임앙병리검따고I악외 "1 : 며133뀐 머12오， 200-216, 2001.
사염화탄소 유도 간섬유증 발생에 었어서 비만세포와 근섬유모세포의 상호 관련성
원광보건대학 임상병리과 제갈승주
The Relevance of Mast Cell and Myofibroblast in the Development of Rat Hepatic Fibrosis Induced by Carbon
Tetrachloride
Je뼈1， Sellllg J，∞
Department of Clinical Pathology, W onkwang H ealth Science College, Iksan, Korea
Hepatic fibrosis is known to be developed by producing the extracellular matrices from myofibroblasts(a-SMA postive cells) that are transformed from hepatic satellite cells. The development of the fibrotic process is thought to be mediate by various fibrogenic mediators. Recent1y, several studies have suggested that mast cells participate in the development of the hepatic fibrosis in human liver diseases and in rodent models. But The close relation between mast cells and myofibroblasts in the development of hepatic fibrosis remains still llllclear. In this study We have investigated the change of collagen content, the
disπibution and density of mast cells and myofibrobalsts during 2, 4, 6-week after carbon tetrachloride treatment in rat. Twenty male Wistar rats were divided into four groups including control. Hepatic fibrosis was induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride(CC14) in rats. πle degree of fibrosis was evaluated by measuring the hydroxyproline content(ugjg tissue) of the liver as an index of the collagen content and by using a numerical scoring system for grading hepatic fibrosis in the liver sections stained with Masson trichrome and Gomori reticulum, respectively. The density of mast cells (number/mmj was determined by cOllllting mast cells using a computerized image analyser system in liver sections stained with toluidine blue and alcian blue-safr:없피1 0, respectively.
Also, πle morphological relation between mast cells and myofibloblasts was examined by
elecπon microscopy. πle c이lagen content was significant1y increased at 4 to 6week after CC4 treatment compared with control rats. These results showed significant correlations
(Spe따man’ s， r=O.76, p<O.OOl) with those of a numerical scoring system. In control rats,
mast cells were found principally in portal areas, and their average density was 4.76 i= 2.23/
빼 in liver sections stained with alcian blue-safr없피1 O. Whereas in CC4-treated rats mast cells were diffusely distributed in fibrous septa and fibrous capsule on liver surface and were signific빠ly increased at 2(8.86i= 1.94/mnf), 4(12.26 i= 3.59/mrr이 to 6week(28.09i= 12.7씨
mmj after CC4 treatment compared with control rats. In cαltrol rats, myofibroblasts were not found in portal areas and observed only Q-SMA positive staining on vessel walls in portal areas. In CC4-treated rats, myofibroblasts were occasionally found at 2week after CC4 treatment in portal areas, fibrous septa and liver p따'encyma， but were statistically not
signific빠 compared with control rats. Myofibrobasts were signi잠C뻐t1y increased at 4 to 6week after CC4 treatment. U1trastructurally, mast cel1s were observed in close contact with myofibroblasts in fibrous septa and showed the various stages of degranulation. πlese res띠ts
suggested that mast cell may play role in deve10pment of hepatic fibrosis, probably because of the production of extracellular maπix components by myofibroblasts which activate by some mediators released from mast ce1ls.
Key words hepatic fibrosis, mast cells, hepatic satellite cells, Ito cells, myofibroblasts, collagen content
* 이 논문은 2001 년도 원광보건대학 교내 학술연구비의 지원으로 이루어졌음
1. 서 론 성상세포는 면역조직화학적으로 Q-sm∞th muscle
actin( Q-SMA) 에 양성반응을 나타내며 전자현미경
간섬유증이란 다양한 원인에 의해 간에 세포 상에서 섬유모세포와 평활근세포의 양쪽 특성을 외 기 질 (extracell띠ar maπix) 이 병 적 으로 증가된 상
태로 간경변증의 진행과정중 초기에 발생하며 가역적인 병변이다. 간내에서 세포외기질의 분 비를 관장하는 주된 세포는 간성상세포(hepatic
지니고 있어 근섬유모세포(myofibroblast) 라 부른 다(Nouchi et al,l991; Schirmacher et al, 1992).
간섬유증과 비만세포의 관련성 연구로는 Umezu
등(1985) 이 간의 섬유화와 동반하여 간 히스타민 satellate cell, Ito cell, lipocyte, perisinusoidal cell등 치가 상승한다고 하였고， Gittlen 등(1990)은 만성 의 명칭으로 불림)로， 이 세포는 정상 상태에서 담즙 울체성 간질환 환자에서 혈장 히스타민의 휴지가에 있다가 여러 원인에 의해 활성화되면 상승이 있고 허스타민과 빌리루빈 농도가 높은 형질전환되어 세포외기질을 분비하는 것으로 알 환자에서 가려움증의 증상이 있으므로 이는 생 려져 있다(Pinzani， 1995; Tsukamoto, 1995). 간성 체내에서 비만세포의 활성화에 의한 중개물질의 상세포의 활성화에는 interleukin 1 (IL-l), 江-6， 방출이 담즙 울체성 간 질환에서 관여할 것으로 없nsfonning growth factor-ß(TGF-ß), tumor necrosis 암시하였다. 최근 쥐를 대상으로 한 속발성 담즙 factor-Q(TNF-Q),basic fibroblast growth factor(bFGF) 성 간경변증 유도실험에서도 간섬유화 정도가 등의 사이토차인이 관여하며 (Tsukamoto， 1995; 높아점에 따라 비만세포 수와 탈과립세포 수가 Border and Noble, 1994; Inoue et al, 1996; Roth et 증가한다는 형 태 학적 연구로 간섬 유화 과정 에
때， 1998), 이들 사이토카인에 의해 활성화된 간 비만세포 관련성을 보고하였고(Rioux， 1996), 사
람 간조직에 관한 실험에서도 알코올성 간질환，
원발성 담즙성 간경변증에서도 간내 비만세포 관련성을 시사하였다α，fatsunaga et al, 1999).
Annburst 등(1997)도 사람과 쥐를 대상으로 한
실험에서 비만세포가 간섬유화의 후기 단계에서 단백질분해효소 억제제를 발현시켜 세포외기질 분해를 억제시키므로써 간섬유화를 일으킨다고 주장하였다. 그러나 간섬유증을 유발하는 간성 상세포의 활성화에는 손상된 간세포에 의한 직 접 자극 경로와 대식세포를 통한 간접 자극 경 로 등(Jhonson et 떠， 1992)의 가설 이 제 시 되 어 있 고， 또한 Sugihara 등(1999) 에 의 해 비 만세 포 결 핍 돌연변이 쥐를 사용하여 담관 절단술 및 사 염화탄소에 의한 간섬유증 유발 실험에서 간섬 유화와 비만세포의 관련성이 없다는 보고도 있 어， 간섬유화에 있어서 비만세포의 관련성에 대 한 논란이 계속되고 있다.
따라서 본 연구는 간성상세포의 활성화에 의 한 간섬유증 발생에 있어 비만세포의 관련성을 규명하고자 사염화탄소로 간섬유화를 유도한 쥐 를 대상으로 사염화탄소 투여 기간에 따른 교원 질 함량변화， 간섬유증 진행정도， 비만세포와 근 섬유모세포의 수적 변화를 검토하고 전자현미경 하에서 근섬유모세포와 비만세포의 형태학적 관 련성을 조사하였다.
II. 재료 및 방법
실험동물 및 약물처리
본 연구의 실험동물로는 체중 120g 내외의 건
강한 Wistar 계통 숫컷 흰쥐(주식회사 샘타코， 경
기도 오산. 한국) 20마리를 구입하여 동물사육실 에서 표준사료와 물을 공급하면서 1 주일간 적응 시킨 후 실험에 사용하였다. 흰쥐 20마리를 5마 리씩 대조군과 CC14 투여 2주， 4주， 6주 실험군의 4군으로 나누어 사육하였다. 실험군은 체중을 측 정한 후 1 주일에 두 번씩 6주까지 흰쥐의 체중
kg당 CC410live oil(1:1) 혼합액을 lrnl씩 복강내 주사하였고， 대조군은 6주간 생리식염수만을 복 강내 주사하였다.
2. 조직내 총 교원질 함량의 측정
주별 마지막 약물 투여 2 일 후 에테르로 마취 하여 개복한 후 즉시 실험군과 대조군으로부터 간 오른쪽 중엽의 일부를 적출하여 -700C 의 초저 옹냉동고에 보관하였다 실험에 사용하였다. 총 교원질 양을 hydroxyproline 함량으로 간접 측정
하는 Jamall 등(1981)의 방법에 따라 동결된 간조
직 으로부터 약 0.2g의 조직 을 취 하여 4rnl 의 6N HCl에 넣어 homogenizer로 균질화시 킨 후 110"(
에서 12시간 가수분해한 후 여과하였다. 여액 5αu와 hydroxyproline 표준용액 (1 ug hydroxypro- linej50ul 6N HCl) 5α11를 건조시켜 염산을 날려 보낸 후 50% isopropanol 1.2rnl과 Chloramine-T용 액 0.2rnl을 첨 가하여 교반기 로 잘 혼합한 다음 실온에서 10분간 방치하였다. 방치 후 Ehrlich 사 약 lrnl을 가하여 교반기 로 혼합하고 500C 에 서
%분간 반응시킨 후 558nm에서 흡광도를 측정하 여 조직 g당 hydroxyproline 함량을 구하였다.
3. 광학현미경적 검사
동물들을 희생시킨 후 실험군으로부터 육안적 으로 관찰하여 간섬유증이 발생된 부위를 확인 하고 그 일부를 적출하였고 대조군은 간 오른쪽 외엽 중앙에서 일부를 적출하였다. 적출한 간조 직 은 10% neutral buffered formalin(pH7.4)에 고정 하고 파라핀 자동 침투기를 이용하여 파라핀에 포매하였다.
1) 간섬유증 염색 및 간섬유증 진행정도의 점 수화
회전형 박절기 (Shandon， England)를 이용하여 파라핀 포매 조직으로부터 4um 두께의 절편을
적당히 세척하고 이차 항체로 UIÙve없1 secondary antibody(Research genetics, USA)로 450C 에 서 15
분간 작용시 킨 후 sσ'eptavi며n HRP detection system(Research genetics, USA)로 450C 에 서 10분 간 작용시 켰다. 그 후 AEC(Vector laboratories, USA)로 45t 에서 10분간 발색시킨 후 Mayer hematoxylin으로 대 조염 색 하고 UIÙversal mount (Research genetic, USA)를 사용하여 봉입 하였다.
염색표본은 영상분석기에 부착된 CCD 카메라를 이용하여 현미경 400배에서 염색절편 중앙에서
폭 0.5cm 내에 포함된 모든 영상을 획득한 후 근
섬유모세포를 세어 1mm2 당 세포의 수를 산출하 였다. 400배율에서 컴퓨터 영상으로 획득한 각 면적은 0.0 18mm2 이었다.
제작하고 600C 의 슬라이드 건조기에서 1 시간 건 조시킨 다음 자일렌에 탈파라핀， 하강 계열 알코 올 단계를 거쳐 물에 함수한 후 hematoxylin- eosin, Masson trichrome 및 Gomori retic빼n 염 색 을 하여 간의 형태변화와 간 섬유증 진행 정도 를 관찰하였다. 간 섬유증의 진행 정도는 Ishak 등(1995) 의 기준에 의거하여 다음과 같이 점수화 하였다(Table 1).
3) 비만세포 염색 및 계측
간조직내의 비만세포 감별을 위해 4wn 두께 의 두 장의 연속절편을 제작하여 자일렌에 탈파 라핀， 하강 계열알코올에 함수한 후 tol띠이ne blue 염색을 하였고， 결합조직형 (CTMC) 과 점막형 (tvα1C) 비 만세 포 구별을 위 해 alcian blue-safranin O 염색을 하였다. 두 염색 과정을 간략히 요약하 면 다음과 같다. Toluidine blue 염색은 Enerback
(1966) 의 방법에 따라 0.5 % toluidine blue용액
(pHO.5) (0.행 l00r피 0.5N HCl) 에 옮겨 30분간 염 색한 다음 nuclear fast red용액으로 20초간 약하 게 핵을 염색하여 수돗물에 수세하고 탈수， 투명 2) 근섬유모세포 염색 및 계측
간 조직내의 근섬유모세포 관찰을 위해 4wn
두께의 절편을 제작하여 Probe on Plus slide (Fisher scientific, USA) 에 붙이 고 550C 의 슬라이 드 건조기에서 40분간 건조시킨 후 Microprobe system(Fisher scientific, USA)을 이 용하여 자일 렌 에 탈파라핀， 하강 계열알코올에 함수한 다음 면 역조직화학 염색을 시행하였다. 그 과정을 간단 히 요약하면 절편을 수세 후 조직내 내인성 과 산화효소의 활성을 차단하기 위해 auto blocker (Research genetics, USA)로 450C 에 서 5분간 작용 시 킨 후， immunojDNA buffer(Research genetics,
USA)로 세척한 다음 비특이적 반응을 차단하기 위 해 protein blocker(Research genetics, USA)로 4 50C 에서 5 분간 작용시켰다. 이어 근섬유모세포
염 색을 위 해 일차항체로 mouse anti-human Q
-SMA(Dako, USA)를 1: 50으로 희석하여 450C 에 서 20분간 작용시 킨 다음 ImmunojDNA buffer로
Table 1. A numerical scoring system for grading hepatic fibrosis Fibrotic change No fibrosis
Fibrous expansion of some portal areas, with or without short fibrous septa Fibrous expansion of most portal areas, with or without short fibrous septa
Fibrous expansion of most portal areas with occasional portal to portal(p-P) bridging
Fibrous expansion of portal areas with marked bridging[portal to portal(P-P) as well as portal to central(P -C)]
Marked bridging(P-P anφor P-C) with occasional nodules(incomplete ciπhosis)
Cirrhosis, probable or defmite Score
nU 1i
껴4
11
‘ A‘.
5 6
화하여 histochoice로 봉 입 하였 다. Toluidine blue ultramicrotome(Leica, Leica Ultracut UCT ultrami- (C.I. 5204이는 Si맹m제 품을 nuclear fast red(C.I. crotome ，G해nany)으로 lum두께 의 semi뻐n section No. 60760) 는 R뻐a 제품을 사용하였다. Alcian 을 만들어 toluidine blue로 염색하여 광학현미경 blue-safranin 0 염색은 Enerback( 1966)의 방법에 으로 관찰하고 60-8아un의 thin section을 제작하 따라 1 % alcian blue 8GX용액 (pHO.3)( 1.0g/ 1야피 여 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염 색한 후 0.7N HCl) 에 옮겨 30분간 염색하고 0.7N HCl에 투과전자현미경 (1퍼tachi， Hitachi 7100, Japan)으로 5분간 세척한 다음 0.5% safr때in 0용액 (0.5g/ 75kv하에서 관찰하였다.
l00r띠 0.125N HCl) 에 대조염색하여 수돗물에 행 군 후 탈수， 투명화하여 histochoice로 봉입하였 다. Alcian blue 8GX(C.I. No. 74240)와 Safranin O(C.I. No. 5024이는 각각 Wako와 Junsei 제 품을 사용하였다. 염색표본으로부터 단위 면적당 비 만세포의 수를 계측하기 위해 컴퓨터 영상분석 장치를 사용하였다. 영상분석은 CCD 카메라 (πlOsiba U-CMAD -2, Japan) 가 부착된 현미 경
(Olymphus BX 50, Olymphus Optical Lts,. Japan)
과 분석 소프트왜 어 인 Image-안o Plus ver 3.01 (Media Cyberbetics Inc., USA)를 사용하여 측정 하 였다. 100배에서 염색절편 중앙에서 폭 0.5cm 내 에 포함된 모든 영상을 획득한 후 비만세포를 세어 lmm2 당 세포 수를 산출하였다. 100배율에 서 컴퓨터 영상으로 획득한 각 면적은 0.29mm2 이었다.
4. 투과전자현미경적 검사
5. 자료분석
각 실험군 및 대조군에서 조직내 총 교원질 함량， 비만세포 수， 근섬유모세포 수를 비교하기 위 하여 일원 분산분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)을 시행하였고， 각 군간 측정치의 유의 한 차를 사후검정하기 위해 Turkey 다중비교분 석 (post hoc multiple comp따ison)을 실시 하였다.
toluidine blue와 alcian blue-safranin 0 염 색 간 비 만 세포 수를 비교를 위해서는 paired T -test를 시행 하였다. 그리고 각 군간 총 교원절 함량과 간섬 유화 정도， 간섬유화 정도와 근섬유모세포 수，
간섬유화 정도와 비만세포 수의 상관관계는
Spearman’s rank test블 하였다. 일 원 분산분석 과
paired T -test는 p 값이 0.05 이하일 때， Spe따man’s
rank test는 p 값이 0.01 이하일 때 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 통계 소프트 워l 어 프로그램 으로는 SPSS WIN(ver 10.0)을 사 투과전자현미경 관찰을 위하여 채취한 간 조 용하였다.
직은 즉시 40C 의 2.5 % glutaraldehyde용액 (O.IM S여ium cacodylate buffer, pH 7.4)을 떨어뜨린 dental wax 판 위에서 lmm3의 크기로 세절하여 동일 고정액에 넣어 40C 에서 2시간 전고정한 다음
O.IM sodium cacodylate buffer로 세 척 하여 1%
m. 결 과
1 . 각군별 조직의 형태 변화
osmium tetroxide용액 (O.IM s여ium 띠C여ylate b따fer， 1正， Masson trichrome, Gomori retic빠n 염 색을 pH 7씨에 옮겨 실온에서 2시간 후고정하였다. 하여 대조군 및 각 주별 조직의 형태변화와 간 고정이 완료된 시료는 상승계열 알코올 단계를 섬유증 진행정도를 관찰하였다. 대조군에서는 정 거쳐 탈수하였고 propylene oxide로 치환한 후 상적으로 전체 간소엽이 잘 보존되어 있었고 염 epon 혼합액에 포매하여 360C 에서 l 시간， 800C 에 증성 변화도 관찰되지 않았다(Fig. lA). CC14 투 서 하룻밤 열중합하였다. 제작된 epon 블록은 여 2주군에서는 간소엽 중심부에 소량의 출현성
괴사부위가 출현하였고， 괴사부위에는 약간의 다형핵백혈구， 림프구 및 대식세포들이 침윤되 어 있었다. 괴사부위 주위에서는 강한 호산성의 세포질에 크고 농염된 핵을 가진 세포와 이핵세 포들의 출현빈도가 증가하여 부분적인 재생소견 을 보였다. 간소엽내의 간세포에서는 부분적으 로 작은 지방공포가 출현하였다. 또한 부분적으 로 중심정맥-중섬정맥 또는 중심정맥-문맥을 연 결하는 앓은 섬유성 격막이 형성되기 시작하였 으며， 간표면의 일부에서 소수의 큰 지방세포를 포함한 섬유성 피막이 형성되어 있었다.4주군에 서는 중심정맥-중심정맥 또는 중심정맥-문맥을 연결하는 섬유성 격막이 뚜렷하게 형성되었으며 간실질 부위는 소결절성 간경변 소견과 유사한 재생결절이 관찰되었다. 동시에 괴사부위에는 다 핵형백혈구와 림프구가 감소하는 대선 약간의 호산구 증가를 보이고， 섬유성 중격에는 걸고 불 규칙한 핵을 가진 세포들의 출현빈도가 증가하 였다. 간표면에 형성되었던 섬유성 피막은 더욱 발달되었고 지방세포의 수도 증가하였다. 6주군 에서는 간소엽내에 큰 지방공포를 간직한 간세 포가 전체적으로 매우 뚜렷하게 증가하였고， 이 세포들은 주로 섬유성 격막의 경계를 따라 분포
하였다(Fig. lB). 섬유성 격막도 4주군에 비해 더 발달되어 있었으며， 간표면의 섬유성 피막으로 부터 섬유성 격막이 간실질내로 발달하면서 간 표면의 요철이 관찰되기 시작하였다.
2. 각 군별 조직내 총 교원질 함량의 변화 및 간섬유증 진행정도와의 상관관계
조직내 교원질 함량은 간조직 19 당 hydroxy-
proline 함량을 구하여 산출하였다. hydroxyproline
함량은 대조군에서 294.73 i= 81.42 ug/g, CC14 투 여군의 2주에서 529.11 i= 18 1.74 ug/g, 4주에서 809.18i= 318.22 ug/g, 6주에서 861.1Oi=382.82 ug/g 으로 기간이 지남에 따라 증가하였으며 군별 통 계학적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<O.05)
(Fig. 2). 이를 다시 다중 비교분석한 결과 대조군
과 2주군 사이에는 통계학적으로 유의한 차이를 인정할 수 없었으나(p>O.05)， 대조군과 4주군， 5 주군에서는 통계학적으로 유의한 차이를 보였다
(p<O.05). 이 같은 결과는 CC14 투여 후 기 간이
지남에 따라 나타나는 간섬유증 진행정도와 유 의한 상관관계를 보였다(Fig. 3).
Fig. 1. Light TIÚcrographs of control and CCL-treated liver. Control r.따(A) shows nonnal structure without fibrous septa. At 6 weeks after CCL treatment, liver shows fat vacuoles in hepatocytes(black arrow) , pseudo-lobular
nodul않 surrounded by fibrous septa(white arrow)(B). Masson trichrome stain. C, central vein; P, portal ar않S
1400
* *
。 1200
g 1000
I m 800
Q。」〉x、。‘- 600
깅 400
J〉=、
200 며
Control 2wk 4wk 6wk
Fig. 2. αumge of hydroxyproline content per gram of liver tissue in conπ01 and CCl4-treated rats during experimental period. Each value repf않ents the mean:tSD of 5 rats. *, p<O.05 by one-way ANOVA test, compared with the data from control rats.
1400
핀D 12OO --
그
<D 1000 r=0.76 p<0.001
I
。a갖。 800
600
깅
I〉、 400 200 •
O - • - →~---_.- →~
O 2 3 4 5 6 7
Degree of hepatic fibrosis
Fig. 3. Correlation between the degree of hepatic fibrosis and the hydroxyproline content. Linear coπelation
for two elements is highly significant(p<O.OOl).
3. 각 군별 단위 면적당 근섬유모세포 (a-SMA 군에서 a-SMA 양성세포의 수치는 통계학적으로 양성세포)의 분포 및 수 매우 유의한 차이를 나타내었다(p<O.OOl). 이를 다시 다중 비교분석한 결과 CC14 투여 2주군에
면역염색 결과 대조군에서의 a-SMA 양성반응 서의 a-SMA 양성세포의 수치는 6.62 :t 3.7이mm2 은 혈관의 평활근세포， 문맥 혈관벽에서만 관찰 로 대조군에 비해 증가하였지만 통계학적 의의 되었다(Fig. 4A). 그러나 CC14 투여군의 경우 섬
유성 격막 및 간실질 세포에서도 a-SMA 양성세 포가 관찰되었으며， 주로 문맥 주위나 섬유성 격 막을 따라 분포하였다(Fig. 4B). a-SMA 양성세포 는 세포질로부터 많은 돌기들을 내어 주변의 세 포들 사이의 세포들과 연결하는 형상이 종종 관 찰되었다(Fig.4C&D 화살표). 대조군과 CC4 투여
p 樓~
c
는 없었으며 (p>0.05)， CC14 투여 4주군과 6주군에 서의 경우 a-SMA 양성세포의 수치가 각각 20.68
:t 10.6이mm2， 32.90 :t 3.89jmm2를 나타내어 4주 이 후부터 통계학적으로 매우 의의 있는 증가를 나 타내었다(p<O.OOl ， p<O.OOl)(Fig. 5). CC14 투여 후 기간 경과에 따른 간섬유증 진행정도와 근섬유 모세포 수치의 상관관계를 조사한 결과 매우 유
; 웅
Fig. 4. Q-smooth muscle actin(Q-SMA) staining in control and CC4-treated rat. (A) Q-SMA positive cells in control rat are only observed on vessel walls of portal areas. on the contrary, increased numbers of Q -SMA positive cells in CC14-treated r따 are prl않ent around fibrous septa and in liver parenchyma(B).
돼ese cells are large and possess distinct cytoplasmic processes(white arrow)(C & D). C, central vein; P, portal areas; d, interlobular bile duct.
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Fig. 5. αl8llge of a-SMA positive cell number per mm2 in conπ01 and CC4-treated rats during experimental period. Each value represents the mean:tSD of 5 rats. **, p<O.01 by one-way ANOVA test, compared with the data from control rats.
의한 상관관계를 나타내었다(r=O.94， p<O.OOI)
4. 각 군별 단위 면적당 비만세포의 수
포의 수는 1.24 ::tO.55/mm2, CC14 투여군의 2주에 서 3.74::t 1.42/mm2, 4주에서 4.68::t 1.40/mm2, 6주 에서 6.90::t 1.69/mm2로 기간이 지남에 따라 증가
하였으며 통계학적으로도 매우 유의한 차이를 간조직내 비만세포는 toluidine blue와 alci뻐 나타내었다(p<O.OOl)(Fig. 7). Alcian blue-Safranin
blue-sa없뻐1 0염색결과 전체 군에서 결합조직형 O 염색의 경우 대조군에서의 비만세포의 수는
비만세포(C’fMC) 만 출현하였고 점막형 비만세포 4.76::t2.23/mm2, CC4 투여군의 2주에서 8.86 ::t (MMC)는 관찰되지 않았다. 비만세포의 분포는 1. 94/mm2, 4주에서 12.26 ::t 3. 59/mm2 , 6주에서 대조군의 경우 소수의 세포가 문맥내 혈관주위 28.09::t 12.74/mm2로 증가하였으며， 통계학적으로 에서 출현하였으며(Fig. 6A), CC4 투여군의 경우 도 매우 유의한 차이를 나타내었다(p<O.OOl) (Fig.
는 간섬유증의 진행과 함께 문맥내 뿐만아니라 끼. 이를 다시 다중 비교분석한 결과 toluidine blue 문맥 주위로 확장되어 나간 섬유성 격막을 따라 염색의 경우 대조군에 비해 2, 4, 6주군에서 각 분포하면서 섬유증 정도가 심해칠수록 그 수도 각 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었으며 증가하였다. 특히 섬유성 격막이 잘 발달된 곳일 (p<O.05, p<O.OI, p<O.OOl), alcian blue-safranin 0 염 수록 탈과립 비만세포가 많이 관찰되었다(Fig.6 색에서도 대조군에 2, 4, 6주군에서 각각 통계학
B&C). CC4 투여 6주군에서는 간조직의 표면에 적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<O.05， p<O.05,
생긴 두꺼운 섬유성 피막를 따라 많은 수의 비 p<O.OOI). 또한 두 염색방법에 대한 비만세포 수 만세포가 출현하였다(Fig. 6D). 그러나 간실질내 의 차이를 비교하기 위해 paired T-test한 결과 대 에서는 비만세포가 거의 관찰되지 않았다. 조군(p<O.05)， 2주군(p<O.OOI)， 4주군(p<O.05)， 6주
Toluidine blue염색의 경우 대조군에서의 비만세 군(p<O.01) 간에 통계학적으로도 유의한 차이를
핵은 중앙 또논 한쪽으로 약간 치우쳐 있으며 군데군데 만곡이 있는 원형 또는 타원형이었다.
세포질내에는 단위막으로 둘러싸인 전자밀도가 서로 다른 크고 작은 과립들로 채워져 있으며，
세포질내 소기관뜰은 거의 관찰되지 않았다.
CC14 투여군에서 비만세포는 드물게 간세포 사 이에서 관찰되기도 하였으나， 주로 섬유성 격막 을 따라 분포하였고， 항상 많은 수의 근섬유모세 포와 가까이 또는 거의 밀착된 상태로 존재하였 다(Fig. 9A). 특히 CC14 투여 가 간이 경 과함에 따 라 탈과립세포도 종종 관찰되었다(Fig. 9B). 근섬 인정할 수 있었다(p<O.Ol). 간섬유증 진행정도에
따라 비만세포 수치의 상관성이 있는가를 조사 한 바 간섬유증의 진행 정도가 높아질수로 비만 세 포 수에 있 어 서 toluidine blue 염 색 과 alcian
blue-safranin 0 염색이 모두 높은 상관관계를 보
간조직내 비만세포는 세포표면에 가늘고 긴 돌기를 가진 불규칙한 형태로 관찰되었다(Fig. 9A).
였다(Fig. 8).
5. 투과 전자현미경 소견
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Fig. 6. (A) Distribution and density of mast cell in control and CC14-treated rat. (A) One mast cell(white arrow) next to interlobular bile duct(d) in portal area of control rat liver stained with toluidine blue. (B) Increased number of mast cells in CC14-treated rats are principally observed in fibrous septa(black aπow). (C) Mast cell numbers in fibrous septa of CC14-treated rat satined with alcian blue-safranin O(black arrow) are obseπed
greater than those stained with toluidine blue(D). In liver section of CC14-treated rat, mast cells and degranulated mast cells(black arrow) are presented greater in capsular fi~rotic sites than in fibrous septal sites.
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Fig. 7. Change of mast cell number per mm2 in control and CC14-treated rats during experimental period. Each value reprl않ents the m댔l :t SD of 5 rats. * ,p<O.05; **, p<O.01, ***, p<O.OOl by one-way ANOV A test, compared with the data from control rats. TB, toluidine blue stain; AS, alcian blue-safranin 0 stain.
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Control
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Degree of hepatic fibrosis
O 2
Fig. 8. Correlations between the degree of hepatic fibrosis and mast cell number per mm2 in liver sections stained with toluidine blue(TB) and alcian blue-safranin O(AS). Linear correlation for two elements between two staining methods is hig삐y significant.
유모세포는 모양이 섬유모세포의 형태와 유사하 고 세포질내 소수의 지방방울， 과립형 내형질세 망， 골지복합체와 세포질 주변부로 가는 세사를 가지고 있으며， 표면으로부터 긴 돌기들이 뻗어 나와 비만세포와 접촉하고 있는 것이 많이 관찰 되 었다(Fig. 9B).
N. 고 찰
터 간실질세포의 괴사와 염증을 일으키며， 그 후 간 중심 변연부 가까이 섬유성 격막을 발생시킨 다는 보고와 일치하였다. 동시에 본 실험에서 간 섬유증 진행정도를 구분하는데 사용한 Ishak 등 (1995) 의 점수화 방법이 형태학적 간섬유화 진행 정도 측정과 정량적인 방법과의 비교에서 비교 적 큰 오차가 없다는 것을 의미한다. 따라서 정 량적인 분석이 필요치 않은 일반 조직 형태 관 찰시 섬유화 정도를 정성적으로 판정하는데 효 본 실험 결과 쥐에 사염화탄소를 6주간 복강 과적인 측정방법이라 사료된다.
내 투여하면서 2주 간격으로 조사한 결과， 2주부 간섬유화 과정은 사람 간질환 조직과 실험동 터 간조직 괴사와 더불어 간실질내로 앓은 섬유 물에서 간성상세포가 활성화되어 교원질을 포함 성 격막이 출현하기 시작하여 기간 경과에 따라 한 세포외기질을 분비하므로써 유도되는 것으로 4주 이후부터 뚜렷한 섬유 증가를 확인할 수 있
었다. 이를 다시 객관적으로 평가하기 위해 간섬 유화 진행정도를 정성적으로 6등급으로 나누고，
정량적으로 각 주별 총 교원질 함량을 간 조직 의 g당 hydroxyproline 양으로 측정 한 결과 두 방 법간의 유의한 상관성이 있는 것으로 나타냈다.
이런 결과는 쥐에서의 실험적 간섬유화 유도에 는 여러 종류의 물질이 사용되나 간 독성물질인 사염화탄소의 반복 투여에 의해 쉽게 유발되며
(Tamayo, 1983). 이 모텔은 간의 중심 변연부로부
알려 져 있다(Nouchi et al, 1991; Schmitt -Graff et.
al., 1993). 이렇게 활성화된 간성상세포는 초미세
구조가 흔히 섬유모세포의 형상을 하고 있으며，
교원섬유 다발에 근접하여 출현한다(McGee and Patrick, 1972). 쥐 의 간섬 유증 유발 실 험 에 서 도 III 형 교원칠로 구성된 결합조직 섬유성 격막 형 성에 정상 간성상세포와 섬유모세포의 양쪽 특 정을 소유한 이행 세포들이 연관성이 있다고 하 였다(Kent et al, 1976). 기 원이 다른 사람의 만성 간염에서도 간성상세포와 근섬유모세포의 양쪽
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Fig. 9. Electron micrographs of mast cells and myofibroblasts in fibrous septa of CC14-treated rat liver.(A) Mast cells(MC) contained many dense granules surrounded by unit membrane in its cytoplasm and myofibroblasts(mt) with distinct cytoplasmic processes are observed around collagen fibers( *). (B) A degranulated mast cell(dmc) is situated in close contact with myofibroblasts(mt). V: perisinusoidal vessel.
특징을 소유한 세포들이 출현한다고 하였고(Mak 부위에서 Q-SMA 양성반응을 보이는 세포들이
et al, 1984), 알코올에 의해 유발된 사람 간섬유 출현하였다. CC4 투여 후 2주군에서 대조군보다
증에서도 정상 간에서 나타나는 간성상세포와 근섬유모세포 수가 증가하였으나 통계학적 유의 달리 과립형 내형질세망이 증가하고 지방소적이 성이 없었고 CC4 투여 후 4주군과 6주군에서 뚜 감소하는 간성상세포가 나타난다고 하였다-(Minato 렷한 증가를 보였으며， 이를 간섬유화 진행정도
et al, 1983). Geerts 등(1990)도 사염화탄소에 의 와 상관관계를 검토한 결과 유의한 상관성을 보
한 간손상시 면역조직화학적 염색으로 desmin에 여 간섬유화 진행정도에 따라 근섬유모세포가 양성을 나타내는 활성화된 간성상세포가 간중섬 증가한다는 것을 알 수 있었다. 그라고 간실질부 부에서 증가한다고 보고하였다. 그러나 정상 간 위에서의 근섬유모세포의 증가와 더불어 섬유성 성상세포의 경우도 desmin 양성반응을 나타내므 격막의 확장이 이루어지는 것도 관찰할 수 있었 로(Yokoi et al, 1984), 활성화된 간성상세포와 구 다.
별할 수 없다. 최근 Romandori( 1990) 는 쥐를 이용 간성상세포의 활성화를 촉진하는 인자로 여러 한 동물실험에서 Northern blot 분석 결과 활성화 종류의 사이토카인이 거론되어 왔다(Roth et al, 된 간성상세포에서 Q-SMA 유전자 발현이 증가 1998; Rouss et al, 1991; Gordon and Galli, 199이.
한다는 사실을 토대로 활성화된 간성상세포는 그러나 이런 사이토카인의 방출이 어느 세포로 근섬유모세포로 분화한다고 하였고， Schmitt- 부터 이루어지는 가에 대해서는 정확히 밝혀져
Graff 등(1 993)도 간섬유화 동물을 이용한 면역전 있지 않은 실정이다. 최근 Kollinger 등(1997) 이
자현미경적 연구에서 동모양혈관 주변 세포들 만성간염 환자의 섬유화가 활발히 진행되는 부 중 간성상세포만이 Q-SMA에 양성을 나타낸다고 위의 담관 주변에서 비만세포의 증가를 관찰하 하였다. 이러한 결과들은 간 손상시 간성상세포 여 간섬유화에 비만세포의 관련성을 시사하여 의 활성화를 알아보는 지표로 Q-SMA 면역염색 주목을 받고 있다. 비만세포는 사람의 피부에 관 이 특이적인 방법임을 시사하고 있다. 장 등 한 실험에서도 세포질내 과립으로부터 bFGF
(1998) 바이러스성 간경변증， 담즙성간경변증， 알 mRNA와 그 단백질이 검출되어 섬유모세포 증
코올성 간경변증， 윌슨질환을 비교한 연구(에서 식을 촉진할 수 있다고 시사 하였으며 (Reed et
교원질 함량의 증가와 더불어 Q-SMA 양성 간성 al, 1995), bFGF는 섬유모세포의 증식， 재건 (remo- 상세포가 증가한다고 하였으며， 간경변증의 원 delling), 혈관형성과 같은 paracrine 조절에 있어 인에 관계없이 교원질 함량과 Q-SMA 양성 간성 다기능적 역할을 가지는 것으로 보고되어 있다 상세포 사이에 정비례의 상관관계를 보이며， Q (Friedl et al, 1997). 또한 이 등(1999)은 전기자극
-SMA 양성 간성상세포는 간실질에 비해 섬유성 을 이용한 창상 치유과정에서도 전기자극에 의
격막에서 통계학적으로 유의하게 증가한다고 하 해 비만세포가 증가되고 증가된 비만세포로부터 였다. 또한 Thioacetamide 유발 간경변증(정 등， 탈과립에 의해 방출된 물질에 의해 섬유모세포 1998)과 Dimethylnitrosamine 유도 간섬유화 과정 를 자극하여 교원질이 생성된다고 하였다. 그러 에서 Q-SMA양성 간성상세포가 증가한다고 보고 나 bFGF의 비만세포내 존재에 대해서는 잘 알려 하였다(서 등， 2(01). 본 실험에서도 대조군과 져 있지 않았다. 최근 Y때lliS피ro 등(1998)은 간내 CC14 투여군의 비교실험에서 대조군의 경우 문 문맥 주변의 섬유 증식부위나 섬유성 격막 및 맥의 혈관벽을 제외한 다른 부위에서는 Q-SMA 담관가지의 섬유 증식부위에서 비만세포의 밀도 양성반응을 관찰할 수 없었는데 반해 CC4 투여 가 증가하였고， 이 비만세포 과립내에서 면역전 군에서는 간실질 부위와 섬유성 격막이 형성된 자현띠경 겸색을 통하여 bFGF의 존재를 확인하
였다. 본 실험에서도 toluidine blue와 alcian blue- 합조직형 비만세포(alcian blue- 양성) 한 종류만이 safr때inO 염색에서 모두 대조군에 비해 CC14 투 존재하는 것으로 나타났다. 이 같은 결과는 급성 여 2주군부터 비만세포가 유의하게 증가하였고， 간염 환자를 대상으로 비만세포의 광학 및 전자 기간 경과와 더불어 비만세포 수가 유의하게 증 현미경적 연구에서 문맥에 출현하는 결합조직형 가하는 경향을 보였다. 이 같은 결과는 총 교원
질 함량과 근섬유모세포가 CC4 투여 4주군에서 부터 유의하게 증가한 것에 비해 비만세포의 증 가가 앞서 일어난다는 것을 의미하며， 비만세포 의 증가와 더불어 비만세포로부터 탈과립에 의 해 방출된 중개물질이 간성상세포를 활성화시켜 근섬유모세포로 형질전환되어 교원질을 비롯한 세포외기질을 분비한다는 것을 확인할 수 있었 다. 그러나 비만세포 수는 염색에 따라 단위 면 적당 큰 차이를 나타내어 비만세포 염색에 있어 염색법 선택이 매우 중요한 조건임을 알 수 있 었다. 이 결과는 포르말린 고정 이 toluidine blue 와 alcian blue-safranin 0 염 색 성 에 크게 영 향을 미 치 며 (Strobel et al, 1981), 특히 toluidine blue 염 색의 경우 장점막， 비점막， 폐 실질조직의 포르 말린 고정조직에서 약 70% 의 비만세포가 염색 이 되지 않을 것이라는 보고와 일치 하였다 (Befus et al, 1985). 따라서 최근 비만세포의 특이 적 검출에는 AAl 단클론항제를 이용한 면역조 직화학 염색을 이용하는데(Akiyoshi et al, 1998), 이 방법에서는 점막형과 결합조직형을 구별할 수 없다. 이 두 종류의 비만세포를 구별하려면 따φatse와 chymase에 대한 항제를 사용해야 하므 로 염색과정에 많은 시간과 경험이 요구된다. 본 실 험 에 사용한 alcian blue-safranin 0 염 색 은 두 종 류의 비만세포를 구별하는데 이미 많이 사용되 어 왔으며 (Sugihara et al, 1999), 본 실 험 결 과에 서 도 toluidine blue 염 색 에 비 해 총 비 만세 포 수에 있어서 평균 3-4 배 정도 많이 검출되므로 포르말 린에 민감한 비만세포 수를 감안하더라도 염색 방법이 간편하여 충분히 사용 가치가 있다고 사 료된 다. 본 실 험 에 서 alcian blue-safranin 0 염 색 결 과 비만세포는 문맥， 섬유성 격막 부위에만 존재 하였고 간실질내에서는 관찰되지 않았으며， 결
과 골수계의 모세포(blast)로부터 유래하는 동모 양혈관형 비만세포가 존재한다는 보고(Barda이n and Scheuer, 1986), 사람을 대 상으로 한 여 러 종 류의 간 질환에서 2중 면역염색을 한 결과 따φ>tase 양성 αIT(l)와 따φatse와 chymase(MC(TC) ) 에 모두 양성을 나타내는 2종류가 존재하며 각 각 26%와 76% 비율로 분포한다는 결과α1atsunaga 등， 1999) 와 일치하지 않았다. 이같은 차이는 암 으로 더 조사해야할 것으로 사료되나， 이미 잘 알려져 있는 바와 같이 비만세포의 종류는 종에 따라 차이가 있고 부위별 차이가 있기 때문에 (Eneback, 1966), 쥐를 사용한 본 실험결과와 사 람에서의 결과가 차이가 있다고 보여진다.
끝으로 근섬유모세포와 비만세포의 형태학적 관련성을 조사하기 위해 전자현미경 검색을 한 결과 섬유성 격막부위의 교원섬유 다발 주위에 근섬유모세포 증가와 함께 비만세포의 증가하였 고， 이 두세포는 항상 서로 가까이 또는 밀착되 어 있는 형태로 관찰되었으며， 비만세포의 탈과 립 현상도 흔히 볼 수 있었다. 또한 이 두 세포 의 주변에는 혈관이 많이 분포하였다. 이 같은 형태는 Akiyoshi 등(1998) 의 쥐를 이용한 간경변 증의 전자현미경적 연구에서 비만세포/근섬유모 세포/선경종말 복합체가 상호 작용하여 근섬유 모세포로부터 세포외지질을 생성하여 간경변을 유발한다는 결과와 임-치한다.
이러한 결과를 종합해 볼 때 우리의 실험결과 는 CC14에 의한 간세포 손상의 자극으로 비만세 포가 간 조직에 증가하고 비만세포로부터 탈과 립에 의해 방출된 중개물질이 근섬유모세포의 증식을 유도하여 간섬유증이 발생한다는 것을 확인할 수 있었다.
