접수일：2011년 5월 20일, 수정일：2011년 7월 20일, 승인일：2011년 8월 5일
혼합시야반응을 보이는 AB형 신생아의 ABO 유전자형 분석 1예
김주연ㆍ김하늬ㆍ최재열ㆍ김윤호ㆍ김장수ㆍ김명한ㆍ김영기ㆍ이갑노ㆍ임채승
고려대학교 의과대학 진단검사의학교실
= Abstract =
ABO Genotyping of a Neonate with Mixed Field Agglutination
Ju Yeon Kim, Hanui Kim, Jae-Yeoul Choi, Yoon Ho Kim, Jang-Su Kim, Myung Han Kim, Young Ki Kim, Kap No Lee, Chae Seung Lim
Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea
Mixed field agglutination is an important, but rare phenomenon of ABO blood grouping. Contrary to adults, neonatal red blood cells are immature and they present a weak ABO expression, and sometimes this result in a mixed field agglutination pattern. We report here on a case of a neonate who presented with mixed field agglutination on the ABO blood grouping during serologic testing and the neonate had a normal ABO genotype.
(Korean J Blood Transfus 2011;22:171-176)
Key words: ABO blood group, Mixed field agglutination, Neonate, Genotyping
서 론
ABO 혈액형 검사의 불일치는 혈청학적 검사 시에 혈구형과 혈청형이 다르게 나타나는 현상을 말하는데, 이에 대한 원인은 기술적인 부분을 제 외하면 혈구 측 원인과 혈청 측 원인으로 나눌 수 있다. 혈구 측 원인으로는 ABO 불일치 수혈이나 골수이식, 질병으로 인한 항원성 변화, 획득 B형, 적혈구에 항체 부착된 경우, 심한 태아산모출혈 (chimerism), 다응집(polyagglutination), 비특이적 인 응집 등의 2차적으로 발생하는 경우와 ABO 변이형, cis-AB형의 선천적인 원인에 의한 것이
있다.1,2) 혈청 측 원인으로는 혈청단백의 질적, 양 적 이상과 혈청 내 A, B 물질의 과량 존재, 잔여 섬유소, 자가항체 및 동종항체, 항체 역가의 감 소, 그리고 6개월 미만의 소아의 경우이다.1,2) 성 인과 달리 신생아는 아직 혈액형 발현이 미성숙 하고 분화가 덜 되어 혈액형 검사에서는 이 부분 을 유념해야 하며, 신생아에서 ABO 검사 시 혈구 형을 검사할 때 혼합시야반응을 보일 수 있다. 본 증례에서는 다른 확실한 2차적인 원인이 없고 혼 합시야반응을 보이는 신생아에서 ABO 유전자형 검사를 통해 정상 AB형으로 밝혀진 환자를 보고 하는 바이다.
Table 1. ABO grouping results of the patient and her parents
Cell typing Serum typing
Anti-A Anti-B Anti-A1 Anti-H Anti-AB Anti-D A cells B cells
Father − 4＋ − − 3＋ 4＋ − 4＋
Mother 4＋ − − − 3＋ 4＋ 4＋ −
Patient mf* mf* − w＋ mf 4＋ − w＋
Abbreviations: mf, mixed field agglutination; w, weak.
*The same strength of the mf agglutinins was observed.
Fig. 1. Picture of patient’s cell typing showed mixed field agglutination (×1,000).
증 례
환아는 31주 4일 1,410 g로 산모의 임신 전자간 증으로 본원에서 출생한 미숙한 여아로, 산전 검 사로 염색체 검사 결과 정상 핵형을 가지고 있었 다. 출생 당시에는 헤모글로빈 19.0 g/dL, 헤마토 크리트 56.1%의 정상적인 적혈구검사를 보였으 나, 생후 7일경 갑작스러운 헤모글로빈 감소를 보여 수혈을 위해 혈액형 검사 및 항체선별 검사 를 시행하였다. 환아는 ABO혈액형 검사에서 AB 형 아형으로 의심되는 혼합시야반응을 보였고 항 체선별검사상 음성을 보였다. 환아는 이전에 수 혈력이나 수술 등의 과거력은 없었으며 출생 후 혈소판수가 감소되는 양상과 함께 피브리노겐 감 소, 응고검사 이상 소견 등의 임상 양상을 보여 항트롬빈 III와 예방적 항생제를 투여 받고 있었 다. 또한 심방중격결손증(atrial septal defect)이 관 찰되어 출생 후 관찰하다가 급성 우심실기능부전 증세를 보여 처치하였고, 시술 후 패혈증 및 범발 성 응고 장애로 인하여 사망하였다.
1. 혈청학적 검사
ABO 혈액형 검사는 항-A, 항-B 혈청(Medion Diagnostics GmbH, Berlin, Germany)을 이용한 표 준튜브법과 미세원주응집법(Bioscot, Millipore
Co., UK, Blood typing)을 행하였는데, 환아의 결 과가 두 가지 모든 검사법에서 혼합시야반응을 보여 AB형 아형으로 의심하였고, 환아의 아버지 는 정상 B형, 어머니는 정상 A형의 결과를 보였 다(Table 1). 환아의 검체로 재시행한 ABO 검사 결과도 동일한 양상을 보였다(Fig. 1, 2). Rh(D)혈 액형 검사에서는 양성으로 나타났다.
2. ABO 유전자형 검사
ABO 유전자형 검사는 중합효소연쇄반응-제한 절편길이다형성법(polymerase chain reaction-restric-
Fig. 2. ABO typing result by using microcolumn agglutination test.
Fig. 3. Reactions by (A) Kpn I restriction enzyme and (B) Alu I restriction enzyme. The control sample is represented (C) and the patient’s sample is (P). Each lane shows that the patient has no O allele and cis AB/O alleles.
tion fragment length polymorphism, PCR-RFLP)과 직접염기서열분석을 시행하였다.3) DNA는 Pure- gene Blood Core kit B (Gentra Systems Inc., Min- neapolis, MN, USA)를 이용하여 추출하였다. Primer 는 Fukumori 등4)이 발표한 것을 일부 수정하여 사용하였다. 우선 O형 존재 유무를 판별하기 위 해 261번째 염기를 포함한 exon 6의 특정 부분을 GA16 (5’-AGAAGCTGAGTGGAGTTCCAGGTG-3’)/
GA17 (5’-TGATGGCAAACACAGTTAACCC-3’) 시 발체 쌍을 이용해 증폭하고, 증폭산물에 제한효 소인 Kpn I (SolGent Co., Ltd., Daejeon, Korea)을 5 unit 첨가하여 37oC에서 2시간 반응시킨 후 2.5% agarose gel에서 전기영동을 하였다. 반응 산 물은 절단된 산물이 없었으므로 O형 대립유전자 가 없음을 확인하였다(Fig. 3). 또한 Cis-AB형을 구분하기 위해, GA01N (5’-TCCTGGAGACGG- CGGAGAAGCA-3’)/GA13 (5’-ACCGACCCCCC- GAAGAACG-3’) 시발체 쌍을 이용해 증폭한 후
423 bp 증폭 산물에 제한효소인 Alu I (SolGent co., Ltd., Daejeon, Korea)을 5 unit 첨가하여 37oC 에서 2시간 반응시킨 후 2.5% agarose gel에서 전 기영동을 하였다. 반응 산물에서는 cis-AB에서 나오는, 314 bp의 밴드는 관찰되지 않았다(Fig. 3).
ABO 아형을 구분하기 위해 먼저 exon 7의 염기 서열 분석을 시행하였다. PCR 산물을 수기로 ethanol을 사용하여 정제한 후 GA13/GA01N, GA14 (5’-ACCGACCCCCCGAAGAACC-3’)/GA01N (5’-TCCTGGAGACGGCGGAGAAGCA-3’) 두 개 의 시발체 쌍으로 증폭 후 Sequencher 4.9 (Ap- plied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 염기서 열 분석하였을 때(exon 7, 1∼958 bp까지의 범위) 정상 AB형(A102/B101)으로 판독할 수 있었다 (Table 2).5)
Table 2. Results of ABO genotyping by SNP analysis and direct sequencing
Phenotype Allele specificity Exon7
SNP Seq. 467* 526 657 703 796 803
Ref. AB A1 A101 C C C G C G
(NM 020469) A102 T C C G C G
B B101 C G T A A C
Patient AB A1/B A102 T C C G C G
B101 C G T A A C
Abbreviations: SNP, single-nucleotide polymorphism; Seq., sequencing; Ref., reference.
*Nucleotide used for distinguishing alleles with direct sequencing.
고 찰
ABO 혈액형 검사에서 혼합시야반응이란 A 혹 은 B 응집소로 처리한 부유 적혈구에서 응집이 된 것과 응집이 되지 않은 것이 동시에 관찰되는 반응을 말한다. 이 현상은 두 가지 다른 표현형의 적혈구가 있음을 시사하는데, 모자이시즘(mo- saics), 키메라(chimera), 최근에 혈액형이 다른 사 람으로부터 수혈이나 골수이식을 받은 적이 있는 경우, 혈중에 태아의 적혈구를 가진 산모, 암 등 에 의해 면역학적으로 자극된 T 세포의 변환 등 의 경우에 일어날 수 있다.1,6,7) 또한 한 가지의 적 혈구 항원 표현형을 가지더라도 약한 항원을 가 지는 적혈구이거나 응집소가 저역가일 때 혼합시 야반응을 보일 수 있다.6) 혼합시야반응이 관찰되 면 자세한 병력 청취를 통해 후천적인 원인을 먼 저 찾고, 의심되는 환자의 과거력이나 수혈력이 없으면 가족 혈액형을 조사하고 환자의 유전학적 검사를 시행하여 정확한 원인을 규명해야 한다.
본 증례는 수혈력이 없는 환자가 생후 8일의 Rh(D) 양성 산모에서 태어난 Rh(D) 양성 신생아 인 점을 고려하여 다른 후천적인 원인들을 배제 한 후에, AB형의 아형인지, 키메라 현상에 의한
것인지 감별하기 위해 ABO 유전자형 검사를 실 시하였다. 직접염기서열분석을 통한 결과 환아는 정상 AB형 중에서 A102/B101임을 확인할 수 있 었다. 이전의 연구들에 따르면 키메라일 경우에 도 혼합시야반응을 보이며 유전자형 검사에서 정 상형으로 나와도 minor DNA가 존재할 수 있는 가능성을 완전히 배제할 수는 없다.7-9) 환아의 임 상 상태가 안정하다면 구강 상피 세포나 머리카 락에서도 DNA를 추출하여 단기일렬반복(short tandem repeat, STR) 검사를 시행해 볼 수 있다.8) 또, PCR을 기반으로 하는 검사들의 검출률이 낮 기 때문에 Jeong 등10)이 시행한 유세포 검사법 등 으로 다시 검사해 볼 수 있겠다.10,11) 하지만 위의 모든 검사들이 검출률이 완벽하지 않으므로 마지 막으로, 환자의 나이가 5∼6세 이상이 되어 항원 의 발현이 성숙할 때까지 기다렸다가 혈액형 검 사를 재시행하는 방법이 있다. 하지만 증례에서 도 밝혔듯이 환아는 생후 약 4개월 후에 패혈증 및 범발성 응고 장애로 인하여 사망하여 이에 대 한 더 이상의 검사는 시행하지 못했다. 환아의 혼 합시야반응은 AB형의 아형이나 키메라의 가능 성을 완전히 배제할 수는 없다. 그러나 과거력이 전혀 없는 신생아라는 점, 혈액형 검사소견, 키메
라 현상이 드물다는 점 등을 토대로 키메라의 가 능성은 매우 낮다고 판단하여 신생아에서 적혈구 항원이 약하게 발현되어 혼합시야반응을 보인 것 으로 생각할 수 있었다.
적혈구 항원의 발현은 5∼6주 배아시기부터 일어나는데 출생 후에도 완전히 발현되는 것은 아니며 발현되는 항원의 수도 적다. 신생아의 적 혈구는 어른의 적혈구보다 항-H에 대한 반응도 약하다.6) ABO 혈액형은 적혈구막에 있는 구조에 어떤 말단당(terminal sugar)이 부착되느냐로 결정 된다. 전구물질인 H 항원에 어떤 물질이 어떻게 결합하느냐에 따라 A 혹은 B항원이 결정되는데, N-아세틸갈락토사민(N-acetyl galactosamin:galnac) 이 첨가되면 A 항원이 되고 갈락토스(galactose:
gal)가 첨가되면 B 항원이 된다. H 항원도 전구물 질의 말단 갈락토스의 2번 위치에 푸코스(fucose) 가 첨가되어 만들어진 것이다. 신생아 시기에는 이 결정기들이 미성숙하며 덜 발현되기 때문에 항원성이 약하게 표현된다.1,5,12) 이러한 이유로 인하여 혼합시야반응뿐만 아니라 ABO 신생아 용혈성 질환이 심하게 나타나지 않는 것으로 알 려져 있다. 또 신생아에서는 적혈구의 올리고당 (oligosaccharide)의 분지화(branching)가 성인에 비 해 미성숙하고 구조적으로 선형(linear type)을 이 루고 있어 혼합시야반응을 보이는 것으로 생각된 다. 본 증례처럼 혼합시야반응이 현저하지 않을 수도 있고 환자 개인마다 정도의 차이는 있을 수 있으나 신생아, 특히 미숙아의 혈액형 검사상 혼 합시야반응이 의심되는 상황에서는 ABO 아형이 나 불일치보다는 항원 발달의 미성숙에 의한 가 능성을 먼저 생각하는 것이 옳다고 사료된다. 구 조적인 차이는 나이가 들면서 올리고당(oligo- saccharide)의 분지화(branching)가 증가되고 따라 서 항원의 발현이 증가되어 2∼4세 이상이 되면 성인 수준이 된다.6,12)
혈청학적 검사결과가 애매한 결과를 보이는 경우 혹은 아형이 의심되는 경우에 분자유전학적 검사가 정확한 혈액형을 밝히는데 많은 도움이 되고 있다. 본 증례는 정상 A형과 B형의 혈청학 적 검사 소견을 보이는 부모에서 태어난 신생아 에서 혼합시야반응을 보일 때, 이에 대한 원인을 감별하는데 ABO 유전자검사를 통하여 아형이나 다른 키메라에 의한 가능성보다는 ABO 혈액형 의 미성숙한 항원 발현에 의한 것을 밝힌 경우이 다. 따라서 신생아의 경우 혼합시야반응은 2차적 인 원인이나 혈액형 아형에 의한 현상일 가능성 이 높은 성인과 달리, 미성숙한 항원 발현에 의해 일어날 수 있음을 염두에 두고 유전자 검사를 실 시하여 이를 확인하는 것이 필요하다.
요 약
ABO 혈액형 검사에서 혼합시야반응은 드물지 만 중요한 소견이다. 신생아의 적혈구는 성인과 달리 아직 미성숙하고 발현 정도가 약한 ABO 항 원을 표현하고 있어서 혼합시야반응의 원인이 된 다. 저자들은 혈액형 검사 중 혈청학적 검사에서 혼합시야반응을 보이지만 유전적으로는 정상 AB형을 가지는 증례를 보고하는 바이다.
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