▒ 접수▸2010년 3월 2일 수정▸2010년 3월 23일 채택▸2010년 3월 25일
▒ 교신저자 마진열, 대전시 유성구 엑스포로 483 한국한의학연구원 신한방제제연구센터 Tel 042-868-4666 Fax 042-868-9573 E-mail [email protected]
HPLC를 이용한 고체발효 당귀의 지표성분 분석
엄영란, 이지혜, 마진열
한국한의학연구원 신한방제제연구센터Quantitative Analysis of Marker Substances in Solid Fermented Angelicae Gigantis Radix by HPLC
Youngran Um, Jihye Lee, Jinyeul Ma
Center for Herbal Medicine Improvement Research, Korea Institute of Oriental Medicine
The purpose of this study was investigation of quantitative analysis of marker substances in solid fermented Angelicae Gigantis Radix by High performance liquid chromatography(HPLC). HPLC was performed for determination of nodakenin and decursin in solid fermented Angelicae Gigantis Radix extract, the separation method was performed on C18 column (250 ㎜ × 4.6 ㎜, 5 ㎛, RS tech) using gradient solvent mixtures of water-acetonitrile with photodiode array detector (330 nm). The flow rate was 1.0 ㎖/min. Retention time of nodakenin and decursin was about 11.47, 46.79 min and linearity of calibration was showed good result(r2=0.9999, 0.9999), respectively. Content of nodakenin was 0.76 ± 0.02% in control, 0.31 ± 0.00% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Paecilomyces japonica(SDT)(p<0.01), 0.51 ± 0.02% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Ganoderma lucidum(SYT)(p<0.01), 0.82 ± 0.03% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with honey(SST)(p<0.05) and 0.88 ± 0.01% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Nuruk(SNT)(p<0.01). Content of decursin was 4.50
± 0.08% in control, 2.90 ± 0.05% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Paecilomyces japonica(SDT)(p<0.01), 2.65 ± 0.08% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Ganoderma lucidum(SYT)(p<0.01), 4.46 ± 0.11% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with honey(SST) and 4.73 ± 0.04% in Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Nuruk(SNT)(p<0.05), respectively.
keywords : Angelicae Gigantis Radix, Solid fermentation, Nodakenin, Decursin
Ⅰ. 서 론
발효기술은 최근 한방, 식품 등에서 주목받고 있는 기술 분야로서 한방에서는 修治와 더불어 한약재의 약효성분의 체내흡수율과 생체 이용률을 극대화시키는 일종의 가공방
법으로 주로 사용되고 있으며 약리적 기능성뿐만 아니라 한 약의 제형개량과 포제방법을 향상시키는 기술이다1). 한약 재 발효에 관한 연구는 최근에 들어 많이 증가하고 있는 추 세이며 발효한약을 이용한 선행연구로는 발효된 오가피의 항당뇨 활성촉진기능2), 송이버섯과 동충하초 균사체 발효 를 이용한 한방추출물의 항산화 활성, 면역증진 및 항암 효 과를 확인한 연구3) 등이 보고된 바 있다.
당귀(Angelicae Gigantis Radix)는 미나리과에 속하는 다년생 초본인 참당귀 Angelica gigas Nakai
(Umbelliferae)의 뿌리로4) 예로부터 성질이 따뜻하고 무 독하며, 보혈, 행혈 및 산전산후에 유효한 약재로 많이 사용 되어져 왔으며5)현재까지 한약처방을 구성하는 한약 중 감 초 다음으로 출현빈도가 높은 약초로 알려져 있다6). 당귀의 주요성분으로는 decursin, decursinol angelate, nodakenin, β-sitosterol 등이 알려져 있으며7) 당귀의 약 리작용으로는 자궁기능조절, 면역기능 활성화, 항염, 진통, 항균8,9), 혈액순환개선10), 항산화, 면역조정, 항종양 및 조혈 작용 증진11,12)에 대해 보고된 바 있다. 뿐만 아니라 생리불 순, 무월경 등 여성혈관계 질환에 효능이 뛰어나며 대장의 건강에도 효능이 있다고 보고되었다13).
한편, 한약재의 수치에 대한 연구는 이미 오래전부터 진 행되어져 왔으며 그 일환으로 한약재 수치 전․후 지표성분 의 함량 분석, 효능연구와 같이 한약재 수치 규격화 연구
14,15)는 지속적으로 이루어지고 있으나 발효 한약재에 대한
규격화 연구는 아직 미비한 실정이다. 본 연구에서는 발효 한약재 규격화에 앞장서 영지버섯, 동충하초 균사체, 꿀 및 누룩을 발효원으로 하는 고체발효기술을 이용하여 당귀를 발효시킨 후 당귀의 발효 전․후 지표성분 함량을 분석하고 자 하였으며 지표성분으로 정한 nodakenin과 decursin은 당귀의 대표적 약리활성 성분이며 대한약전 제 9개정에서 정량법16)으로 고시된 성분이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 재료
1) 약재
본 실험에 사용한 당귀(Angelicae Gigantis Radix)는 영천현대약업사에서 구입하여 추출수율의 향상을 위해 잘 게 분쇄한 후 사용하였다.
2) 발효균주 및 발효물
당귀의 발효에 사용된 균주는 동충하초(Paecilomyces japonica)와 영지버섯(Ganoderma lucidum)품종으로 자 실체에서 분리하여 사용하였다. 꿀은 강원도 양구 방산꿀 (잡꿀)을 사용하였으며 누룩은 부산시 금정구 산성누룩을 사용하였다.
2. 시약 및 기기
시료의 추출에 사용한 유기용매는 대정화금주식회사에 서 생산한 특급 시약을 사용하였으며 기기분석을 위한 HPLC 용매는 J.T Baker사의 특별시약을 사용하였다. 그 외는 모두 특급 시약을 사용하였다. HPLC 분석기기는 Shimadzu Cp. (Japan)의 system controller (SCL-10A vp), solvent delivery system (LC-6AD), photodiode array detector (SPD-M10Avp), auto sample injector (SIL-10AF), degasser (DGU-14A)를 사용하였으며 HPLC column은 RStech 사의 C18 Optimapak (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛)을 사용하였다.
동충하초, 영지버섯 균주 보관용 배지는 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco 사)를 이용하였으며 액체종균 생산 용 배지는 PDB (Potato Dextrose Broth, Difco 사)를 사
용하였다. 균사 생장을 위해 항온 배양기
(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사 용하였다. 꿀, 누룩 발효를 위해 dry oven (JSOF-150, Korea)을 이용하였다.
3. 고체발효
1) 동충하초, 영지버섯 균주 배양
균주는 PDA 평판배지에서 4℃에서 보존하면서 30일 간 격으로 계대배양 하였다. 균사 생장을 위해 PDA 평판배지 를 이용하여 항온 배양기에서 25℃, 20일간 배양하였다.
2) 동충하초, 영지버섯 액체종균의 생산
PDB 배지는 500 ㎖ 삼각플라스크에 200 ㎖씩 각각 넣어 121℃에서 15분간 살균한 다음 냉각시켜 사용하였다. PDA 평판배지에서 20일간 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 mm 코르크보러를 사용하여 각각 4조각을 채취 한 후 PDB 액체 배지에 접종한 후 25℃에서 7일간 진탕배양(120 rpm)하여 액체 종균을 생산하였다.
3) 동충하초, 영지버섯 고체발효
당귀 가루에 동충하초, 영지버섯 액체종균 현탁액을 각 각 10%(v/v) 수준으로 접종하여 생육온도 25℃, 상대습도 80%를 유지하면서 30일간 고체발효를 실시하였다.
4) 꿀, 누룩 고체발효
꿀 발효는 당귀가루 500 g에 희석한 꿀(꿀 150 ㎖ + 생 수 150 ㎖) 300 ㎖를, 누룩발효는 당귀가루 500 g에 누룩발 효액(누룩 50 g에 고두밥 500 g을 넣어 섞은 후 발효시킴) 300 ㎖를 넣은 후 각각의 시료를 dry oven에서 37℃를 유 지하면서 22일간 고체발효를 실시하였다.
4. 건조감량 시험17)
무게를 단 칭량병에 시료 3.0 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 6시간 건조하고, 데시케이터에서 방냉 한 후 그 무게를 항량이 되었을 때의 감량을 건조감량(%) 으로 하였으며 검액의 조제시 이를 감안하여 검체무게를 측 정하였다.
5. 검액의 조제
대한약전 9개정의 정량법16)에 따라 검체를 가능한 한 잘 게 분쇄한 후 검체 0.5 g을 정밀하게 달아 메탄올 20 ㎖를 넣어 1시간 환류 추출한 다음 여과하였다. 잔류물에 메탄올 20 ㎖를 넣어 같은 방법으로 조작하였다. 여액을 모두 합하 여 메탄올을 넣어 정확하게 50 ㎖로 하여 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였으며 HPLC로 분 석하여 얻은 chromatogram의 면적을 구하여 표준품의 회 귀직선 방정식으로부터 각각의 nodakenin과 decursin의 함량을 구하였고 시료에 대해 3회 반복하여 지표성분의 함 량(%)을 산출하였다.
O O
O O
OH OH HO
OH
O
Nodakenin
O
O O
O O
Decursin
<Figure 1> Chemical structure of standard substances.
6. 표준액의 조제
실험에 사용한 지표물질인 nodakenin 및 decursin
<Figure 1>은 식품의약품안전청에서 분양받아 사용하였 으며 지표물질을 메탄올에 녹인 후 각각 0.1, 0.05, 0.03, 0.01 ㎎/㎖, 1, 0.5, 0.3, 0.1 ㎎/㎖ 의 농도로 희석하여 검량 선을 작성하였다.
7. 기기 분석조건
당귀의 지표성분 분석에 대한 조건은 <Table 1>과 같 다.
Column C18 (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛, Optimapak, RS tech)
Flow rate 1.0 ㎖/min
Detector UV 330 nm
Injection Volume 10.0 ㎕
Column Temp. Room temp.
Mobile Phase H2O(A), CH3CN(B)
Analytical condition 0-3min(20, B), 3-8min(20→30,B), 8-18min(30, B), 18-19min(30→50, B), 19-40min(50, B), 40-41min(50→90, B), 41-50min(90, B)
<Table 1> Conditions of HPLC Analysis
8. 통계처리
각 시료간의 유의성 검정은 SPSS 12.0 ver.(Statistical package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package를 사용하여 ANOVA 분산분석 과 Dunnett's test를 이용하여 유의성 검정을 실시하였다.
Ⅲ. 결과 및 고찰
1. 건조감량
건조감량 시험을 통하여 시료에 함유되어 있는 수분의 양을 측정하였다. 당귀의 건조감량 시험법에 따라 3회 반복 실시한 결과는 <Table 2>와 같다. 모든 발효시료는 control에 비하여 건조감량이 높게 나타났으며, 또한 control을 포함한 모든 시료에서 발효 후 수분 함량이 증가 하는 결과를 확인할 수 있었다.
Sample Con SDT SYT SST SNT Mean±SD 5.72 ± 0.05 55.32 ± 0.04 49.90 ± 0.05 20.62 ± 0.07 23.19 ± 0.16
<Table 2> The Results of Loss of Drying for Angelicae Gigantis Radix Extract According to Fermentation. (n=3)
(unit : %)
Con: control(Angelicae Gigantis Radix extract), SDT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented withPaecilomyces japonica, SYT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented withGanoderma lucidum, SST; Angelicae Gigantis Radix extract fermented with honey, SNT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Nuruk
2. 당귀의 HPLC 분석
당귀의 지표성분인 nodakenin의 검량선은 y = 17152x
― 6363.3 (r2= 0.9999), decursin의 검량선은 y = 27788x + 232260 (r2 = 0.9999)<Figure 2>으로 양호한 직선성을 나타내었으며 HPLC chromatogram에서 retention time 은 각각의 peak가 약 11.47, 46.79분대에서 확인되었다. 지 표성분과 발효된 당귀 추출물에 대한 HPLC chromatogram은 <Figure 3>에서와 같이 나타났으며 이 들의 함량은 <Table 3>에 나타내었다. 발효된 당귀 추출 물의 chromatogram에서 지표성분은 다른 성분들과 비교 적 잘 분리되었음을 확인할 수 있었다. 지표성분의 함량은 nodakenin의 경우 동충하초 균사체 발효 추출물(SDT), 영지버섯 균사체 발효 추출물(SYT), 발효하지 않은 추출 물(Con), 누룩 발효 추출물(SNT), 꿀 발효 추출물(SST) 의 순으로 높게 나타났으며, SDT와 SYT의 경우 각각의 함량이 0.31 ± 0.00%, 0.51 ± 0.02%로 0.76 ± 0.02%인 Con보다 지표성분 함량이 감소하였으나(p<0.01), SST, SNT의 함량은 각각 0.82 ± 0.03%(p<0.05), 0.88 ± 0.01%(p<0.01)로 발효 후 Con보다 함량이 증가하는 것을 확인하였다. Decursin의 경우 지표성분의 함량은 SYT, SDT, SST, Con, SNT의 순으로 나타났으며, SDT, SYT 및 SST의 경우 각각의 함량은 2.90 ± 0.05%(p<0.01), 2.65 ± 0.08%(p<0.01), 4.46 ± 0.11%로 4.50 ± 0.08%인 Con보다 지표성분 함량이 감소하였으나, SNT의 경우 4.73 ± 0.04%(p<0.05)로 Con 보다 함량이 증가하였음을 알 수 있었다(Table 3). SDT, SYT의 경우 발효 후 nodakenin과 decursin의 함량이 모두 감소되었으 며, SST의 경우 nodakenin의 함량이 control 대비 약 7.85% 증가하였음을 알 수 있었다. SNT의 경우 nodakenin과 decursin의 함량이 control 대비 각각 15.45%, 5.08% 증가하는 것으로 확인되었다. 이로써 당귀 의 경우 영지버섯, 동충하초 균사체 발효에 의해 당귀의 대
표적인 지표성분의 함량이 감소하는 경향을 보였으며, 꿀 발효 후에는 nodakenin의 함량이 증가하는 반면 decursin 의 함량은 감소하였으며, 누룩발효 후에는 2가지 지표성분 의 함량이 모두 증가하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
이처럼 발효에 의한 지표성분의 변화에는 발효원의 종류 가 중요한 요인중의 하나인 것을 알 수 있으며 이외의 요인 으로는 장내세균에 의하여 체내로 들어온 배당체가 당과 비 당부분으로 분해되는 것과 같이 발효를 통해 지표물질인 원 화합물이 대사체로 분해되면서 지표성분이 감소되거나, 지 표성분이 생성되는 일련의 반응이 촉진되거나 증가하여 지 표성분이 증가하였을 가능성도 있을 것으로 사료된다. 꾸준 하게 발효 한약재의 사용이 증가하는데 반해 현재 발효된 한약재의 지표성분에 대한 규격은 성립되어 있지 않은 상태 이며 앞으로 발효 한약재 규격 성립에 있어 본 연구가 기초 적인 자료로 활용될 수 있으리라 사료된다.
y = 17152x - 6363.3 R2 = 0.9999
0 500000 1000000 1500000 2000000
0 20 40 60 80 100 120
Concentration (mg/L)
Peak area(mAU)
(A)
y = 27788x + 232260 R2 = 0.9999
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentration(mg/L)
Peak area(mAU)
(B)
<Figure 2> Calibration curve of standard solution.
A; Nodakenin calibration, B; Decursin calibration
<Figure 3> HPLC chromatogram of standards and Angelicae Gigantis Radix extract according to fermentation.
Standard; nodakenin, decursin, Con; control(Angelicae Gigantis Radix extract), SYT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented withGanoderma lucidum, SDT;
Angelicae Gigantis Radix fermented with Paecilomyces japonica, SST; Angelicae Gigantis Radix extract fermented with honey, SNT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented withNuruk
Maker substance Sample Content ± SD
Nodakenin
Con 0.76 ± 0.02
SDT 0.31**± 0.00 SYT 0.51**± 0.02
SST 0.82*± 0.03
SNT 0.88**± 0.01
Decursin
Con 4.50 ± 0.08
SDT 2.90**± 0.05 SYT 2.65**± 0.08
SST 4.46 ± 0.11
SNT 4.73*± 0.04
<Table 3> Content of Nodakenin and Decursin in Angelicae Gigantis Radix Extract According to Fermentation. (n=3)
(unit : %)
*p<0.05, **p<0.01
Con; control(Angelicae Gigantis Radix extract), SDT; Angelicae Gigantis Radix fermented withPaecilomyces japonica, SYT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Ganoderma lucidum, SST; Angelicae Gigantis Radix extract fermented with honey, SNT; Angelicae Gigantis Radix extract fermented with Nuruk
Ⅳ. 결 론
당귀를 영지버섯, 동충하초 균사체, 꿀, 누룩을 이용하여 발효시킨 후 변화되는 지표성분 nodakenin과 decursin의 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
1. Nodakenin의 함량은 SDT, SYT 실험군에서 감소하 였으며 SST, SNT 실험군에서 증가하였다.
2. Decursin의 함량은 SDT, SYT 및 SST 실험군에서
감소하였으며 SNT 실험군에서 증가하였다.
이상의 결과로 당귀의 발효에 따른 지표성분의 변화는 발효원의 종류에 따라 차이가 있는 것으로 나타났으며, 발 효 후 지표성분의 증가에 따른 다양한 효능비교와 더불어 발효 후 감소된 지표성분 변화에 따른 효능 비교 및 지표성 분이 감소되면서 생성된 새로운 성분의 탐색 및 동정에 대 한 연구가 병행된다면 발효 한약재에 대한 규격화 및 발효 한약재 신소재 개발에 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.
Ⅴ. 감사의 글
본 연구는 2009년 한국한의학연구원 연구지원(P09020) 에 의해 수행되었으며 이에 감사드린다.
