Anti-ulcer effects of HT074 on HCl/EtOH induced gastric injury

염산/에탄올로 유도된 위손상 동물모델에서 HT074의 항궤양 효과

김영식^1#, 박효진², 송정빈¹, 이동헌³, 김호철^1*

1: 경희대학교 한의과대학 본초학교실, 2: 뉴메드 한의과학기술연구소, 3: 가천대학교 한의과대학 본초학교실

Anti-ulcer effects of HT074 on HCl/EtOH induced gastric injury

Young-Sik Kim

, HyoJin Park

, Jungbin Song

, Donghun Lee

, Hocheol Kim

1 : Dept. of Herbal Pharmacology, College of Korean Medicine, Kyung Hee University 2 : Korea Institute of Science and Technology for Eastern Medicine, NeuMed Co., Ltd.

3 : Dept. of Herbal Pharmacology, College of Korean Medicine, Gachon University

ABSTRACT

Objectives : This study aimed to investigate the anti-ulcer effect of an standardized herbal extracts mixture of Inulae Flos and Paeoniae Radix (HT074) on acidified ethanol induced gastric injury and its potential mechanisms.

Methods : Antioxidant activities of HT074 and its constituents were measured by DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) and ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging capacity. After the oral administration of HT074 at doses of 100, 300 ㎎/㎏ twice per day for 14 days, Gastric lesions were induced by oral administration of acidified ethanol in Sprague Dawley rats. Oxidative stress markers, such as super oxide dismutase (SOD) activity, concentrations of catalase (CAT) and glutathione (GSH) were measured in gastric mucosal tissues.

Additionally, the expression of human mucin gene, Mucin 5AC (MUC5AC) mRNA in gastric mucosal tissues was measured.

Results : HT074 showed dose dependent radical scavenging activities against DPPH and ABTS radicals. Oral administration of HT074 300 ㎎/㎏for 14 consecutive days significantly decreased gastric lesions and histological damages induced by HCl/EtOH in rats. HT074 treatment significantly increased the activity of SOD (300 ㎎/㎏) and concentration of GSH (100 and 300 ㎎/㎏), however catalase concentration was not significantly increased. MUC5AC mRNA expression was significantly increased by HT074 100, 300 ㎎/㎏ treatment.

Conclusions : HT074 protects the gastric mucosa from oxidative stress caused by acidified ethanol by increasing the activity of SOD, concentration of GSH and mucin biosynthesis. These findings suggest that HT074 could be an effective candidate for prevention and treatment of gastritis and gastric ulcer.

1)

Key words :

,

, HT074, anti-ulcer, gastroprotective, gastric injury

Ⅰ. 서 론

위 내막의 염증성 상태를 의미하는 위염은

, 성인 9명 중 1 명이 앓고 있는 가장 흔한 소화기계 질환으로 2016년 기준 국내 다빈도 상병순위 8위에 해당하는 흔한 질환이다

. 맵고 짠 음

식을 좋아하는 고유의 식습관, 식생활의 서구화로 인한 기름 진 음식 소비 증가, 술, 담배, 일상 생활에서의 스트레스 등으로 인해 한국인의 위염 이환률은 계속해서 높게 유지될 것으로 예상된다

.

위장은 위점막을 손상시키는 공격인자와 보호하는 방어인

*Corresponding author : Hocheol Kim, Department of Herbal Pharmacology, Kyung Hee University College of Korean Medicine, Seoul 02447, Republic of Korea.

·Tel : +82-2-961-0419 ·E-mail : [email protected]

#First author : Young-Sik Kim, Department of Herbal Pharmacology, Kyung Hee University College of Korean Medicine, Seoul 02447, Republic of Korea.

·Tel : +82-2-961-0419 ·E-mail : [email protected]

·Received : 10 April 2018 ·Revised : 21 May 2018 ·Accepted : 25 July 2018

자의 균형에 의해 유지되는데 두 인자 간의 균형이 무너지면 위점막의 손상으로 인한 발적, 부종, 출혈 등의 증상으로 대 표되는 위염이 발생하게 되고, 점막하층 이상이 손상되면 위 궤양이 발생하게 된다

. 위점막의 대표적인 공격인자로는 히스타민, 위산, 펩신, 가스트린 분비 등의 내인성 공격인자와 NSAIDs 약물복용, 불규칙하고 자극적인 식습관, 담배, 음주, 스트레스,

감염 등의 외인성 공격인자가 보고되어 있으며, 이로부터 위점막을 보호하는 방어인자로 점 액 분비, 항산화 효소, 중탄산염 분비, 프로스타글란딘 생성, 풍부한 점막내 혈류 및 위점막 세포의 재생능력 등이 위점막의 유지에 관여한다

.

위염 및 위궤양의 치료에는 H

receptor antagonist, proton pump inhibitor (PPI) 등 공격인자 억제제가 주로 사용되고 있으나

효과가 일시적이며 장기복용시 설사, 두통, 발진, 고혈압, 관절의 통증과 같은 부작용이 보고되어 있다

. 현재 가장 많이 처방되고 있는 PPI 제제는 효과적으로 위궤양, 위 식도 역류 질환에 사용되고 있으나 위산 분비세포 증식, 분비 선 낭종, 고가스트린혈증, 위저선 용종 등의 부작용 보고가

있으며

, 장기 복용 시 위축성 위염과 위암의 발병에도 영

향을 줄 수 있으며 5년간 PPI를 복용한 환자 중 3분의 1이상 이 위축성 위염 소견을 보인다고 보고되는 등 안전성에 대한 논란이 계속되고 있다

. 따라서 위점막의 공격인자로부터 위점막을 보호하여 위염, 위궤양의 재발을 줄이고 장기 복용의 부담이 적은 위점막 보호제의 개발이 필요하다.

스트레스, 알코올, NSAIDs,

.

등 다양한 원인에 의한 위점막 손상에 free radical이 주요 원인으로 보고되어 있으며

, 이러한 free radical의 국소적 생성은 세포막에 손 상을 일으켜 조직 손상을 일으킨다

. 특히 에탄올은 reactive oxygen species (ROS)를 형성하여 위점막의 산화적 손상으 로 인한 염증을 유발하고 위점막의 보호인자인 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) 등 항산화 효소의 활성과 glutathione (GSH)의 생성을 감소시킨다

. HCl/EtOH 유도 위점막 손상 모델은 산화적 손상으로 인한 위염, 위궤양 동물 모델로 위점막에 직접적인 손상을 유도하여 위점막의 손상 정 도를 확인할 수 있다

.

HT074는 한의학에서 소화기계 이상이나 복부의 통증 완화 에 사용되어 온 선복화와 작약 추출물 복합물이다. 한의학에서 선복화(旋覆花)는 국화과(Compositae)에 속한 다년생 초본인 금불초

Thunberg 또는 구아선복화(歐亞旋覆 花)

Linné의 꽃으로 소담행수(消痰行水), 강기 지구(降氣止嘔)의 효능으로 담음축결(痰飮蓄結), 흉격비민(胸 膈痞悶), 구토애기(嘔吐噫氣), 심하비경(心下痞硬) 등의 치료 에 사용된다

. 선행 연구에서는 진통, 항염, 항노화, 항진균, 간보호, 항암 효과에 관한 연구가 보고되어 있으며 이러한 효 능에 관여하는 성분으로 1-

-acetylbritannilactone, 1,6-

,

-diacetylbritannilactone 등의 sesquiterpenes과 patuletin, luteolin, nepetin, kaempferol 3-glucoside, isorhamnetin 3-glucoside 등의 flavonoids가 보고되어 있 다

. 작약(芍藥)은 작약과(Paeoniaceae)에 속한 다년생 초 본인 작약

의 뿌리로 양혈유간(養血柔肝), 완중지통(緩中止痛), 염음수한(斂陰收汗)의 효능으로 흉복협 늑동통(胸腹脇肋疼痛), 사리복통(瀉痢복통) 등의 치료에 사용

되어 왔다

. 선행 연구로 항염증, 면역조절, 혈당조절, 항 골다공증, 항산화, 항진균 효과에 관한 연구가 보고되어 있으며 이에 관여하는 성분으로 paeoniflorin, paeonin, albiflorin, benzoylpaeoniflorin 등의 monoterpene glycosides와 phenol 성분인 paeonol 등이 보고되어 있다

.

선복화, 작약의 위염, 위궤양과 관련된 선행 연구로 선복화의 메탄올, 에탄올 추출물이

strain의 viability를 감소시키고 위 상피세포인 AGS cell로의 부착을 억제하고, 이미 부착된

strain을 탈락시킨다는 보 고가 있으며

, 작약의 성분인 paeoniflorin 단회 투여가 염산, 에탄올에 의한 위점막의 손상을 억제한다는 보고가 있으나

선복화와 작약 추출물 복합물의 위점막 보호 효과에 관한 연 구는 보고된 바 없다.

따라서 본 연구에서는 선복화, 작약 열수 추출물 복합물인 HT074와 그 구성 약재의 항산화능을 확인하고, 염산/에탄올의 투여로 인한 위점막 손상에 대한 HT074의 위점막 보호 효과와 항산화 효소의 활성, 위점액 분비 관련 유전자 발현을 확인하 고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시료 준비

작약(roots of

), 선복화(flowers of

) 는 대우약업사(Seoul, Korea), 제성약업사(Seoul, Korea)에서 구입하여 경희대학교 한의과대학 본초학교실에서 검증하여 제조에 사용하였다. 각각의 약재를 10배수의 증류수로 100℃

에서 3시간 동안 2회 환류 추출하고, 여과를 용이하게 하기 위해 작약추출액에 amylase 효소를 처리한 후 효소 실활시켰다.

그 후 각각의 추출액을 여과하고 감압농축한 후 dextrin을 혼 합해 분무 건조하였다. 분무 건조가 끝난 작약, 선복화 추출 물을 dextrin을 제외한 중량비가 1:1이 되도록 53:47의 중량 비로 혼합하여 HT074를 제조하였다. 본 실험에 사용된 HT074는 MSC (Yangsan, Korea)에서 제조하였으며, paeoniflorin 21.0-31.6 ㎎/g, 1-

-acetylbritannilactone 1.50-2.26 ㎎/g으로 표준화하였다.

2. High performance liquid chromatography (HPLC) 분석

HT074의 지표성분인 paeoniflorin과 1-

- acetylbritannilactone의 함량은 HPLC를 이용하여 분석하였 다. 분석기기는 Waters 1525 binary pump, Waters 2707 autosampler, Waters 2998 PDA detector가 장착된 Waters instrument (Milford, MA, USA)를 사용하였으며 Sunfire™

C

column (5 mm; 250 x 4.6 mm; Waters, USA)으로 분

석을 실시하였다. 이동상은 0.1% 인산 수용액(phosphoric acid,

A)과 아세토나이트릴(acetonitrile, B)이었다. 용매의 기울기는

0-15-40-45-50-55분, 용매 B 20-20-70-70-20-20%,

유속 1.0 ㎖/min으로 분석하였으며, paeoniflorin과 1-

-

acerylbritannilactone 각각 235 ㎚, 210 ㎚에서 측정하였다.

3. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거 활성 측정

DPPH radical 소거 활성은 Sharma et al.(2009)의 방법을 이용하여 측정하였다

. 시료를 에탄올에 녹여 농도별로 희석 한 후 시료 100 ㎕와 0.2 mM DPPH 용액 100 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분간 암소에서 반응시켰다. 그 후 517 ㎚에서 흡 광도를 측정하였고, DPPH radical 소거 활성은 다음 식에 따라 계산하였다.

DPPH radical 소거 활성(%)

={(대조군 흡광도-실험군 흡광도)/대조군 흡광도}×100.

양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

4. 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid) (ABTS) radical 소거 활성 측정

ABTS radical 소거 활성은 Huang et al.(2005)의 방법을 이용하여 측정하였다

. 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 증류수에 녹인 다음 16시간 차광상태로 반응시 켜 ABTS radical solution을 제조하였고, 이를 734 ㎚에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 0.01 M PBS로 희석하여 working solution으로써 사용하였다. 시료를 증류수에 녹여 농도별로 희석한 후 시료 10 ㎕와 working solution 190 ㎕를 첨가하여 암실에서 5분간 반응시킨 후 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거 활성은 다음 식에 따라 계산 하였다.

ABTS radical 소거 활성(%)

={(대조군 흡광도-실험군 흡광도)/대조군 흡광도}×100.

양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

5. 실험동물과 투여방법

체중 180-210 g, 6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 샘타코(Ansan, Korea)에서 공급받아 7일간 적응시켜 사용하 였다. 사육 환경은 온도 23±1℃, 상대습도 55±5%, 조명시간 12시간으로 유지하였다. 실험실 환경에서 적응시킨 흰쥐를 무작위로 대조군, 양성대조군(omeprazole (OMP) 20 ㎎/㎏), HT074 100 ㎎/㎏ 투여군, HT074 300 ㎎/㎏ 투여군으로 나 누었다. 각 군당 실험동물의 수는 6-10마리로 하였다. 실험 동물은 물 또는 시료를 1일 2회씩 총 14일간 경구투여하였으 며 투여액량은 10 ㎖/㎏으로 하였다. 실험은 한의과학연구소 (KISTEM)의 동물실험윤리위원회에 의해 승인을 받은 후 규 정에 따라 실행되었다(KISTEM-IACUC-005).

6. HCl/EtOH 유도 위점막 손상 동물 실험

실험 마지막 날 실험동물을 24시간 동안 절식시켰고, 마지막 시료 투여 1시간 뒤 150 mM HCl을 함유하는 60% ethanol solution (HCl/EtOH) 1.5 ㎖을 경구투여하여 위점막 손상을 유발하였다. HCl/EtOH 투여 1시간 뒤 흰쥐를 아이소플로란 으로 마취하여 위를 적출하였고, 적출한 위의 위저부를 따라 절개한 후 식염수로 세척하여 핀으로 고정한 뒤 위의 손상 정 도를 촬영하였다. 촬영이 끝난 동물의 위조직은 항산화 효소 활성 및 mucin 5AC (MUC5AC) mRNA 발현 측정을 위해 -80℃에서 보관하였다. 촬영한 사진은 Image J(National Institutes of Health, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 위 손상 면적(gastric lesion area, GLA)을 측정하였다. 위 손상 지수(gastric lesion index, GLI)와 위점막 보호율(gastric protection rate)은 다음의 식으로 계산하였다.

7. 조직학적 관찰

위조직을 광학현미경으로 관찰하기 위해 각 군의 위조직을 10% paraformaldehyde (PFA) solution에 고정한 후 80, 90, 95, 100% EtOH에 순차적으로 담궈 탈수하고 xylene으로 헹군 후 paraffin으로 포매하였다. paraffin에 포매된 조직은 microtome (Leica RM2235, Leica Biosystems, Germany)을 이용해 5 ㎛ 두께로 절편을 제작한 후 hematoxyline과 eosin (H&E)으로 염색하여 광학현미경(Nikon ECLipse Ci, Japan) 으로 관찰하였다.

8. 위조직 항산화 효소 활성 측정

실험동물의 위조직은 액체질소상에서 막자사발을 이용해 분쇄하였다. 분쇄된 위조직 약 200 ㎎에 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) 1 ㎖을 넣어 homogenizer (TissueLyser LT, Qiagen, USA)로 균질화한 후 균질액을 4℃, 4,000 rpm에서 4분간 원심분리한 다음, 상층액을 두 개로 나누어 취하였다. 하나는 SOD assay kit (Cayman, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 SOD 활성을 측정하였고, 다른 하나는 4℃, 10,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상 층액을 취한 후 CAT assay kit (Cayman, USA)와 GSH assay kit (Cayman, USA)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 CAT, GSH 농도를 측정하였다.

9. RNA 추출 및 real-time quantitative (q) PCR

적출한 실험동물의 위조직을 액체질소에서 분쇄한 후 약

100 ㎎을 QiAzol lysis reagent (Invitrogen Technologies,

Waltham, MA, USA)로 제조사의 protocol을 따라 total

RNA을 추출하였다. 추출한 total RNA는 High Capacity cDNA

Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster

City, CA, USA)를 이용해 cDNA로 합성한 다음 Step-One- Plus RT-PCR System (Applied Biosystems, USA)으로 MUC5AC mRNA 발현을 측정하였다. 반응에 사용한 primer는 Table 2와 같으며 결과는 GAPDH를 이용하여 정규화하였고 delta-delta 방법으로 상대정량 하였다.

Primer Sequence

GAPDH

Forward 5’-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3’

Reverse 5’-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3’

MUC5AC

Forward 5’-TTGAAGTTGGTGTTGGTGGA-3’

Reverse 5’-GGAGGTTCCATAGCCTCCTC-3’

Table 1. Primer sequences for genes used for real-time qPCR

10. 통계 처리

모든 실험 결과는 평균±표준오차로 표시하였으며, 각 군간 평균의 차이는 Graphpad prism 5 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Dunnett's multiple comparison test로 사후검정을 실시하여

< 0.05 일 때 통 계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. HT074의 HPLC 성분분석

HT074의 HPLC 크로마토그램은 Figure 1에 나타내었다.

작약의 지표성분인 paeoniflorin의 함량은 27.55 ㎎/g, 선복 화의 지표성분인 1-

-acetylbritannilactone의 함량은 1.88 ㎎/g으로 나타났다.

Figure 1. HPLC chromatograms of HT074. Arrows in (A) and (B) show the peaks of 1-O -acetylbritannilactone and paeoniflorin, respectively.

2. 작약, 선복화 추출물 및 HT074의 DPPH, ABTS radical 소거 활성 측정 결과

시료들의 항산화 효능을 평가하기 위하여 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 양성대조군인 L-ascorbic acid의 IC

은 각각 7.5 ㎍/㎖, 33.8 ㎍/㎖으로 나타났다. 작약 추출물, 선복화 추출물, HT074의 DPPH radical 소거능의 IC

은 각각 95.0 ㎍/㎖, 608.7 μg/mL, 194.4 ㎍/㎖ 이었 으며, ABTS radical 소거능의 IC

은 422.7 ㎍/㎖, 218.52

㎍/㎖, 353.2 ㎍/㎖로 나타났다. 작약 추출물, 선복화 추출물, HT074의 DPPH radical 소거능은 1000 ㎍/㎖에서 각각 89%, 77%, 94%의 억제율을 보였고, ABTS radical 소거능은 2000 ㎍/㎖에서 각각 89%, 97%, 99%의 억제율을 보였다 (Figure 2).

3. HCl/EtOH 유도 위점막 손상에 대한 HT074의 위점막 보호 효과

HCl/EtOH 투여는 위점막에 검붉은 선의 급성 출혈성 병 변을 유발시켰다. 대조군의 gastric lesion area와 gastric lesion index는 각각 71.25±13.49 ㎟, 7.68±1.5이였으며, 양성대조군인 OMP 20군은 각각 0.82±0.62 ㎟, 0.08±0.06 으로 HCl/EtOH에 의한 위점막 손상을 대조군 대비 99.85%

억제하였다(

< 0.001). HT074 300군의 gastric lesion area 와 gastric lesion index는 각각 24.19±7.63 ㎟, 2.42±

0.71이었으며, HCl/EtOH에 의한 위점막 손상을 대조군 대비

66.05% 억제하였다(

< 0.05). HT074 100군도 gastric lesion

area와 gastric lesion index를 감소시켰으나 유의하지 않았

다(Table 2).

Figure 2. DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activities of P. lactiflora, I. britannica and HT074. Values are expressed as mean ± SEM.

Gastric lesion area (㎟) Gastric lesion index Gastric protection rate (%)

Control 71.25 ± 13.49 7.68 ± 1.52

HT074 100 44.37 ± 11.26 4.98 ± 1.21 37.73

HT074 300 24.19 ± 7.63* 2.42 ± 0.71* 66.05

OMP 20 0.82 ± 0.62*** 0.08 ± 0.06*** 98.85

Rats were pre-treated orally with distilled water (Control), HT074 (100 or 300 ㎎/㎏), omeprazole 20 ㎎/㎏ for 14 days before oral administration of HCl/EtOH. Values are expressed as mean ± SEM. *p < 0.05 and ***p < 0.001 vs. control by ANOVA with Dunnett's post hoc test.

Table 2. Effect of HT074 on gastric lesion area, gastric lesion index and gastric protection rate in HCl/EtOH induced gastric lesions rat model.

4. HT074의 위점막 보호 효능에 대한 조직학적 평가

HCl/EtOH로 위점막 손상이 유도된 흰쥐의 위조직을 광학현미경으로 관찰한 결과, 점막상피의 파괴, 점막층까지 깊게 관통하 는 괴사성 병변, 백혈구 침윤과 점막하층의 광범위한 부종이 관찰되었다(Figure 3). HT074 100군에서는 점막하층의 백혈구 침 윤을 동반한 부종이 약하게 나타났으나 HT074 300군, OMP 20군에서는 조직학적인 병변이 관찰되지 않았다.

Figure 3. Gross (A) and histological (B) analysis of gastroprotective effect of HT074. Representative stomach from each group. Rats were pre-treated orally with distilled water (a, Control), HT074 100 ㎎/㎏ (b), HT074 300 ㎎/㎏ (c) and omeprazole 20 ㎎/㎏ (d) for 14 days before oral administration of HCl/EtOH. Arrow indicated the disruption to the surface epithelium, penetration deeply into mucosa, leucocyte infiltration and extensive edema of submucosal layer.

5. HT074가 위조직의 항산화효소 활성에 미치는 영향

HT074의 경구투여가 HCl/EtOH 유도 위점막 손상 흰쥐 위조직의 SOD 활성과 CAT, GSH 함량에 미치는 영향을 측 정한 결과, SOD 활성은 HT074 300군과 OMP 20군에서 대 조군 대비 유의하게 증가하였고(각각,

< 0.05,

< 0.001), GSH 함량은 HT074 100, 300군과 OMP 20군에서 대조군 대비 유의하게 증가하였다(각각,

< 0.01,

< 0.05,

< 0.001).

그러나 CAT 활성은 군 간 유의한 차이가 나타나지 않았다 (Figure 4).

Figure 4. Effect of HT074 on anti-oxidant enzyme activity or concentration. Rats were pre-treated orally with distilled water (Control), HT074 (100 or 300 ㎎/㎏), omeprazole 20 ㎎/㎏ for 14 days before oral administration of HCl/EtOH. Values are expressed as mean ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 vs. control by ANOVA with Dunnett's post hoc test. OMP, omeprazole.

6. HT074가 위조직의 MUC5AC mRNA 발현에 미치는 영향

위조직에서 위 점액 분비와 관련된 유전자인 MUC5AC mRNA 발현 변화량을 real-time qPCR을 이용하여 측정한 결과, HT074 100, 300군에서 대조군 대비 유의하게 위조직 MUC5AC mRNA 발현이 유의하게 증가하였다 (

< 0.001,

< 0.01).

그러나 양성대조군인 omeprazole 20군은 유의한 증가가 나 타나지 않았다(Figure 5).

Figure 5. Effect of HT074 on gastric MUC5AC mRNA expression.

Rats were pre-treated orally with distilled water (Control), HT074 (100 or 300 ㎎/㎏), omeprazole 20 ㎎/㎏ for 14 days before oral administration of HCl/EtOH. Values are expressed as mean ± SEM.

**p < 0.01 and ***p < 0.001 vs. control by ANOVA with Dunnett's post hoc test. OMP, omeprazole.

Ⅳ. 고 찰

본 연구에서는 HT074와 그 구성 약재인 작약 추출물, 선 복화 추출물의 항산화 효능을 DPPH, ABTS radical 소거능을 측정하여 평가하고, HT074를 2주간 투여하였을 때 HCl/EtOH 로 유도되는 위점막 손상에 대한 보호 효과와 항산화 효소 활성, 위점액 분비 관련 유전자 발현의 변화를 확인하였다.

시료들의 항산화 효능을 평가하기 위하여 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, DPPH radical 소거능은 작약 추출물이, ABTS radical 소거능은 선복화 추출물이 높게 나타 났으며 HT074는 DPPH, ABTS 모두 높은 radical 소거능을 나타냈다. 위염과 위궤양의 발병과정에 ROS와 free radical 에 의한 산화적 스트레스가 중요하게 관계하고 있음은 인체와 동물실험에서 충분히 연구되어 있다

. 본 실험결과는 작 약에 함유되어 있는 paeonol과 그 유도체 성분들이 DPPH radical 소거능을 증가시키고

, 선복화에 함유된 patuletin, luteolin, isorhamnetin 3-glucoside 등의 flavonoid 성분 이 DPPH radical 소거능을 증가시킨다

는 기존 보고와 일 치한다. 따라서 HT074가 DPPH, ABTS radical 소거를 통한 항산화 활성이 있음을 확인하였으며, 이러한 항산화 효능은 산화적 손상으로 인한 위점막의 손상을 억제하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

HT074 2주간 경구투여는 HCl/EtOH에 의한 위점막 손상을

농도의존적으로 억제하였으며 300 ㎎/㎏ 투여군에서 유의한

위점막 보호 효과를 나타내었다. 에탄올은 위점막을 직접 자 극하고 위점막을 쉽게 통과하여 점막하층에 부종을 유발시킴 으로써 일시적 허혈로 인한 세포 괴사를 유발하며

, HCl은 위장 운동을 항진시켜

위염 및 위궤양을 유발하기 때문에 재현성이 뛰어나 항위염, 항위궤양 효능을 확인하기 위한 동물 실험에서 일반적으로 사용된다

. 본 실험에서 염산 에탄올의 투여군은 점막 상피의 파괴, 점막하층의 부종, 백혈구 침윤 등을 동반한 급성 위점막 손상을 일으켰다. 그러나 HT074 투 여군에서는 뚜렷한 조직학적 병변이 관찰되지 않았으며 대조군 대비 위점막 손상이 유의하게 감소되었다. 이러한 결과는 HT074 전처리가 HCl/EtOH에 의한 위점막 손상에 대해 보호작용을 하는 것을 의미한다.

본 연구에서 HT074 2주간 경구투여는 흰쥐의 위점막 조직 에서 SOD 활성과 GSH 함량을 대조군 대비 유의하게 증가시 켰다. 에탄올은 인체에서 대사되면서 superoxide anion과 hydroperoxy free radicals 등을 방출시키기 때문에 에탄올에 의한 위점막 손상에 free radical에 의한 산화적 스트레스가 관여한다고 보고되어 있다

. 이러한 산화적 스트레스에 대한 세포의 보호에 SOD, CAT 등 내인성 항산화 효소와 GSH가 중요한 역할을 하는데

에탄올에 의한 free radical의 생성은 항산화 효소인 SOD, CAT, GSH의 활성을 감소시킨다

. SOD는 ROS에 대한 세포의 첫 번째 방어 관문으로 ROS를 활성이 약한 hydrogen peroxide로 전환하여 세포의 손상을 억제하고, CAT는 SOD에 의해 생성된 hydrogen peroxide를 H

O로 전환한다. 따라서 SOD, CAT 활성은 세포내 항산화 능력을 반영한다고 보고되어 있다

. GSH는 세포내 ROS와 H

O

, 과산화지질 등 독성 물질을 전이, 분해, 이물질의 포합 형성 등에 사용되는 물질로 GSH의 함량을 증가시키면 독성 물질에 대한 방어 효과가 증강되는 것으로 보고되어 있다

47-9)

. 본 실험의 결과는 HT074 전처리가 항산화 효소 활성과

GSH 함량을 증가시켜 HCl/EtOH에 의한 산화적 스트레스로 부터 위점막을 보호하는 것을 의미한다.

HT074는 흰쥐의 위조직에서 MUC5AC mRNA 발현을 대 조군 대비 유의하게 증가시켰다. 위점액은 위점막의 첫 번째 방어층으로 위점막 공격인자들로부터 위점막의 손상을 보호 한다

. 인간의 위장관계에서 위점액을 구성하는 mucin 단 백질을 합성하는데 관여하는 유전자는 MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC11, MUC12 등이 보고되어 있으며

, 정상적인 점막층 에서 발현이 높게 나타나는 MUC1, MUC5AC, MUC6 유전자 중 MUC5AC는 superficial foveolar epithelium에서 발현된 다

. MUC5AC 유전자는 점막 상피 표면에 MUC5AC mucin을 합성하여 부착시킨다

. 본 실험의 결과는 HT074가 위점막 상피에서 MUC5AC 유전자 발현을 증가시켜 위점액 분비시킴으로써 위점막을 보호하는 것을 의미한다.

Ⅴ. 결 론

본 연구에서는 HT074의 위점막 보호 효과를 평가하기 위해 선복화 추출물, 작약 추출물, HT074의 DPPH, ABTS 항산화 활성을 확인하고, HT074를 2주간 투여 후 HCl/EtOH 유도

흰쥐 위점막 손상 모델에서 위손상면적, 위손상지수와 항산화 효소의 변화, 위점액 관련 유전자 발현을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. HT074는 농도의존적으로 DPPH, ABTS radical 소거 능을 나타내었다. 이는 HT074의 항산화 활성이 산화적 손상으로부터 조직을 보호하는데 도움을 줄 수 있음을 의미한다.

2. HCl/EtOH 유도 위점막 손상 모델에서 HT074는 위손 상면적, 위손상지수를 대조군 대비 농도 의존적으로 감 소시켰으며, 이는 HT074 투여가 HCl/EtOH에 의한 손 상으로부터 위점막을 보호하는 것으로 의미한다.

3. HT074는 위점막 조직의 SOD 활성, GSH 함량을 대조군 대비 유의하게 증가시켰으며, 이는 HT074가 HCl/EtOH 로 인한 산화적 스트레스로부터 위점막의 손상을 억제하는 것을 의미한다.

4. HT074는 위점막 조직에서 mucin 단백질 합성에 관여 하는 MUC5AC 유전자 발현을 대조군 대비 유의하게 증 가시켰으며, 이는 HT074가 위점막 표면에서 위점액 분 비를 증가시켜 위점막을 보호하는 것을 의미한다.

이상의 결과로 보아 HT074가 위점막에서 항산화 효소와 GSH 함량을 증가시키고 MUC5AC 유전자 발현을 증가시켜 위점막의 공격인자인 HCl/EtOH에 의한 산화적 스트레스로 부터 위점막을 보호하는데 도움을 주며, 위염 및 위궤양의 예방 및 치료에 효과적인 후보소재로 활용될 수 있다고 생각된다.

감사의 글

본본 연구는 미래창조과학부 및 한국연구재단의 (재)유전 자동의보감사업단(NRF-2012M3A9C4048795) 연구비 지원에 의해 수행되었습니다.

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