DOI 10.17480/psk.2017.61.1.18
담즙정체성 간섬유증에서 헬리코박터 파일로리균 감염의 병리효과
노윤석* · 임채웅** · 김범석**
*충북대학교 약학대학, **전북대학교 수의과대학(BK21 PLUS Program)
(Received January 6, 2017; Revised January 30, 2017; Accepted February 1, 2017)
Helicobacter Pylori Exacerbates Cholestasis-induced Hepatic Fibrosis by Control of Regulatory T Cell and TLR4 Responses
Yoon-Seok Roh*, Chae Woong Lim**, and Bumseok Kim**
*Chungbuk National University College of Pharmacy, Cheongju 28644, South Korea
**Laboratory of Pathology, College of Veterinary Medicine and Biosafety Research Institute (BK21 Plus Program), Chonbuk National University, Iksan 54596, South Korea
Abstract — Accumulating evidence implicates Helicobacter pylori (H. pylori) could be an exacerbating factors in liver dis- eases. However, local hepatic immune response induced by H. pylori infection is poorly understood. To clarify immu- nopathological effect of H. pylori infection on the progression of hepatic fibrosis, C57BL/6 mice were orally inoculated with H. pylori (1×108 CFU/100μl) for 16 weeks and liver fibrosis was then induced by bile duct-ligation (BDL). H. pylori infection induced increased number of regulatory T cells (Tregs) in the liver, chronic hepatitis, and upregulation of profibrogenic cyto- kine (TGF-β and IL-6) levels in the liver. In addition, the expression of MCP-1, MIP-1α and RANTES, potent mediator of macrophage and T lymphocyte recruitment, were increased in H. pylori-infected liver. Consistently, we found that H.
pylori+BDL-treated mice had enhanced hepatic fibrosis and fibrogenic immune responses compared to BDL-treated mice.
Finally, H. pylori–induced profibrogenic responses were significantly suppressed in TLR4 knockout mice, indicating that H.
pylori-induced liver fibrosis is dependent on TLR4 signaling. These results are in line withthe conclusion that H. pylori-asso- ciated Treg and TLR4 responses are, at least in part, responsible for the development of liver fibrosis.
Keywords H. pylori, Liver Fibrosis, TLR4, Treg
서 론
헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori)은 그람 음성 세균 으로 만성위염 및 위궤양, 위암의 중요한 원인체로 잘 알려져 있 다.1)흥미롭게도 헬리코박터 파일로리균의 위장 내 감염과 만성 간 질환과의 상관관계의 가능성을 시사하는 보고들이 발표되어 왔다.2-4)특히 헬리코박터 파일로리균 감염환자군이 비감염환자
군에 비해서 간경화의 유병률이 유의적으로 증가됨이 확인되었 다.5,6)동물실험을 통한 결과에서도 헬리코박터 파일로리균 감염 이 사염화탄소(CCl4)에 의해 유도된 간섬유화를 증가시키는 것 으로 보고되었다.7)이러한 결과들은 헬리코박터 파일로리균이 간 질환의 병리기전에 관여할 수 있다는 것을 시사한다. 간섬유화 (Liver Fibrosis)는 지방간(Fatty liver, NASH), 감염 및 독성물질 로 인한 간세포의 손상 및 염증반응의 치유과정에서 발생되는 병 리현상으로 알려져 있다. 하지만 과도한 간섬유화는 간기능의 부 전을 유도하기 때문에 임상적으로 중요성을 가진다.8)현재까지 간섬유화 및 간경화의 치료제가 개발되지 않은 것 현실이며 간 이식(Liver Transplant)이 유일한 근본적인 치료법으로 알려져 있 다. 세포 수준에서는 간성상세포(Hepatic Stellate Cell, HSC)가 활성화되어 생산하는 세포외기질(Extra Cellular Matrix, ECM) 이 축적되어 발생하는 것으로 알려져 있다.9)
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Corresponding Author Bumseok Kim, D.V.M., Ph.D.
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aboratory of Pathology, College of Veterinary Medicine and Bio- safety Research Institute (BK21 Plus Program), Chonbuk National University, Iksan 54596, South Korea
Tel.: 02-63-850-0953 Fax.: 02-63-850-0910 E-mail: [email protected]
Short Report
종설간섬유증에서 헬리코박터 파일로리균의 면역병리학적 작용 19
일부 연구에서 헬리코박터 파일로리균이 간손상을 일으킬 수 있으며 그 유전자의 존재를 PCR을 통해 증명되었다.10) 뿐 만 아 니라 헬리코박터 파일로리균에 2년동안 감염된 마우스에서 원발 성 간암이 발생되었다는 보고가 있다.11)하지만 헬리코박터 파 일로리균에 의한 간질병의 면역병리학적 연구는 미비하다. 따라 서 본 연구에서는 실험적으로 총담관결찰에 의한 간손상시에 헬 리코박터 파일로리균 감염에 의한 면역병리학적 기전을 규명하 고자 한다.
실험방법
헬리코박터 파일로리균의 준비
헬리코박터 파일로리균주(H. pylori Sydney Strain, SS1, cagA+, vacA s2-m2 strain)는 경상대학교 헬리코박터 파일로리 분리균주 은행에서 분양 받아 실험적인 감염에 사용하였다. 헬리코 박터 파일로리균은 Brucella broth 배지(Difco Labora-tories, Detroit, MI, USA)에 7% fetal bovine serum(HyClone Laboratories, Logan, Utah, USA), Helicobacter selective antibiotic mixture(OXOID, Basingstoke, England)을 첨가하여 배양하였다. 배지에 접종한 H.
pylori는 100 rpm으로 진탕하면서 37oC, 9% CO2의 조건에서 배 양하였다. 본 실험에 사용한 균은 Diff Quick 염색으로 간균의 형태를 확인하고 매번 urease 양성임을 확인하고 사용하였다.
간염 및 간섬유화 유도
야생형(wild type) C57BL/6 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 같은 계통(strain) 의 TLR4 유전자 결여(knock-out, KO) 마우스는 Shizuo Akira (Osaka University, Suita, Japan)로부터 제공받았다. 12시간의 명암 주기가 유지되는 온도 22±2 습도 55±5%의 조건에서 사육되었 다. 본 연구에서 명시된 실험동물의 관리 및 사육에 관한 사항은 전북대학교 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 인증을 받았다. 간염을 일으키기 위하여 6~7 주령의 C57BL/6 마우스에 1.0×108 CFU/100μl의 헬리코박터 파 일로리균(H. pylori)을 격일 간격으로 16주간 경구 투여하였다.
간섬유화는 헬리코박터 파일로리균을 16주간 경구투여 받은 마 우스를 수술적으로 총담관을 결찰하고 회복시킨 후 2주 후부터 광학현미경(BX-51, Olympus Corp., Tokyo, Japan) 및 분석 프로 그램(analySIS TS, Olympus Corp., Tokyo, Japan)을 이용한 조 직병리학적(Haematoxylin & Eosin염색) 분석을 통하여 실시하 였다.
Sirius Red 염색에 의한 간섬유화 분석
Direct red 80 and Fast-green FCF(color index 42053, Sigma- Aldrich Diagnostics, St. Louis, MO, USA) 를 이용하여 간조직 절
편을 염색한 후 적색으로 염색된 콜라겐 섬유 영역을 전체 조직 에서 대한 비율로 분석 및 계산하였다. 광학현미경(BX-51, Olympus Corp., Tokyo, Japan) 및 분석 프로그램(analySIS TS, Olympus Corp., Tokyo, Japan)을 이용한 조직병리학적 분석을 통하여 실시하였다. 결과는 현미경 사진 전체 영역에서 Sirius- Red 양성 영역의 비율로 표현하였다.
mRNA 발현량 측정
헬리코박터 파일로리균의 항원 및 각각의 TLR의 발현을 그룹 간에 비교하기 위하여 primer를 제작하여 SYBR Green 측정방 법(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)에 의하여 mRNA의 양을 분석하였다. 다른 Foxp3 발현도 특이 primer를 제작하여 mRNA 발현량을 측정하였다. Primer들의 정보는 기존의 검증된 논문들 의 primer를 사용하였다.12-15)
Cytokine측정을 위한 ELISA
RAW 264.7(ATCC® TIB71™) 세포주는 10%의 FBS를 포함 한 DMEM 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 배 양을 하였다. 24 well culture plate에서 계대배양을 시작한 후 70%의 합류(confluency)에 도달하면, 헬리코박터 파일로리균 분 쇄물, LPS(L4391, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 Zymosan(Z4250, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가 하였다. 첨가후 24시간 추가배양 후에 상등액에서 ELISA를 통 하여 cytokine의 양을 측정하였다.
자극된 CD4/CD8 T 세포 및 대식세포에서 생산되는 cytokine 의 양은 culture medium에 존재하는 IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12를 ELISA kit(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정하고자 하는 cytokine Ab 로 coating된 ELISA plate를 PBS-Tween20으로 3번 씻어낸 후, 3% nonfat-dried milk로 blocking하였다. 다시 PBS-Tween20으 로 씻어내고 culture medium과 cytokine standard 용액을 처리 한 후, biotinylated cytokine Ab를 처리하였다. ELISA plate는 peroxidase-conjugated streptavidin과 함께 배양한 후, substrate 를 이용하여 발색 후 cytokine의 농도를 계산하였다.
CD4+CD25+ regulatory T 세포(Foxp3+) 분석
CD4+CD25+ regulatory T 세포(Treg)의 분석은 CD4-FITC (RM405), CD25-APC(PC61.5) antibody(eBiosciences, San Diego, CA, USA)를 이용하여 분석하고, CD4+CD25+ Treg 세포중 Foxp3 발현은 anti-Foxp3(FJK-16s) antibody-PE(eBiosciences, San Diego, CA, USA)를 이용하여 intracellular staining에 의하여 분석하였 다. 분석장비는 FACS Calibur(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 를 활용하였다. 또한 결과의 분석은 CellQuest 3.1 또는 Flowjo 7/8 프로그램을 활용하였다.
필요에 따라 Real-time PCR을 활용한 SYBR Green 측정방법 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)에 의해 FoxP3의 발현량을 분 석하였다.
통계분석
모든 데이터는 평균±S.E.M.으로 표시하였다. 다중그룹의 통 계처리를 위해 SAS version 9.1(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하여 각각의 그룹간의 비교는 Duncan’s Multiple Range Test(DMRT)를 이용하였다. 두 그룹간 차이는 two-tailed Student’s t-test를 통해서 수행하였다. 통계적 유의성 검정은 p<0.05를 기준으로 하였다.
실험결과 및 고찰
간에서 헬리코박터 파일로리(H. pylori)균 감염에 의한 Regulatory T(Treg)세포반응 및 염증반응 유도
본 연구팀에서는 과거에 간내 Treg 세포의 항섬유화 기능을 보고하였다.13,14)즉 간손상시에 신체내 보호작용 기전의 하나로
Treg 세포가 유도되는 것으로 사료된다. 본 실험에서 간에서 또 한 헬리코박터 파일로리균에 의한 Treg 세포 유도 여부를 조사하 고자 간의 비실질세포(Non Parenchymal cell, NPC)에서 Treg 세 포를 Flow cytometer를 이용하여 분석하였다. 6~7주령의 C57BL/6 마우스에 1.0×108 CFU/100μl의 헬리코박터 파일로리 균을 16주간 격일로 구강 투여한 후 간조직을 채취하여 균질화 하 고 Percoll을 이용하여 농도구배 원심분리를 하여 간의 NPC를 분 리하였다. Flow cytometer 분석을 통하여 헬리코박터 파일로리 균 감염 시에 간내의 CD4+Foxp3+ Treg 세포의 비율이 유의적 으로 증가됨을 확인하였다(Fig. 1a-1b). 병리조직학적 검사에서 헬리코박터 파일로리균 감염에 의한 염증세포의 침윤이 관찰되 었다. 특히 문맥주위의 염증소는 파괴된 담관상피와 염증세포가 혼합된 파괴성 담관염(Destructive Cholangitis)으로 판단된다 (Fig. 1c). 간섬유화를 유도하는 기전에 관여하는 염증성 싸이토 카인 및 케모카인(IL-6, TGF-β, MCP-1, MIP-1α, RANTES) mRNA 발현을 간조직에서 분석할 결과, 헬리코박터 파일로리균 감염에 의해 이들의 발현이 유의적으로 증가되었다(Fig. 1d). 본 결과를 종합해볼 때 헬리코박터 파일로리균의 감염으로 다양한
Fig. 1 − H. pylori infection induced immune responses in the liver. (a) Representative flow cytometric analysis of the percentage of FoxP3+ in the
gated population of CD4+ cells. (b) Graphical representation of the frequency of regulatory T cells among CD4+ T cells in liver. (C)
Representative result of histopathological examination of liver in non-infected or H. pylori-infected mice. HE, Bar=100 μm. (d) Expression
of Treg marker, profibrogenic cytokines and T cell recruitment- mediated chemokines in the liver of two groups. Messenger RNA amounts
were determined by real-time qPCR and are presented as GAPDH-normalized expression. *P<0.05, **p<0.01 by t-test.
간섬유증에서 헬리코박터 파일로리균의 면역병리학적 작용 21
염증반응이 유도되는 것으로 사료되며, Treg 세포는 생체내 보 호작용 기전에 의해 증가되는 것으로 추측된다.
총담관 결찰술(common bile duct ligation, BDL)에 의해 유 도된 간손상 모델에 헬리코박터 파일로리균의 감염이 미치는 영향
총담관(Common Bile Duct)을 결찰하여 폐쇄성 황달을 유발 시킨 후 11일을 경과시키면 중등도의 담즙정체성 간섬유증이 유 발되며 헬리코박터 파일로리균을 감염시켜 실험군간의 섬유화 정도를 Sirius Red염색을 통한 조직병리학적 분석을 통해 실시 하였다. Fig. 2a, 2b에서 보이는 것처럼 비감염군에 비해서 헬리 코박터 파일로리균을 감염시킨 실험군의 간조직에서는 콜라겐의 축적이 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 실험군에서 대조군에 비해서 친섬유화성 인자인 α-SMA 및 TGF-β, TLR4 발현의 증 가가 관찰되었다. 또한 쿠퍼세포(Kupffer cell)과 간성상세포(HSC) 는 다양한 케모카인을 분비하며, 또한 다양한 수용체의 활성화 에 의해 간섬유화가 유발되는 것으로 알려져 있다.16,17) Figure 2c에서와 같이 염증성 케모카인(MCP-1, MIP-1α, RANTES)의 발현 또한 실험군에서 대조군에 비해서 유의적으로 증가되었다.
결과적으로 헬리코박터 파일로리균 감염은 염증반응을 유발하며 순차적으로 섬유화작용을 증가시키는 것으로 사료된다.
헬리코박터 파일로리균에 의한 TLR4 신호기전 활성화 간손상시에 장내 세균 구조물의 간으로 이동(Bacterial Translocation)은 간내 염증반응 및 섬유화 유도에 중요한 기전으 로 알려져 있다.18)이러한 결과와 일치하게, 복합 항생제를 처치 한 실험군에서 대조군에 비해 총담관 결찰술에 의한 섬유화 및 염증반응(Col1α1, α-SMA, CD11c, TGF-β)이 현저하게 감소되 었다(Fig. 3a). 즉 LPS와 같은 장내 세균의 구조물이 간섬유화 작용에 중요한 기능을 하는 것으로 사료된다.19)
이러한 결과를 토대로, TLR4 결손 마우스를 이용하여 간섬유 화 유도실험을 수행하였다. Fig. 3b에서와 같이 헬리코박터 파일 로리균에 의한 염증유도반응이 TLR4 결손 마우스에서 나타나지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 헬리코박터 파일로리균에 의 한 염증반응은 TLR4 매개로 일어나는 것으로 사료된다.
마지막으로 다양한 TLR을 발현하는 대표적 항원제시세포 (Antigen Presenting Cell, APC)인 대식세포에서 헬리코박터 파
Fig. 2 − H. pylori exacerbate hepatic fibrosis (a) Representative result of histopathological examination of liver in non-infection or H. pylori-
infection followed by BDL for 14 days. Collagen fiber stained with Sirius red were quantified using digital image analysis. Sirius Red,
Bar=200 μm (b) Graphical representation of the percentage of sirius red-stained areas in two groups. (c) Expression of Treg marker,
profibrogenic markers and T cell recruitment- mediated chemokines in the liver of two groups. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 by
t-test.
일로리균에 대한 반응을 관찰하기 위해 그람음성 및 양성 세균 유래의 대표적 TLR 리간드인 LPS와 Zymosan과 비교분석 하였 다. Raw264.7 대식세포(1×106 cells/ml)를 Fig. 3c에 명시된 농 도의 리간드들과 24시간 배양후에 상층액을 채취하여 ELISA를 이용하여 상층액내 존재하는 사이토카인의 농도를 측정 하였다.
헬리코박터균의 분쇄물은 순수한 리간드로만 구성되지 않았음에 도 불구하고 LPS 및 Zymosan과 대등한 IL-6 및 TGF-β의 생산 을 유발시키는 것으로 관찰되었다.
결과를 종합해볼 때 친섬유화성 수용체로 알려진 TLR4는 장 내세균의 LPS 뿐 만 아니라 헬리코박터 파일로리균의 LPS에 의 해서 활성되는 것으로 추측되며 이러한 기전이 간섬유화를 증가 시키는 것으로 사료된다.
결 론
헬리코박터 파일로리균은 그람 음성세균으로서 간내 감염으로 인해서 다양한 친섬유화성 염증반응의 활성화 및 염증세포의 TLR4 신호기전의 활성화로 인하여 간섬유화 작용을 증가시키는 것으로 사료된다. 본 결과를 토대로 간경화환자에게서 헬리코박
터 파일로리균 감염에 대한 면역병리학적 중요성이 크다는 것을 시사한다.
감사의 말씀
이 논문은 2009, 2014년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(2009- 0064313, 2014R1A1A1006622).
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Fig. 3 − H. pylori-induced profibrogenic responses are dependent on TLR4. (a) Expression of profibrogenic markers in the liver of two groups
(Control vs. Antibiotic-treated). (b) Expression of profibrogenic markers in the liver of two groups (WT vs. TLR4 KO) (c) Production
of IL-6 and TGF-β in macrophage in response with sonicated H. pylori products, LPS and Zymosan. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
by t-test. Different letters indicate significant differences (p<0.05) according to DMRT.
간섬유증에서 헬리코박터 파일로리균의 면역병리학적 작용 23
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