Effect Hepatic Cell Apoptosis and TGF-ßl Secretion in Carbon Tetrachloride-treated Rats TGF-ßl

일상병리검사파악외 ^I: 저134 뀐 저12 호，

171 -180 , 2002

샤염화탄소 투여 쥐에서 아연이 간세포의 아포토시스와

TGF-ßl

분바에 미치는 영향

원광보건대학 임상병리과

•

원광보건대학 방사선과 원광대학병원 해부병리과 원광대학병원 임상병리과 원광대학교 의과대학 미생물학교실4 제갈승주

· 김은정 ·

최영자 곽효일2 노종섭 2 신용섭 3 김진경4

Effect of Zinc on Hepatic Cell Apoptosis and TGF-ßl Secretion in Carbon Tetrachloride-treated Rats

Jekal , Seung Joo. , Kim , Eun Jung. , Choi , Young Ja

1.

, Kwa k, Hyo 11 2 . , Rh o , Jong Sup2. ,

S퍼n， Yong SUp3.

, Kim , Jin Kyung4

Department of

Clinicα1

Pathology , W onkwang H ealth Science College Department of

Radiolo잉1，

Wonkwang Health Science College' Department of Anatomic Pathology , W onkwang University H ospital ²

Department of Clinical Pathology , Wonkwang University Hospitat Department of Microbiology , School of M edicine , Wonkwang University

^‘+

Recent1y zinc has been known as a beneficial agent in the protection against hepatotoxicity and Its effect was supposed due to decreased hepatic cel1 apoptosis by the inhibition of endonuclease activity. Meanwhile , Transfonning growth factor-ßl (TGF-ßl) was considered an important re gu1 ator in the pathogenesis of early hepatic fibrosis. The aim of this study was to ascertain the effect of zinc on hepatic cell apoptosis and TGF-ß lsecretion in early hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride (CC4). Twenty male Wistar rats were divided into four groups: the control group ,

control + zinc treated group , CC14 treated group and CC4 +zinc treated group. All the rats were sacrified 8 days later for histological and biochemical assessments. The col1agen content in liver was measured after Masson ’ s trichrome staining , apoptosis was detected by terminal UDP-nick end labelling (TUNEL) staining and TGF-ßl was quantified by labelled streptavidin biotin (LSAB) immunostaining using a computerized image analysis system. TUNEL-positive cells (apoptotic cel1s) increased in rats with early hepatic fibrosis and oral zinc administration decreased the number of apoptotic cells in the CC14-treated rats. The zinc-mediated decrease of apoptosis in the liver was related to an increase of TGF-ßl positive cel1s and col1agen conten t. However , AST , ALT levels and the number of fatty changed hepatic cel1s as an index of hepatic cell damage increased in rats with early hepatic fibrosis and two indices decreased by zinc administration. These results suggest that apoptosis may be involved , together with necrosis , in the early hepatic fibrogenesis and was closely related to the increase of TGF-ß 1 secretion and collagen conten t. Therefore , zinc could play an important role in the inhibition of early hepatic fibrosis induced by CC4

Key Words : Hepatic fibrosis , Zinc , Apoptosis , TGF-ß

*

이 논문은 2002년 원광보건대학 연구비 지원에 의해서 연구됨

1 .

서 ^로

아연(감1)은 생체내의 필수 미량금속의 하나로， 생 체내의 금속단백절이나 금속효소의 구성성분으로 중요한 역할을 담당하고 있다 (김 등，

2 (0 1).

근래 사람과 실험동물 연구에서 아연은 간 독성으로부터 간세포를 보호하는 효과가 있음이 보고되고 있다 (Cousins~

1986; Wilson , 1988).

알코올성 간질 환 환자 의 섬유화 과정에서도 혈청내 아연 농도 및 조직내 아연 농토가 감소하며

(Rocchet et al , 1994) ,

사염 화 탄소나 에탄올투여 유도 쥐의 간경변 실험 모텔에 서도 아연은 간의 교원질 함량， 섬유형성과정， 교원 칠분해효소 활성을 감소를 감소시킬 뿐만 아니라 간경변증의 진행을 제한하는 것으로 알려져 있다

(Camps et al , 1994; Cabre et al , 1995).

최 근에 는 아 연이 세포의 아포토시스 (apoptosis)의 조절에 관여 하는 것으로 밝혀지면서 간손상과 아포토시스 사이 의 관련성에 관섬이 집중되고 있다

(Takiya , 1995).

아포토시스란 체내에서 발생하는 자연 사멸된 세 포를 제거하기 위한 세포의 형태 변화로， 그 특정은 세포의 위축， 막의 융기， 염색질농축과 세포막의 붕 괴없이 세포팔편화와 같은 형태학적 변화와 더불 어 여러 생화학적 변화도 나타난다

(Patel & Gores ,

1995).

그 중 가장 흔한 변화는 뉴크레오좀 사이의

절단이 일어나 DNA가

180

염기쌍 크기의 소뉴크레 옴(oligonucleosome)으로 단편화한다. 몇 가지의 실 험 모텔에 서 아연 은

Ca2+ , Mg2+-dewndcI1t endonudea-

se의 활성을 억제하여 DNA의 단편화와 아포토시스 를 감소시키는 것으로 보고되어 있다

(Wyllie , 1980).

한편

transforming growth factor-ß 1 (TGF-ß

1) 은 여 러 세포나 기관으로부터 분비되는 사이토카인 하나인 데， 정상적인 상태에서는 간세포의 성장과 증식을 억제하지만 급성 간섬유화 및 만성 간질환이나 간경 변증에서는 발현이 증가하며

(Nakatsukasa et al , 1990;

Arm endariz-Borunda , 1990; Brenner , 1991; Border &

Noble , 1994) ,

간의 섬 유화과정 에 서 중심 적 인 역 할을 담당하는 것으로 알려져 있다

(Border & Noble , 1994;

Bedossa & paradis , 1995).

이 러 한 TGF-ß1 의 분비 가 간의 아포토시스 과정에도 영향을 미친다고 하여 아

포토시스와

TGF-ß1

분비 사이에 상호관련성이 있음 을 시사하고 있다

(Lin & Chou , 1992).

본 연구는 사염화탄소로 유도된 간 질환의 초기 단계에서 아포토시스의 증가 여부 및 아포토시스의 억제가 아연의 간보호 효과와 관련이 있는지를 확 인하고， 아포토시스와 TGF-ß1 의 관련성을 조사하여 아포토시스와 간섬유증 발생 사이의 관련성을 규명 하기 위한 것이다.

ll.

재료 및 밤법

1.

실험돔물 및 약물처리

본 연구 실험동물로는 체중

120g

내외의 건강한

Wistar

계통 수컷 흰쥐 (주식회사 샘타코， 경기도

오산， 한국) 20마리를 구입하여 동물 사육실에서 표준사료와 물을 공곱하면서 1 주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 흰쥐 20마리중 10마리 (처치군) 는

4

일 간격 으로 2회 체 중 kg당 1ml 의

CCk/olive oil (1:

1)를 복강내 주사하였고， 나머지 10마리(대조 군)는 처치군과 같은 양으로

olive

oil만을 투여하였 다. 실험을 시작하면서 아연의 영향을 관찰하기 위 해 대조군과 처치군을 각각 두 군으로 더 세분하 여 아래와 같이 4군으로 분류하였다.A군은 대조 군으로 표준사료만 먹 인군， B군은 대조군으로 표준 사료와 아연을 투여 한군. 아연은 증류수에 강1S04 를 녹여 매일 체중 kg 당 O.lmg 의 비율로 녹여 식도 를 통하여 투여하였다.C군은 처치군으로 표준사료 만 먹인군， D군은 표준사료와 아연을 투여한군. 모 든 쥐는 약물과 아연 투여가 끝난 이틀 후 희생시 켰다.

약물 투여 이틀 후 쥐를 희생시키기 전에 에테르 로 마취하여 개복한 후 복대동맥으로부터 3ml의 혈 액을 채취하였다. 채취한 혈액은 30분간 방치한 후 3，ω야pm으로 원심분리하여 혈청을 취하여 -20⁰C 에 보관하였다. 그 후 간의 오른쪽 외엽의 일부를 적출 하여

10%

중성완충포르말린에 고정하였다.

2.

혈청효소(AST ，

AL T)

검사

-20⁰C 의 냉동고에 보관된 혈청은 생화학 자동분 석 기

(Hitachi 747 0786-7 ,

Japan)를 이 용하여

aspartate

tr뻐saminase

(AS T) , alanine transaminase

(ALT)를 즉 정하였다.

3.

간의 형태계측 분석

10%

중성완충포르말린에 고정된 간조직을 파라 핀에 포매한 후 회전형 박절기

(Shandon ,

England)를 이용하여

4um

두께의 절편을 제작하고 60⁰C 의 슬라 이드 건조기에서 1 시간 건조시킨 다음 자일렌에 탈 파라핀， 하강 계열 알코올 단계를 거쳐 물에 함수한 후 hematoxylin-eosin과

Masson trichrome

염 색 을 하 여 간의 형태변화와 간 섬유화 진행 정도를 관찰하 였 다.

Hematoxylin-eosin

염 색 표본은 영 상분석 기 에 부착된

CCD

카메라를 이용하여 현미경 100배에서 염색절편 중앙에서 폭

0.5cm

내에 포함된 모든 영 상을 획득한 후 지방변성세포를 세어

lmrrr

당 세포 의 수를 산출하였다. 100배율에서 컴퓨터 영상으로 획득한 각 면적은 0.29m따 이었다.

Masson trichrome

염색에 의해 염색된 교원질은 영상분석기를 이용하 여 문맥 부위 (poπal area) 와 중심 부위

(central

area) 를 제외한 나머지 부위에서 100배에서 동일하게 영상 을 획득한 후 획득 영상내 면적당 함유된 교원철의 상대 백분율을 산출하였다.

4.

^{아포토시스 세포}

(apoptotic

cells) 의 염색 및 계수

10%

포르말린고정-파라핀포매조직으로부터

4um

의 두께 로 박절 된 절 편 을 암obe-On-Plus

slide (Fisher Scientific ,

USA) 에 부착시킨 후， 55⁰C 에서 1 시간 건 조한 다음

capillary action

gap의 원리를 이용한

MicroProbe system (Fisher Scientific ,

USA)을 사용하 여 염색하였다. 즉 자일렌에 탈파라핀하고 하강계 열 알코올에 함수시킨 후， 증류수에 수세하여 pr아ei­

nase K (Dako ,

USA) 와

3%

H2⁰2를 처리하였다. 그

다음

ApopTag In Situ Apoptosis Detection kit (On cor ,

USA)를 사용하여

equibilibration

buffer에 실 온에 서 15 초 처 리 하고

TdT (terminal deoxynucleotidyl trans-

ferase) 에

37

⁰

C

1 시간 반응시킨다. 다음 반응 정지를 위해

Strength StopjWash

Buffer에 실온에서 10분간 두었다가，

anti

-digoxigenm-peroxidase 에 설온에서

30

분간 반응시 킨 후

AEC (Histofme ,

Japan) 로 발색 한 다음，

Mayer

hematoxylin으로 대조염 색하여

universal

mount로 봉입하였다. 염색표본은 영상분석기에 부 착된

CCD

카메라를 이용하여 현미경 200배에서.염 색절편 중앙에서 폭

0.5cm

내에 포함된 모든 영상 을 획득한 후 πJNEL- 양성세포를 세어

lmm

² 당 세포 의 수를 산출하였다.200배율에서 컴퓨터 영상으로 획득한 각 면적은

0.073mm

² 이었다.

5.

TGF-ßl 으| 면역조직화학적 염색 및 계수

간 조직내의

TGF-ßl

양성세포 관찰을 위해

4um

두께 의 절 편을 제 작하여

Probe on Plus slide (Fisher scientific ,

USA) 에 붙이고 55⁰C 의 슬라이드 건조기

에 서 40분간 건조시 킨 후

Microprobe system (Fisher scientific ,

USA)음 이용하여 자열렌에 탈파라핀， 하 강계열 알코올에 함수한 다음 면역조직화학 염색을 시행하였다. 그 과정을 간단히 요약하면 절편을 수 세 후 조직내 내인성 과산화효소의 활성을 차단하 기 위 해

auto blocker (Research genetics ,

USA) 로

45

℃에서 5 분간 작용시킨 후，

ImmunojDNA buffer (Re-

search genetics ,

USA) 로 세척한 다음 비특이적 반응 을 차단하기 위 해

protein blocker (Research genetics ,

USA) 로 45⁰C 에서 5 분간 작용시켰다. 이어 근섬유모 세포 염색을 위해 임차항체로

TGF-ß 1 (Santa Cruz

Biotechnology ,

USA)를 1:50으로 희석하여 45⁰C 에서 20분간 작용시 킨 다음

ImmnojDNA

buffer로 적 당히 세 척 하고 이 차 항체 로

universal secondary antibody

(Research genetics ,

USA) 로

45

⁰

C

에 서 15분간 작용시 킨 후

streptavidin HRP detection system (Research ge-

netics ,

USA)로 45⁰C 에서 10분간 작용시켰다. 그 후

AEC (Histofme ,

Japan)로

45

⁰

C

에 서 10분간 발색 시 킨 후

Mayer

hematoxylin으로 대 조 염 색 하고

universal

가하였다

(p< 0.001 , p<0.05).

C군과 D군

ALT

값의 비교에서 C군에 비해 D군에서 감소하여 통계학적으 로 유의한 차이가 있었다

(p<0.05).

사염화탄소 처치군에서의 지방변성세포 수를 조 사한 바 C군은 442. 70:t245. 96/m따이 었고， D군은

253.89:t 117

.48/mnf이어서 C군에 비해 D군에서 통계

학적으로 매우 유의한 차이를 나타내었다

(p<O.OOl) (Fig.2A-C).

mount (Research genetic,

USA)를 사용하여 봉입하였

다. 염색표본은 영상분석기에 부착된

CCD

카메라 를 이용하여 현미경 100배에서 염색절편 중앙에서 폭 0.5cm 내에 포함된 모든 영상을 획득한 후 TGF-

ß1

양성세포를 세어 1mnf 당 세포의 수를 산출하였 다. 100배율에서 컴퓨터 영상으로 획득한 각 면적은

0.29mnf

이 었다.

-...---'----‘

A B C

Experimental groups

따

M

·NN

•

뻐 뻐 때 때

m

뻐 뼈 때 때 。

」능-Z그 뉴」〈·」띠〈

D

Fig. 1. Serum AST and ALT lev e1 in the four experi- mental groups of

at피nals.

Ea ch value is the mean

i::

SD of five rats. Serum AST and ALT level was significantly higher in group C&D compared to group A&B (p<O.OOl) and was significantly lower in group D com- pared to group C (*p<O.05).

A (control) , B (control+zinc treatment) , C (CCk treatment) and D (CC14+zinc

σeatment).

모든 결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 네 간의 혈청

AST, ALT

및 아포토시스 세포 수의 교는 일원분산분석 (ANOVA)을 시행하였고， 각 군 간 측정치의 유의한 차를 사후검정하기 위해

Tur- key

다중비교분석 (뻐st

hoc multiple

comparison)을 실시하였다. 사염화탄소 처치군과 사염화탄소+아연 처치군에서의 지방변성세포수， 교원질함량， TGF-ß1- 양성세포 수의 비교는 Student T -test를 하여 유의성 을 검정하였다. 두 방법 모두 p값이

0.05

이하일 경 우 유의한 것으로 판정하였다.

군 비

6.

통계분석

켜 를 과

ill.

빼

C 0

Experimental Groups

Fig. 2A- C. Fatty

c뼈nges

of hepatocytes in CC14-treated

r없

1ivers. A. only CC14-treated group (group C) B.

CC14+zinc

^π'eated

group (group D). Hematoxylin and Eos in staining , Xl00. C. The number of fat- ty changed hepatocytes was significantly lower in group D compared to group C (***p<O.OOl).

800 E 700

등 600 ^!

핑 500 I

딩 400 ' 달 300

f5

m 200 ^• 효 100

~ 0

C

1.

AST와

ALT

값의 변화 및 지방변성 세포 수의 변화

각 군별 혈청 AST와

ALT

값은

Fig.

1 과 같다.

AST

값은 A군 (대조군)과 B군 (대조군+아연)은 각각

85.80:t5.79 IU /L, 8 1. 80:t2.16

IU/L이어서 두 군 간의 차이가 없었으나

(p = ns) ,

C군 (처치군)과 D군 (처치 군+아연)은 각각

113 1. 00:t400.83 IU/L, 617:t 384 .4 0

IU/L로 대조군에 비해 처치군에서 통계학적으로 유 의하게 증가하였다 (p<O.OOl

, p<0.05).

C군과 D군

AST

값의 비교에서 C군에 비해 D군에서 통계학적 으로 유의하게 감소하였다 (p<0.05). ALT 값은 A군 (대조군)과 B군 (대조군+아연)은 각각 28.80:t2.28

IU/L, 30.80:t2 .4 9

IU/L이어서 두 군 간의 차이가 없었

으나

(p = ns) ,

C군 (처치군)과 D군 (처치군+아연)은 각각 936.20:t

326.60 IU/L , 526 .4 0:t395.77

IU/L로 대 조군에 비해 처치군에서 통계학적으로 유의하게 증

3.

아포토시스 세포 수의 변화

간조직내의 TUNEL- 양성 세포의 핵 염색성은

Fig.

4A， B와 같다. 아포토시스에 의한

DNA

단편화를 보 이는 간세포는 핵이 강한 적갈색으로 염색되었다. 이 반응은 핵에서만 봄 수 있었고， 세포질에서는 관찰되 지 않았다. 또한 TUNEL- 양성 반응은 지방변성 세포 핵에서도 나타나기도 하였으나 대부분 지방변성세포 가 아닌 세포들에서 관찰되었다.4군의 실험군에서의 1 빼 당 아포토시스 세포 수 (apopt아ic cell number) 는 그림 2와 같다.A군은 5.02i:2.3/m따이 었고， B군은 2.3 i:0.57/빼이어서 A군에 B군이 고사 세포 수가 다소 낮게 나왔으나 통계학적 의의는 없었다

(p = ns).

이에 대해 C군은 19.1 5 i:4.14/빼， D군은

11.87

i:3.15/빼 이어 서 C군은 A군에 비해 통계학적으로 매우 유의하게 증가하였고

(p<0.05),

D군 역시 B군에 비해 통계학적 으로 매우 유의하게 증가하였다

(p<0.05).

C군과 D 군 과의 비교에서는 C군에 비해 D군에서 통계학적으로 유의 한 감소를 보였다

(p<0.05) (Fig .4 C).

2.

간조직내 교원질 함량의 변화

간조직의 교원질 염색을 위한 Masson trichrome 염

색은

Fig. 3A,

B와 같다.A군과 B군의 경우 문맥부

위 (portal)와 중심 부위 (central) 에 만 교원 질 침 착을 관찰할 수 있었다. 이에 대해 C군과 D군에서는 지 방변성을 일으킨 간세포의 분포를 따라 문맥주변부 위

(periportal ),

중섬주변부위

(pericentra l) ,

중심부-중 심부

( central-central) ,

문맥부-문맥부 (portal-portal) 그 리고 문맥부-중심부 (portal-central) 에 교원질의 침착 이 관찰되었다

(Fig.3).

그러나 C군에 비해 D군에서 전반적으로 그 양이 감소하는 경향을 보였다.

이를 다시 확인하기 위하여 영상분석기를 이용하 여 C군과 D군에서 문맥부위와 중섬부위를 제외한 부위의 교원질 양의 정량적 검사결과 C군

(0.76 i:

0.48%) 에 비해 D군

(0.29 i: 0.2

%)에서 통계학적으로 유의한 감소를 나타내었다

(p<0.05)(Fig. 3C).

lIiI

B C

Experimental groups

야ω

a

년 mω

5

o

fE~」φQEg느교Q Q-5E。(냥닥

*

T|ll

C D 1.4

*

¹²

I QJ

앙 1

。

ü 0.8

。

동 0.6

I

8

^0.4

QJ

>

굶 02

I m 0

D

Fig. 4A- C. TUNEL-positive cells (arrow) in CCldreated livers. A. only CC4-treated group (group C) B.

CC4 + zinc treated group (group D). TUNEL staininig , X200. C.

까le

apoptotic cell numbers in liver section was

signific때tly

lower in group C compared to group A and higher in group D compared to group C (*p<O.05).

C

Experimental group

Fig. 3A- C. Fibrotic changes in CC14-treated rat livers. A. only CC4-treated group (group C) B. CC14 +ZÍnc treated group (group

D).πle

Collagen fibers were

disπibuted

along the fatty changed hepatocytes.

Masson’s

σichrome stai피ng，

Xl00. C. The rela- tive content (%) of collagen in liver section was significantly lower in group D compared to group C (*p<O.05).

C

화 를 고

세포

N.

TGF-ßl

양성 처치군에서의

4.

사염화탄소

본 연구에서는 사염화탄소를 4 일 간격으로 2회 주입하여 유발된 급성 간손상에서 대조군에 비해 혈청 AST와 ALT에 뚜렷한 증가를 보였으며， 처치 군에서도 사염화탄소 투여군 (C군)에 비해 사염화 탄소+아연 (D군) 투여군에서 AST의 경우 뚜렷한 감소를 보였고，

ALT

경우는 통계학적 의의는 없었 으나 감소하는 경향을 나타내어 아연이 급성 간 손 상을 억제하는 것으로 나타났다. 간 손상의 형태학 적 지표로 지방변성을 일으킨 세포 수를 비교한 결 과에서도 C군에 비해 D군에서 지방변성 간세포 수 가 뚜렷이 감소하는 경향을 보여 생화학적 결과와 일치 함을 확인할 수 있었다. 이 러 한 결과는 알코올 성 간경변， 정도가 약한 알코올성 간질환， 만성 바 이러스성 간염에서 섬유화 진행정도에 따라 아연의 농도가 감소한다는 보고

(Berrym et al , 1990;

김 등，

2(0)를 뒷받침하는 것으로서， 아연을 주입함으로써 간세포 손상을 억제할 수 있다는 것을 보여주는 결 수의 변화

면역조직화학 결과

TGF-ßl

양성 세포수는 C군에 서

14.08 :1:

12.l 3/rnnf이었고， D군에서는

9. 32 :1:

8.65/rnnf 이 어서

(Fig.5A , B)

사염화탄소만 투여한 군 (C군)에 비 해 사염화탄소+아연 투여군 (D군)에서 통계학적으 로 유의 한 감소를 보였다

(p<0.05)(Fig.5C).

과이다.

사염화탄소가 간손상과 간섬유화를 어떠한 기전 에 의해 일으키는가에 대해서는 명확하게 알려져있 지 않으나， 연구에 의하면 사염화탄소 (CC14)가 간세 포내 의

microsomal cytochrome

P450에 의 해 삼염 화 메틸 자유라디컬 (CCh-)를 형성하고 그 결과 삼염화 메틸과산화라디컬 (CCh02-) 를 생성되어 직접 혹은 간접적으로 세포막 지질이나 다른 분자들에 손상을 유발한다는 것 이 다

(Diazanzi & Poli , 1985).

이 와 관 련하여 만성 간염과 간경변에서 아연의 결핍은 자 유기에 의한 손상과 관련이 있는 것으로 알려져 었 다. 그 이유로 아연이 결핍된 흰쥐에 비타민 E를 투 여하면 아연결핍 증상이 사라지며

(McClain , 1991) ,

아연결핍 쥐를 대상으로 고압산소를 투여하여 산화 스트레스에 의한 폐손상을 일으킬 경우， 아연을 투 여함으로써 예방될 수 있다는 보고가 있다

(Arora &

Gores , 1996; McClain , 1991).

이는 아연이 항산화제 로서 중요한 기능이 있음을 의미하며， 따라서 세포

*Tl빼ll

D

Fig. 5A-C. TGF-ß 1 positive cells (arrow) in CCldreated livers. A. o n1 y CC1

₄

-treated group (group C) B.

CCk + zinc treated group (group D). TGF-ß 1 immunoreactivity was mainly observed in the fatty chaged cells. TGF-ß 1 immunostaining , Xl00. C. The number of TGF-ßl positive cells was

signific때tly

lower in group D compared to group C (*p<O.05).

Experimental group

C

α

30

틀 25

‘~

^(f)

공

20

Q

열 15

(f)

g

10 i

,.-

〈다 j

냥 5 1

ζ 0 1

C

막을 안정 화시 켜 지 방과산화를 막고， 약물의 독성 대사물 생성에 관여하는

cytochrome

P450을 감소시 키므로써 간손상을 억제하는 것으로 생각된다.

본 연구는 짧은 기간 쥐에 사염화탄소를 투여했을 때 간세포의 아포토시스의 영향을 조사하기 위해 고 안된 것이다. 우리의 결과에서는 사염화탄소 투여

8

일에서도 교원칠 합성이 증가됨을 확인할 수 있었으 며， 이 소견은 간세포의 아포토시스의 증가와도 일 치하였다.

TUNEL

실험결과 대조군의 간세포의 아포 토시스 세포 수는 매우 낮은데 비해 사염화탄소 처 치군에서는 4배 가까이 증가하였다. 이 결과는 간세 포의 괴사가 발생되기 훨씬 전부터 아포토시스와

DNA

분절이 시작한다는 결과와 일치한다

(Kurose et al , 1997; Ray et al , 1996).

이 에 대 해 사염 화탄소+아 연 처치군에서는 사염화탄소 처치군에 비해 간세포 의 아포토시스 수가 감소하는 경향을 나타내었는데，

이는 대부분의 동물에서 아연이 몇 종류의 세포에 대하여

DNA

분절이나 아포토시스에 대한 억제 효과 가 있으며 (W따ing

et al , 1990; Shimuze et al , 1991) ,

아연은 Ca2+

, Mg2+-dependent

endonuclease의 활성을 억제하여 DNA의 단편화와 아포토시스를 감소시킨 다는 결과

(Wyllie ,

1980)를 확인하는 것이다. 이러한 결과는 사염화탄소에 의한 간섬유화는 간세포의 괴 사가 이루어지기 전에 또는 괴사 시작과 함께 아포 토시스에 의해서도 영향을 받을 수 있는 것을 의미 하는 것이다. 이 것은 Fig.3， 4 에서 보는 바와 같이 간 세포의 아포토시스 부위와 지방변성세포의 출현부 위를 따라 섬유성 격막이 형성되는 것으로도 확인할 수 었였으며， 최큰 연구에서와 같이 사염화탄소 투 여 쥐에서 간세포의 아포토시스 부위와 섬유성격막 생성부위가 해부학적으로 일치한다는 것을 입증한 것 이 다

(De Bleser et al , 1997).

또한 우리의 실험에서 사염화탄소 처치군과 사염 화탄소+아연 처치군에서의 교원질 양을 비교한 결 과 사염화탄소 처치군에 비해 사염화탄소-아연 처 치군에서 감소하였다. 이는 간세포의 아포토시스가 어느 정도 초기 간섬유화에 관여하고 간경변증으로 발전하는 시초가 될 수 있으며， 아연 투여는 간세포 의 아포토시스를 억제함으로써 간섬유화의 진행을

막는 치료적 효과가 있음을 시사하는 소견이다.

사염화탄소에 의해 간세포가 손상되면 지질과산 화에 의해 생성된 활성 알데하이드는 교원절 유전 자의 발현을 증가시 키 고

(Bedossa et

띠，

1994) ,

간성 상세포의 활성화 및 증식에 관여하며

(Lee et al ,

1995) ,

쿠퍼세포를 자극하여 TGF-ßl 과 같은 섬유화

성 사이토카인의 분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있다

(Kamimura et al , 1992).

TGF-ßl 은 세포의 성장과 대사를 조절하는 사이 토카인의 하나로 조직의 손상 및 염증반응 이후에 세포외기질의 생성에 중요하며， 항

TGF-ßl

항제로

TGF-ßl

작용을 억제하면 간섬유화가 억제된다고

보고되 어 있 다

(Matsuoka & Tsukamoto , 1990; Cas- tilla et al , 1991).

또한 만성 간질환이 나 간경 변증의 경우 간조직내의 백혈구나 간질세포에서 TGF-ßl 의 발현이 증가하며， TGF-ßl 이 간섬유화 유발 및 아포 토시스에 중심적 역할을 한다

(Oberhammer et al , 1993; Takiya et al , 1995).

따라서 TGF-ßl 의 증가는 간섬유화의 시작과 매우 빌접한 관련이 있을 것으 로 판단되어 TGF-ßl 에 대한 면역조직화학적 염색 을 해본 결과 대조군에 비해 사염화탄소 투여군에

서

TGF-ßl

양성 세포가 뚜렷이 증가하였으며， 사염

화탄소+아연 투여군에서 감소하는 경향을 나타내어 TGF-ßl 은 간손상 초기에 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 아연 투여와도 직간접적인 관련이 있을 것이라는 결과를 얻을 수 있었다.

이상의 결과 종합하여 보면 간세포의 아포토시스 는 사염화탄소 유도 간섬유화의 초기 단계에서도 증가하고， 사염화탄소의 투여에 의한 간세포의 아 포토시스 및 세포손상의 결과 쿠퍼세포 및 기타 세 포들을 자극하여 TGF-ßl 분비를 촉진시킴으로서 간 성상세포를 활성화하여 간에 세포외기짐을 과잉 생 산하여 간섬유화가 발생된다는 것을 가정할 수 있 었다. 이 과정에서 아연은 초기 간세포의 아포토시 스를 억제함으로써 쿠퍼세포 등에 의한 TGF-ßl 분 비 및 간성상세포의 활성화를 억제하여 궁극적으로 간섬유화를 억제할 수 있을 것으로 생각되었다. 따 라서 암으로 간섬유화에 있어서 아연의 치료적 효 과에 대한 보다 진전된 연구가 요망된다.

v.

결 로 」

본 연구는 사염화탄소로 유도된 간질환의 초기단 계에서 간세포의 아포토시스가 증가 여부 및 아포 토시스의 억제가 아연의 간보호효과와 관련이 있는 지를 확인하고， 아포토시스와 TGF-ß1 과의 관련성 을 조사하여 아포토시스와 초기 간섬유증 발생 사 이의 관련성을 규명하기 위한 것이다. 본 연구에서 는 실험동물로

Wistar

수컷 흰쥐를 20마리를 10마리 씩 대조군과 사염화탄소 처치군(복강투여)의 두 군 으로 나눈 후， 다시 각 군에서 5마리씩 두 군으로 나누어 기본 식이군과 아연투여군(구강주입)으로 나누어 모두 네 군을 대상으로 혈청

AST , ALT

농 도， 간세포의 지방변성세포 수， 교원질 함량， 아포토 시스-양성세포 수， TGF-ß1- 양성세포 수를 조사하였 다. 그 결과 혈청 AST와

ALT

농도는 대조군에 비 해 사염화탄소 처치군에서 뚜렷이 증가하였으며，

사염화탄소 처치군에 비해 사염화탄소+아연 처치군 에서 감소하였다. 또한 간세포 손상에 대한 아연의 영향을 보기 위해 사염화탄소 처치군과 사염화탄소 +아연 처치군에서 지방변성세포 수를 비교한 바 사 염화탄소 처치군에비해 사염화탄소+아연 처치군에 서 뚜렷한 감소를 나타내었다. 교원질 함량변화에 있어서 사염화탄소 처치군에서 대조군에 비해 뚜렷 한 증가로 보였으며， 지방변성세포 분포를 따라 출 현하였으며， 사염화탄소 처치군에 비해 사염화탄소 +아연 처치군에서 감소하였다. 아포토시스 세포 수 에 있어서는 대조군에 비해 사염화탄소 처치군에서 뚜렷이 증가하였으며， 사염화탄소-아연 처치군에서 는 사염화탄소 처치군에 비해 감소하였다.

TGF-ß1-

양성세포 역시 대조군에 비해 사염화탄소 처치군에 서 뚜렷이 증가하였하였으며， 사염화탄소+아연 처 치군에서는 사염화탄소 처치군에 비해 감소하였다.

이상의 결과는 사염화탄소 유도에 의한 간세포의 아포토시스는 간섬유화의 초기 단계에서 간세포의 아포토시스가 관여하며， 간세포의 아포토시스는 간 세포의 괴사와 함께 쿠퍼세포 및 백혈구들을 자극

하여

TGF-ß1

분비를 촉진시키고， 이로 인해 교원질

을 포함한 세포외기질이 증가함을 알 수 있었다. 따

라서 아연의 투여는 간섬유화 초기단계에서 간세포 의 아포토시스와

TGF-ß1

분비를 억제함으로써 간 섬유화 억제에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.

잠고문흰

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