18~22 ^o C)에서 반응시킨 뒤 LTB 4 -

conjugate를 50 μl 넣고 microplate shaker (500±50

rpm)로 180±5분 동안 실온에서 반응시켰다. 수세 용액

(400μl)으로 4회 wash한 뒤 Substrate Solution을 200μl

넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 반응하게 한 후

마지막으로 Stop solution을 100μl 넣고 microplate

Fig. 1. Image of cartilage degeneration using micro CT-ar- thrography in joint tissue of MIA-induced rat osteoarthritis.

Fig. 2. Effects of LJT on weight changes in the hind paw of MIA-induced osteoarthritis rat.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (**p＜0.05).

reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

7) 병리조직학적 검사

Micro-CT (SKYSCAN, Belgium)촬영이 끝난 후 무릎 부위를 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% 포르말린 용 액에 넣어 관절 조직을 탈칼슘화 시켰다. Radiographic technique을 이용하여 decalcification 유무를 확인한 후 파라핀 왁스에 관절 조직을 넣고 고정한 다음 coronal section을 실시하였다. 탈칼슘화 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조직을 7μm의 크기로 자른 뒤, hematoxylin and eosin (H&E) 및 safranin-O 염색을 실시하여 조직의 상태를 관찰하였다. 염증 반응 발생 유무나 활막세포의 증식, 염증세포의 조직 침윤 여부는 H&E 염색 결과에서 확인할 수 있으며, proteoglycan 층을 염색하는 Safranin-O 염색 결과에서는 연골 조직의 손상 여부를 확인하였다.

8) Micro CT-arthrograpy 검사

Micor CT 측정은 조영제인 HEXABRICS 320 (Guerbet, France)를 무릎관절에 주사 후 micro CT-arthrograpy를 사용하여 무릎관절 연골파괴정도를 분석하기 위해 연골 량(cartilage volumne)을 Fig. 1과 같이 측정하였다.

3. 통계처리

실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student’s t-test를 사용하여 통계처리 하였으며, p＜0.05 수준에서 유의성 을 검정하였다.

결과»»»

1. 뒷발 체중부하에 미치는 영향

Hind paw weight bearing 측정 결과, 정상군은 166.9±

2.3%, 대조군은 100±11.2%, 양성대조군은 164.1± 4.7%, LJT 투여군은 111.6±9.9%로 나타나 대조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 2).

2. 간 기능에 미치는 영향

간 기능 측정의 지표 성분인 ALT는 정상군이 32.0±1.7 (U/L), 대조군이 33.7±1.2 (U/L), 양성대조군이 37.7±4.2 (U/L), LJT 투여군이 39.0±4.6 (U/L)로 나타났고, AST는 정상군이 130.0±8.7 (U/L), 대조군이 162.7±7.1 (U/L), 양성대조군이 160.0±15.1 (U/L), LJT 투여군이 172.7±

38.2 (U/L)로 나타나 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 3).

3. 신 기능에 미치는 영향

혈청 중의 BUN 농도를 측정한 결과, 정상군이 15.30±

0.89 mg/dl, 대조군이 18.10±1.45 mg/dl, 양성대조군이

18.90±2.03 mg/dl, LJT 투여군이 16.97±3.97 mg/dl로

4A 4B

Fig. 4. Effect of LJT on the BUN and creatinine in MIA-induced osteoarthritis rat.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD.

Fig. 5. Effects of LJT on levels of Prostaglandin E

in the se- rum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of Prostaglandin E

were determined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05, ***p＜0.001).

0 50 100 150 200 250

Normal Control Indomethacin LJT

A LT & A ST le ve l in s er um ( U /L)

AST ALT

Fig. 3. Effect of LJT on the ALT and AST in MIA-induced os- teoarthritis rat.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD.

나타났고(Fig. 4A), 혈청 중의 creatinine 농도는 정상군이 0.530±0.020 mg/dl, 대조군이 0.547±0.015 mg/dl, 양 성대조군이 0.583±0.012 mg/dl, LJT 투여군이 0.587±

0.025 mg/dl로 나타나 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 4B).

4. 혈청 내 염증관련 매개인자 측정

1) Prostaglandin E 2 생성량

혈청 내의 Prostaglandin E 2 생성량은 대조군의 생성량 을 100.0±13.2%로 나타냈을 때, 정상군이 24.7±4.9%,

양성대조군이 42.2±9.5%, LJT 투여군이 52.8±24.3%로 대조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는(p＜0.05) 감 소를 나타내었다(Fig. 5).

2) TNF-α 생성량

혈청 내의 TNF-α 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

6.4%로 나타냈을 때, 정상군이 82.8±18.5%, 양성대조군

Fig. 8. Effects of LJT on levels of IL-6 in the serum of MIA-in- duced osteoarthritis rat. The levels of IL-6 were determined us- ing a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05).

Fig. 7. Effects of LJT on levels of IL-1β in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of IL-1β were de- termined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

Fig. 6. Effects of LJT on levels of TNF-α in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of TNF-α were de- termined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05).

이 85.0±9.0%, LJT 투여군이 84.8±14.0%로 대조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 6).

3) IL-1β 생성량

혈청 내의 IL-1β 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

1.3%로 나타냈을 때, 정상군이 67.8±3.6%, 양성대조군 이 80.2±4.1%, LJT 투여군이 81.7±5.7%로 대조군에 비 해 LJT 투여군에서 유의성 있는(p＜0.001) 감소를 나타내 었다(Fig. 7).

4) IL-6 생성량

혈청 내의 IL-6 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

14.5%로 나타냈을 때, 정상군이 77.2±11.4%, 양성대조군 이 78.5±11.1%, LJT 투여군이 85.4±17.9%로 대조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 8).

5) Osteocalcin 생성량

혈청 내의 Osteocalcin 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±12.0%로 나타냈을 때, 정상군이 41.2±3.0%, 양 성대조군이 60.1±4.1%, LJT 투여군이 57.9±5.8%로 대 조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는(p＜0.001) 감소 를 나타내었다(Fig. 9).

6) TIMP-1 생성량

혈청 내의 TIMP-1 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

1.1%로 나타냈을 때, 정상군이 54.4±3.9%, 양성대조군이

Fig. 9. Effects of LJT on levels of Osteocalcin in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of Osteocalcin were determined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

Fig. 11. Effects of LJT on levels of MMP-9 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats. The levels of MMP-9 were de- termined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

Fig. 10. Effects of LJT on levels of TIMP-1 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of TIMP-1 were de- termined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

72.0±4.2%, LJT 투여군이 91.2±14.8%로 대조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 10).

7) MMP-9 생성량

혈청 내의 MMP-9 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

0.0%로 나타냈을 때, 정상군이 50.0±4.1%, 양성대조군 이 64.6±1.0%, LJT 투여군이 79.1±3.3%로 대조군에 비 해 LJT 투여군이 유의성 있는(p＜0.001) 감소를 나타내었 다(Fig. 11).

8) LTB 4 생성량

혈청 내의 LTB 4 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

12.3%로 나타냈을 때, 정상군이 67.4±10.2%, 양성대조 군이 69.8±6.5%, LJT 투여군이 83.4±6.7%로 대조군에 비해 LJT 투여군에서 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 12).

4. 병리조직학적 변화에 미치는 영향

1) Hematoxylin & Eosin 염색

조직 염색 결과 정상군의 관절은 활막 조직이 정상적 으로 위치한 반면, 대조군은 연골과 뼈의 침하로 관절 조

직에 손실이 일어난 것으로 나타났다. LJT 투여군은 관절

주변에 대조군에서 관찰된 대식세포, 과립구세포, 단핵구

세포의 과다 침투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 상대적

Fig. 13. Effects of LJT on the joint pathology (Hematoxylin &

Eosin staining) from joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats (×100).

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Fig. 14. Effects of LJT on joint pathology (Safranin-O staining) from joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats (× 100).

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Fig. 12. Effects of LJT on levels of LTB

in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats. The levels of LTB

were de- termined using a ELISA system.

Normal: normal Wistar rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

으로 감소하였다(Fig. 13).

2) Safranin-O 염색

조직 염색 결과 정상군의 관절은 연골조직이 정상적으 로 위치하였다. 대조군은 관절 주변에 염증세포의 침투가 일어나 빨간색으로 염색된 정상 조직이 MIA로 연골의 파 괴가 나타나 사라진 것을 관찰할 수 있었다. LJT 투여군 은 연골의 파괴 정도가 대조군에 비해 빨간색 염색 조직 이 활막 주변에 많이 분포하는 것으로 나타났다(Fig. 14).

5. 연골량에 미치는 영향

연골량(cartilage volume)을 측정한 결과(Fig. 15), 정 상군이 4.64 mm ³ , 대조군이 1.15 mm ³ , 양성대조군이 3.70 mm ³ , LJT 투여군이 1.95 mm ³ 로 대조군에 비하여 LJT 투 여군에서 연골량 파괴가 억제되었다(Fig. 15, 16).

고찰»»»

골관절염은 가장 흔한 관절 질환으로서 관절 구조의

변형, 유전적 요인, 연골에 가해지는 물리적 압력, 연골세

포의 대사변화 및 관절강내 생화학적 변화 등이 공통으로

관련되어 초래되는 질환으로 인식된다 ¹⁸⁾ . 골관절염의 주

된 증상은 관절주위의 통증이며, 경도의 관절종창, 관절

경직, 관절의 마찰음, 운동 범위의 감소 등의 증상을 나타

0 1 2 3 4 5

Normal Control Indomethacin LJT

C art ila ge v ol um e( m m

)

Fig. 16. Effects of LJT on cartilage volume using micro CT-ar- thrography in joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteo- arthritis rat group treated with LJT.

Fig. 15. Imaging of cartilage degeneration using micro CT-ar- thrography in joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats.

내고, 노인에서 흔히 신체장애를 초래하게 된다 ^19-21) . 골관 절염은 원발성과 이차성으로 나눌 수 있으며, 원발성은 다발성 퇴행성 관절염으로 특히 체중 부하되는 관절에 많 이 발생하는데 50세 이상 비만한 환자에서 많이 발생하는 것으로 알려져 있다 ¹⁾ .

2011년 통계청 조사 ²²⁾ 에 따르면, 우리나라 65세 이상 고령인구는 2010년 545만명으로 16개 시·도 전체가 고 령화 사회로 진입하였고, 2030년에는 2.3배, 2060년에 3.3배 증가하는 것으로 나타났다. 2009년도 국민건강영양 조사 ²³⁾ 에서 골관절염 환자는 만 50세 이상에서 여자 32.5%, 남자 14.7%로 여자가 월등히 높았고, 특히 노령 화될수록 유병률도 높아져 65세 이상은 37.8%로 보고되 었다 ³⁾ .

한의학에서 골관절염은 痺證의 범주에 속한다고 볼 수 있으며 ²⁴⁾ , 인체의 營衛失調, 腠理空疎, 正氣虛弱시 風寒濕 熱의 邪氣가 체내에 침입하여 관절에 응체됨으로써 발생 한다 ¹⁾ . 즉 痺證은 正氣不足이 발병의 내재적 소인이고 風, 寒, 濕의 感受가 外因이 되며 ²⁵⁾ , 이로 인하여 經絡이 阻滯되고 氣血運行이 不暢하여 肌肉, 筋骨, 關節에 痠痛, 痲木, 重着, 屈伸不利를 야기하거나, 심하면 關節腫大灼熱 등을 나타낸다 ²⁴⁾ . ｢黃帝內經·素問｣ ²⁶⁾ 痺論에서 “風寒濕 三氣雜之, 合而爲痺也”라 하여 痺證은 風寒濕에 의하여 발생한다고 하였으며 行痺, 痛痺, 着痺, 肝心脾肺腎의 五

臟痺, 筋脈肌皮骨의 五痺에 대해 언급하였다. 漢代 張仲 景은 ｢傷寒論｣ ²⁷⁾ 太陽病脈證幷治篇과 ｢金匱 ^要 略｣ ²⁸⁾ 痙濕 暍病脈證幷治篇, 中風歷節病脈證幷治篇에서 太陽風濕, 濕 痺, 歷節病을 언급하며 그 증상으로 “歷節痛 不可屈伸”,

“其痛如掣”, “諸肢節疼痛 身體魁 脚腫如脫”하다고 기술하 였다.

痺證의 치료원칙은 風寒濕의 邪氣에 의한 경우에는 邪 氣의 輕重에 따라 淸熱, 祛風, 散風, 除濕, 活血을 하고, 虛弱한 경우에는 調補氣血, 補腎助陽, 滋陰養肝한다 ²⁴⁾ .

골관절염의 병태 생리는 여러 주장과 가설이 있을 수

있는데 크게 두 가지로 살펴 볼 수 있다. 첫째, 연골기질

(cartilage matrix)의 손상과 변화, 둘째 조직의 손상에 대

한 연골세포의 감소로 나누어진다. 첫째는 여러 기계적인

자극이나, 염증으로 인한 효소 반응, 대사의 변화 등으로

시작되며, 기질고분자(matrix macromolecule)의 격자가

파괴되고, 수분 함량의 변화가 일어난다. 둘째는 연골세

포가 조직손상이나 변화를 감지하면서 시작되는데 동화

작용 및 이화작용이 모두 증가된다. 이는 주로 IL-1과 종

양괴사 인자인 TNF-α와 같은 cytokine에 의해 이뤄지는

파괴와 재형성과정이다 ^29,30) . 관절연골의 손상은 여러 기

계적인 자극이나, 염증으로 인한 효소반응, 대사의 변화

등으로 시작되며, proteoglycan의 감소 및 glycosamino-

glycan chain의 길이가 감소함으로써 수분 보유능력이 감

소하여 추가 손상에 매우 약한 상태가 된다. 이후 연골

세포는 조직 손상이나 변화를 감지하면서 동화작용 및 이

화작용이 증가하는데, 이 때 IL-1, TNF-α는 연골기질을

파괴하는 이화작용에 관여하는 효소로 작용을 하고, NO

가 연골에 작용하는 부하와 함께 MMPs의 분비를 촉진시 키고 기질의 변화와 세포 사멸을 가져오는 반면, IL-6, 성 장인자, 인슐린, IGF-1, bFGF, TGF-β 등은 기질고분자 의 생성을 촉진하고 연골세포의 증식을 자극하여 동화작 용에 관여한다. 이 단계에서 동화 및 치유과정은 이화작 용에 반하여 수년간 지속될 수 있으나 치유와 재형성 과 정이 실패함으로써 점진적인 관절연골의 소실 및 연골세 포 사멸에 의하여 골관절염의 진행이 촉진된다 ¹⁹⁾ .

서양의학에서의 골관절염의 일반적인 치료는 적당한 휴식과 운동, 약물요법, 관절에 대한 국소 치료 등의 보존 적 치료와 보존적 치료에 반응하지 않거나 관절의 변화가 진행하는 경우에는 수술적 방법을 시행하게 된다 ¹⁹⁾ . 그러 나 서양의학에서 골관절염 초기에 쓰는 약물 중 아세트아 미노펜은 단순한 진통효과만 있어 골관절염의 진행을 억 제하는 효과는 미미하고, 비스테로이드성 소염제는 장기 간 사용 시 위장관 질환과 신장기능 저하를 야기할 수 있

으며 ^31,32) , 특이적 COX-2 억제제는 심혈관계통의 부작용

으로 사용이 제한적이어서 보다 안전하고 효과적인 치료 제가 필요한 실정이다 ³³⁾ . 그러므로 적극적인 증상의 호전 및 연골의 보호와 재생효과를 목표로 한 천연물을 이용한 개발이 필요한 시점이라고 생각된다.

이번 연구에 사용된 理中湯은 漢代 張仲景의 ｢傷寒論｣ ¹⁵⁾ 에 기재되어 있는 처방으로 人蔘, 乾薑, 白朮, 甘草로 구 성되어 있으며, 溫中祛寒하고 補氣健脾하는 효능 ³⁴⁾ 이 있 다. 人蔘은 ｢藥徵｣ ³⁵⁾ 에서 “主治 心下痞堅 痞鞕 支結也.

旁治 不食 嘔吐 喜唾 心痛 腹痛 煩悸”라 하였고 강 등 ³⁶⁾ 은 人蔘 뇌두 butanol 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 관절염 유발 시 생기는 부종이나 발적을 감소시킨다고 하였다. 정 ³⁷⁾ 은 人蔘의 saponin 추출물은 TNF-α, IL-1β 등 염증관련물질의 혈중농도를 감소시켜 collagen-induced arthritis (CIA) mouse model에서 관절 염 개선 효과가 있다고 하였으며, 최 ³⁸⁾ 는 人蔘이 항산화 작용을 갖고 있어 노화의 예방과 치료를 겸한 노화 억제 생약으로서 가치가 있다고 하였다. 乾薑은 ｢藥徵｣ ³⁵⁾ 에서

“主治 結滯水毒也. 旁治 嘔吐 咳 下利 厥冷 煩躁 腹痛 胸 痛 ^腰 痛”이라 하였고, 溫中逐寒, 回陽通脈, 治風寒濕痺 ³⁹⁾ 의 효능이 있어 류마티스성 관절염, 신경통 등에 사용한 다고 하였다 ⁴⁰⁾ . 유 ⁴¹⁾ 는 乾薑의 주요 성분 중 gingerol 관 련 화합물들이 항산화 및 진통 억제 효과가 있다고 보고 하였다. 白朮은 ｢藥徵｣ ³⁵⁾ 에서 “主利水也. 故能治小便自利

不利 旁治 身煩疼 痰飮 失精 眩冒 下利 喜唾”라 하였으 며, 최 ⁴²⁾ 는 현저한 NO, free radical scavenging activity와 lipid peroxidation의 억제기능을 가지고 있으며, NO의 생성과 그 생성효소인 iNOS 양도 현저히 억제함으로써 생체에서 각종 inflammation과 oxidative stress에 대한 억제적인 효과를 유도할 가능성을 제시하고 있다고 보고 하였다. 김 등 ⁴³⁾ 은 白朮의 ethanol 추출물이 collagen-in- duced arthritis (CIA) mouse에서 관절염으로 인한 손상 을 억제하는 효과가 있다고 하였다.

甘草는 ｢藥徵｣ ³⁵⁾ 에서 “主治 急迫也. 故治 裏急 急痛 攣 急, 而旁治 厥冷 煩躁 衝逆之等 諸般急迫之毒也”라 하여 和中緩急, 潤肺, 解毒 ³⁹⁾ 의 효능을 가지고 있으며, 甘草에 서 분리한 18α-glycyrrhetinic acid가 당질 코르티코이드 와 유사한 항염증성 작용을 나타낸다는 보고 ⁴⁴⁾ 가 있다.

한의학에서는 골관절염에 해당하는 痺病의 치료에 加 味羌活湯, 大羌活湯, 香蘇散, 獨活寄生湯, 蠲痺湯, 附子湯, 活絡湯, 防己黃芪湯, 烏藥順氣散, 疎風活血湯, 靈仙除痛飮 등 ¹⁾ 의 辛溫解表, 活血祛瘀, 祛風寒濕시키는 처방을 주로 사용하여 왔으며, 상대적으로 溫裏劑, 補益劑에 대한 연 구는 부족한 실정이다. 저자는 연령이 증가함에 따라 유 병률도 높아지는 골관절염의 특성상, 溫中祛寒劑인 理中 湯이 正氣가 不足하여 虛寒한 상태인 노인의 신진대사 작 용을 향상시키고 아울러 혈액순환을 개선시킬 수 있어 적 합할 것으로 생각하였다. 이에 본 연구에서는 항염증 및 진통효과가 있는 약물을 포함하고 있는 理中湯이 골관절 염에 미치는 치료 효과를 규명하고자 하였다.

MIA (Monosodium iodoacetate)로 유도된 골관절염 rat 모델을 이용하여 理中湯의 골관절염 치료 효능을 분 석하였다. 본 연구에 사용된 MIA는 관절강 내에 주입시 관절연골세포에서 진행되는 해당과정의 glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase 활성을 억제하여 관절연골 의 대사과정을 저해시키고, 관절연골의 변성을 일으켜 골 관절염을 유발시키는 물질로, 쥐를 대상으로 한 골관절염 유발 실험에서 관절연골의 손상, 관절의 기능장애, 통증 등의 양상이 사람의 골관절염과 매우 유사하다고 보고되

었으며 ^45-47) , 용량의 조절을 통해 골관절염의 정도를 조절

할 수 있다 ⁴⁸⁾ . MIA로 유도된 골관절염을 대상으로 한 한

의학계의 최근 연구들을 살펴보면 한약에서는 加減小續

命湯 ⁴⁾ , 附子湯 ⁴⁹⁾ , 疎風活血湯 ⁵⁰⁾ , 二妙散 ⁵¹⁾ , 加味消炎湯 ⁵²⁾

등이 있었으나 정상군, 대조군, 실험군으로만 나누어 비

교하였고 양성대조군을 설정하지 않았다. 약침의 효과를 연구한 김 등 ¹³⁾ 의 논문에서도 정상군, 대조군, 실험군으 로만 나누었으며 혈청내 인자 중 PGE2, COX-1, COX-2만 측정하였다는 한계가 있었다.

본 연구에서 양성대조군으로 사용된 indomethacin은 미국의 Merk Sharp & Dohme사의 Sharett 등 ⁵³⁾ 이 합성한 350종의 indole 화합물을 Winte 등 ⁵⁴⁾ 이 1963년에 screen- ing하여서 발견하였으며 소염, 진통작용이 강력하여 세계 각지의 임상시험에서 rheumatism 질환에 효력이 인정되 어 제품화 되었다.

본 연구에서는 간·신장 기능에 미치는 영향, 뒷발 체 중부하에 미치는 영향, 염증성 지표로서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 염증 사이토카인에 미치는 영향, prostaglandin E2, TIMP-1, MMP-9, LTB4 등의 염증성 매개인자에 미치 는 영향, 연골 및 활막 조직의 조직학적 변화 등을 비 교·분석하였다.

뒷발 체중부하에 미치는 영향을 알아보기 위해 weight bearing ability를 측정한 결과 대조군에 비해 LJT 투여군 에서 증가를 보였으나 유의하지는 않았다(Fig. 2).

간기능과 신기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청 중의 ALT, AST, BUN, creatinine 농도를 측정한 결과 간 과 신장 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (Fig. 3, 4).

Prostaglandin E2는 여러 질환에서 염증, 신장 혈류량 과 기능유지, 신체의 평형 유지 등에 매우 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있다 ⁵⁵⁾ . 이는 cyclooxygenase의 활성 화에 따른 산물로서 염증질환, 자가 면역 질환 등에 중요 한 역할을 하며, 특히 염증 반응의 중요한 매개 물질로 작용하고 혈관 확장 외에 통증과 발열 반응을 유도한다 ⁵⁶⁾ .

TNF-α와 IL-1β는 골관절염의 진행시 증가하는 대표 적인 cytokine으로 많은 연구에서 골관절염 진행의 지표 로 쓰인다 ^57,58) . TNF-α는 활성화된 단핵구와 대식세포에 의하여 생산되어, 염증의 활성화, 호중구 활성화, 단백질 합성, 세포고사 등을 유발하는 상위 cytokine으로서 ^59,60) , IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 및 MMPs와 같은 하위염증매개물질 의 생성을 유발하여 염증을 증폭시키고 관절연골기질로 부터 prostaglandin 소실율 증가 및 재합성 억제를 통해 관절연골을 손상시키고 골관절염의 진행을 유도한다 ^61,62) . IL-1β는 연골 및 활막세포로부터 prostaglandin E 2 , NO 를 포함한 다른 염증 매개체의 생산과, MMPs의 발현을

자극하여 골관절염에서 연골분해를 일으키는 강력한 cy- tokine으로 알려져 있다 ^63,64) . IL-6은 IL-1과 TNF-α에 의 해 분비가 촉진되는 급성 조절 단백질로 골관절의 염증반 응에 주된 매개 작용을 하여 혈청 및 관절염으로 손상된 관절의 관절 액에서 활성도가 증가하며, 골관절염의 활성 도와 연관성이 있다 ^65,66) . 또한 Katherine 등 ⁶⁷⁾ 은 IL-6이 활액막이나 관절조직의 혈관에서 분비되어 혈청에서보다 관절액에서 더 높은 활성도를 보인다고 하였는데, 이는 IL-6이 골관절염에서 면역반응의 매개체로서 중요한 역할 을 담당함을 알 수 있다.

Osteocalcin은 골단백질의 1%를 차지하며 비교원성 단 백질 중 가장 풍부한 단백질로 1,25 dihydroxy-vitamin D3, vitamin K, vitamin C가 관여하여 골아세포에서 생성 되어 골의 무기질 침착과정에 작용하며 정상 성인에서 새 롭게 형성된 osteocalcin의 1/3이 직접 혈류로 포함된다.

혈중 osteocalcin 대부분이 골아세포에서 새로운 단백질 의 합성시 생성되므로 골아세포의 활성도를 반영한다 ^68-70) . 골아세포의 활성도를 알 수 있는 여러 가지 지표 중에서 임상에서 가장 널리 쓰이는 ALP는 다양한 골질환에서 증 가되며 임상적 유용성에도 불구하고 혈중 농도를 증가시 킬 수 있는 골 질환외에 다른 질환이 존재함으로 인해 제 한적으로 사용되어 왔으며 예민도 및 특이도에서 osteo- calcin이 골대사의 지표로써 더 우수한 것으로 알려져 있 다 ^71,72) .

TIMPs는 MMPs와 1:1로 결합하여 MMPs의 활성화를 억제하며 ⁷³⁾ , MMPs와 TIMPs의 발현의 부조화가 염증성 질환에서 조직의 분해를 일으킨다고 추측된다 ⁷⁴⁾ . MMPs 의 역조절 단백인 TIMPs는 세포외 기질의 항상성을 유지 하는 중요한 인자이며, 이 중 TIMP-1은 MMP-9의 역조절 단백으로서 1:1로 복합체를 이루어 MMP-9의 활성을 저하 시킨다고 알려져 있다 ⁷⁵⁾ .

MMPs는 단백분해효소군으로서 정상적인 생리환경에

서 세포외 기질의 조절된 분해를 담당하는데 그 작용이

조절되지 않고, 과도하게 표현되는 경우에는 세포외 기질

성분을 광범위하게 분해하여 조직의 손상을 초래한다 ⁷⁶⁾ .

MMP-9은 기저막에 포함된 type IV collagen 등의 파괴를

촉진시켜 세포외 기질의 파괴를 동반하는 여러 질환과 암

세포의 침윤 및 전이 등에 밀접히 관련되어 있다 ⁷⁷⁾ .

MMPs는 최소 한가지 이상의 세포외기질을 분해하고, 아

연 이온을 가지며, 킬레이트 약제에 의해 억제되고, 비활

성 전효소의 형태로 합성된 후 단백질 용해에 의해 활성 화되어야 하며, TIMP에 의해 억제되는 특징을 가진다 ⁷⁸⁾ . LTB 4 는 prostaglandin과 마찬가지로 arachidonic acid 에서 5-lipoxygenase에 의해 생합성된다. 감각 과민을 일 으키는 내인성 화학 물질로서 항원을 파괴하는 염증 반응 으로 인하여 축적되는 다핵 중성구에 대한 화학 주성 인 자라고 알려져 있으며 ⁷⁹⁾ , 염증성 반응의 중개자로 작용하 는 많은 물질 중에서 히스타민보다 수백 배 정도로 강력 하게 작용한다고 한다 ⁸⁰⁾ .

본 연구에서 혈청 내 인자에 미치는 영향을 알아보고 자 prostaglandin E 2 , TNF-α, IL-1β, IL-6, osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB 4 의 생성량을 측정한 결과 prosta- glandin E 2 , IL-1β, osteocalcin, MMP-9 항목에서는 LJT 투여군에서 대조군보다 유의한 감소를 보였으며(Fig. 5, 7, 9, 11), TNF-α, IL-6, TIMP-1, LTB 4 항목에서는 LJT 투여군이 대조군에 비하여 감소하였으나 유의하지는 않 았다(Fig. 6, 8, 10, 12).

염증반응 발생 유무나 활막 세포의 증식, 염증세포의 조직침윤 정도 등의 조직학적 변화를 파악하기 위해 무릎 관절조직을 H&E로 염색하여 관찰하였으며, 연골조직의 손상여부를 확인하기 위해 proteoglycan 층을 Safranin-O 로 염색하여 결과를 확인하였다. H&E 염색에서 관절 주 변에 대식세포, 과립구세포, 단핵구 세포의 과다 침투가 일어난 대조군에선 관절 조직의 손실이 일어났으나 LJT 투여군에서는 관절 주변에 대조군에서 관찰된 연골과 뼈 의 침하 등이 상대적으로 감소하였다(Fig. 13).

Safranin-O 염색에서 MIA로 연골의 파괴가 나타난 대 조군에서는 빨간색 염색 조직이 사라졌으며, LJT 투여군 은 빨간색 염색 조직이 활막 주변에 많이 분포하고 있어 대조군과 비교하여 연골의 파괴 정도가 적었다(Fig. 14).

연골파괴에 미치는 영향을 알아보기 위해 micro CT-ar- thrography를 사용하여 무릎 관절의 연골량을 측정하였 으며, 대조군에 비해 LJT 투여군에서 연골량 파괴가 억제 되었다(Fig. 15, 16).

이상의 실험 결과를 종합하면 理中湯은 MIA로 유도된 생쥐의 골관절염 모델에서 혈청 내 염증 매개인자인 prostaglandin E 2 , IL-1β, osteocalcin, MMP-9를 유의하 게 감소시켰고, 관절의 병리조직학적 손실을 억제하였다.

따라서 理中湯은 골관절염의 염증유발인자 및 매개인자 를 억제함으로써 연골 손실에 긍정적인 효과를 보이는 것

으로 사료되며, 향후 임상적인 활용이 기대된다.

결론»»»

理中湯이 골관절염 유발 생쥐에 미치는 영향을 실험적 으로 규명하기 위하여 간·신장 기능, 혈청 내 염증 사이 토카인 생성량, 염증성 매개인자의 생성량, 연골량 및 활 막조직의 병리조직학적 변화 등을 관찰한 결과 다음과 같 은 결론을 얻었다.

1. Hind paw weight bearing ability는 증가하였으나 유의하지는 않았다.

2. 간과 신장 기능에는 독성을 나타내지 않았다.

3. 혈청 내 염증 매개인자인 prostaglandin E 2 , IL-1β, osteocalcin, MMP-9는 유의하게 감소하였고, TNF-α, IL-6, TIMP-1, LTB 4 는 감소하였으나 유의하지는 않았다.

4. 조직의 H&E 염색 결과 염증소견이 감소하였고, Sa- franin-O 염색 결과 활막 주변 연골의 파괴 정도도 감소 하였다.

5. 무릎 관절의 연골량을 micro CT-arthrography를 사 용하여 측정한 결과, 연골량 파괴가 억제되었다.

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