소리쟁이 뿌리 추출물과 분획물의 항산화 활성 김인용

소리쟁이 뿌리 추출물과 분획물의 항산화 활성

김인용¹*․이지연²*․정윤화^1,2

1천연물식의약소재산업화연구센터

2단국대학교 식품영양학과

Antioxidant Activities of Rumex crispus L. Root Extracts and Fractions

Inyong Kim^1*, Jiyeon Lee^2*, and Yoonhwa Jeong^1,2

1Research Center for Industrialization of Natural Nutraceuticals, and

2Department of Food Science and Nutrition, Dankook University

ABSTRACT In this study, we investigated the antioxidant activities of Rumex crispus L. root water, ethanol extracts (WE, EE), and various fractions, including n-hexane fractions (HF), dichloromethane fractions (DCMF), ethyl acetate fractions (EAF), n-butanol fractions (BF), and aqueous fractions (AF). In all of the extraction and fractions, the highest total phenolic content was measured as 83.26 mg gallic acid equivalent/g in the EAF, whereas the highest total flavonoid content was measured as 30.67 mg quercetin equivalent/g in the DCMF. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, hydroxyl, and superoxide radical scavenging activities increased in a concentration-dependent manner in all extracts and fractions.

The highest ferric reducing antioxidant power was measured as 135.58 mM FeSO4/g in the EAF, and the remaining were in descending order: EE, AF, DCMF, WE, BF, and HF. The highest Trolox equivalent antioxidant capacity was measured as 5.65 mM TE/g in the EAF, and the remaining were in descending order: DCMF, EE, AF, BF, and HF. Oxygen radical absorption capacity of the EAF and DCMF were 4,817 and 1,790 mM TE/g, and their values were similar or significantly higher than those of ascorbic acid. Reactive oxygen species scavenging activity of EAF was also significantly higher than the control. Overall, these results mean that the various phenols and flavonoids in EAF have antioxidative function, and EAF of Rumex crispus L. root could be useful as an antioxidant agent for heath functional foods.

Key words: Rumex crispus L. root, extract, antioxidant activity, total phenol, total flavonoid

Received 12 September 2018; Accepted 20 September 2018 Corresponding author: Yoonhwa Jeong, Department of Food Science and Nutrition, Dankook University, Cheonan, Chungnam 31116, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-41-8005-3477

*These authors contributed equally to this work.

서 론

인체 내에서는 산화를 촉진하는 물질과 억제하는 물질이 인체 내에 서로 평형을 이루고 있지만, 산화제와 항산화제의 균형상태가 무너지면 활성산소가 과다하게 생성된다. 활성 산소는 세포호흡 과정에서 필연적으로 발생하며 세포 내 신 호전달물질로 작용한다. 또한, 외부로부터 인체 내로 침입하 는 각종 병원성 미생물에 의해 야기되는 면역 염증반응에서 대식세포의 산화 분출(oxidative burst)을 통해 병원체를 효 과적으로 제거할 뿐만 아니라(1), 체내에서 발생하는 기형 세포와 조직, 기타 노화 세포들을 제거하는 역할을 하는 등 인체 면역 염증반응의 긍정적인 일면을 담당하고 있다. 하지 만 과도한 활성산소의 생성은 단백질 분해, 지질 과산화, DNA 변형 등을 초래하여(2,3) 세포의 항상성을 파괴하는

데, 활성산소의 산화적 대사산물인 자유라디칼의 반응성이 커서 인체 세포와 반응하게 되면 세포막을 변질시키기 때문 이다(4). 결국 세포 사멸을 유도하여 조직 내에 치명적인 손 상으로 암(5), 알츠하이머병(6), 파킨슨병(7) 등을 유발하게 된다.

인체 내에는 활성산소나 자유라디칼에 의한 손상을 최소 화할 수 있는 방어시스템인 superoxide dismutase(8), cat- alase, glutathione peroxidase(9)와 같은 항산화 효소와 L-ascorbic acid, uric acid 등의 수용성 항산화 물질, α- tocopherol, carotenoids 등의 지용성 항산화 물질들이 있 다. 합성 항산화제인 butylated hydroxytoluene, buty- lated hydroxyanisole 등을 과량 섭취할 경우 지질변화, 신 장, 간, 폐, 위장 점막, 순환계 등에 독성을 일으키는 것으로 알려져 안전성의 문제가 제기되었고(10,11) 현재는 그 부작 용에 대한 염려 때문에 사용을 자제하고 있다. 이미 알려진 천연소재로는 녹차나 포도에 함유된 폴리페놀류의 cat- echin이 있으며(12), 한국산 당귀에서 추출한 INM176의 베 타아밀로이드 축적 예방, 항산화 작용, 신경보호 작용이 보 고되어 있다(13). 또한, Horphag Research Ltd.사(Gene-

va, Switzerland)에 의해 프랑스의 남부 해안지방 해송의 수피로부터 항산화 물질인 pycnogenol이 추출 개발되었으 며, 알츠하이머 질환 예방 및 항산화 활성에 관한 연구도 보고되었다(6,14).

소리쟁이(Rumex crispus L.)는 지역에 따라 솔고쟁이, 소루쟁이 등 여러 이름으로 불리는 마디풀과에 속하는 다년 생 초본식물로서 예로부터 어린순을 식용 및 약용으로 이용 하고 있다(15). 한방에서는 소리쟁이의 뿌리가 청열, 양혈, 화담, 지해, 통변에 효능이 있다고 알려져 있으며, 급성간염, 토혈, 변비 등의 다양한 처방 제재로 활용되고 있다(16). 소 리쟁이 뿌리에 함유된 성분으로 anthraquinone 화합물인 chrysophanol, emodin, nepodin, anthrone, 1,5-dihy- droxyanthraquinone 등이 존재한다고 보고되었다(17). 또 한, 2,6-dichloro-4-nitrophenol, 2-isopropyl-5-meth- ylphenol, 4-vinyl-2-methoxy-phenol, 2,3-dihy dro- benzofuran과 같은 물질이 존재하며, 이들이 butylated hydroxyanisole이나 ascorbic acid와 유사한 항산화 활성 을 나타내는 것으로 보고되었다(18). 소리쟁이 뿌리 추출물 에 대한 항산화 활성에 대한 많은 연구 결과가 있지만, 추출 물과 추출 분획물의 항산화 활성에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 소리쟁이 뿌리의 추출물과 분획물 을 사용하여 다양한 방법으로 활성산소 소거 활성 측정으로 소리쟁이의 산화적 스트레스 억제 효과를 조사하였다.

재료 및 방법

재료 및 시약

소리쟁이의 뿌리(경북 영천)는 대구광역시(대아약초)에 서 구입하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu reagent, gallic acid, aluminum nitrate, quercetin, 1,1-diphenyl-2-pic- rylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothia- zoline-6-sulfonic acid)(ABTS) tablet, 2,2’-azobis(2- amidino-propane) dihydrochloride(AAPH), fluorescein sodium, nitroblue tetrazolium(NBT), phenazine metho- sulfate(PMS), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman- 2-carboxylic acid, 2,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 에서, 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ)은 Tokyo Chemical Industry Co.(Tokyo, Japan)에서, dimethyl sulfoxide는 Kanto Chemical Co.(Tokyo, Japan)에서, fe- tal bovine serum, penicillin, streptomycin은 WELGENE (Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

시료의 추출물 제조

건조된 시료는 물과 에탄올로 추출하였다. 물 추출물(WE) 은 건조된 시료 100 g에 증류수 1 L를 넣고 98°C에서 4시간 씩 3회 환류 추출한 직후, 감압 여과 및 농축하여 동결 건조

하였다. 에탄올 추출물(EE)은 건조된 시료 100 g에 99.8%

에탄올 1 L를 넣고 78°C에서 위와 같은 과정으로 제조하였 다. 분획물은 획득한 EE를 극성이 다른 각각의 용매 즉, n-hexane(HF), dichloromethane(DCMF), ethyl acetate (EAF), n-butanol(BF) 그리고 aqueous layer(AF)로 계통 분획하여 진공 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.

총 페놀 함량 측정

총 페놀 함량은 Folin Dennis 방법(19)을 변형하여 측정 하였다. 1 mg/mL 농도의 추출물 100 μL와 증류수 3.5 mL 를 섞은 후 50% Folin-Ciocalteu reagent 500 μL를 가하여 vortex mixer로 1분간 혼합한 후 2시간 동안 암실에 정치하 였다. 다시 20% Na2CO3 용액 500 μL를 가하고 암실에서 1시간 방치한 후 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid는 0~200 μg/mL의 농도로 제조하여 위와 같은 방법으 로 720 nm에서 흡광도를 측정하여 추출물의 총 페놀 함량 을 산출하였다.

플라보노이드 함량 측정

플라보노이드 함량은 Park(20)의 방법을 이용하여 측정 하였다. 1 mg/mL 농도의 추출물 500 μL에 에탄올 1.5 mL, 10% aluminum nitrate 100 μL 및 1.0 M potassium ace- tate 100 μL, 증류수 2.8 mL를 혼합하고 실온에서 40분간 방치한 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 10%

aluminum nitrate 대신 증류수 100 μL를 사용하였다. 추출 물의 총 플라보노이드 함량은 quercetin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 얻어진 표준 검량선으로부터 산출하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois 방법(21)을 변형하여 측정하였다. DPPH 용액(1.5×10^-4 M) 160 μL와 농도별 시 료 40 μL를 혼합, 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 micro- plate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하였다. 결과는 농도별 소거 활성과 effective concentration 50%(EC50)로 표기하였다.

Superoxide 라디칼 소거 활성 측정

Superoxide 라디칼 소거 활성 측정은 시료 50 μL, 150 μM NBT 50 μL와 468 μM β-nicotinamide adenine dinu- cleotide(NADH) 50 μL를 섞어준 후, 60 μM PMS 50 μL를 혼합하고 실온에서 5분간 방치하였다. 이때 생성된 for- mazan을 측정하기 위해 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 농도별 소거 활성과 EC50으로 표기하였다(22).

Hydroxyl 라디칼 소거 활성 측정

Hydroxyl 라디칼 소거 활성은 LeBel과 Bondy의 방법 (23)을 이용하여 측정하였다. 각 농도의 시료 10 μL와 1 mM H2O2, 0.2 mM FeSO4를 혼합하여 37°C에서 5분 동안

Table 1. Extraction yields of Rumex crispus L. root by water and ethanol including their fractions

Extracts of water

and ethanol Yield

(%)¹⁾ Step-wise

extracts Yield (%) Water

Ethanol

20.65 16.49

－ Hexane Dichloromethane

Ethyl acetate Butanol Aqueous

－ 4.86 0.68 2.93 6.32 1.37

1)The values on the table are calculated in percentage (w/w) from the raw material (100%).

Table 2. Total contents of phenol and flavonoid of Rumex crispus L. root extracts and fractions

Sample¹⁾ Total phenolic content

(mg GAE/g)²⁾ Total flavonoid content (mg QE/g)³⁾ WE

EE HF DCMF

EAF BF AF

17.25±1.12^d4)5) 21.84±1.15^c 10.68±0.06^e 28.16±1.42^b 83.26±2.49^a 19.03±1.04^cd 19.79±0.32^cd

13.04±1.40^de 14.58±0.61^d 24.15±0.47^b 30.67±0.97^a 21.31±0.33^c 11.28±0.40^e 11.52±0.70^e

1)WE, water extract; EE, ethanol extract; HF, hexane fraction;

DCMF, dichloromethane fraction; EAF, ethyl acetate fraction;

BF, butanol fraction; AF, aqueous fraction.

2)Gallic acid equivalent.

3)Quercetin equivalent.

4)All value are mean±SEM of triplicate analysis.

5)Means with different superscripts (a-e) in the same column are significantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

반응시킨 후, esterase로 처리된 2 μM DCFH-DA를 혼합하 여 30분간 생성된 형광의 변화를 excitation wavelength 460 nm, emission wavelength 530 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 결과는 농도별 소거 활성과 EC50으로 표기하였다.

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정 FRAP assay는 Benzie와 Strain(24)의 방법을 이용하였 다. 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl3･6H2O를 각각 10:1:1(v/v/

v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다. 추출물 50 μL와 FRAP 시약 1.5 mL를 혼합하여 넣고 37°C에서 30분 간 반응시킨 다음 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 는 FRAP 활성 1 g당 해당하는 환원력을 표준물질인 FeSO4･ 6H2O 표준곡선을 작성하여 시료의 환원력(mM FeSO4/g) 으로 나타내었다.

Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) 측정 ABTS를 7 mM 농도로 증류수에 용해한 후, 2.45 mM potassium persulfate를 섞어 암소에서 16시간 동안 방치 해 ABTS 라디칼을 생성시켜 734 nm에서 흡광도가 0.70±

0.02가 되도록 조정하여 사용하였다. ABTS 용액 1 mL와 시료 50 μL를 혼합하여 흡광도 값을 측정하고 표준물질로 Trolox를 사용하여 농도별 검량선(0, 0.125, 0.25, 0.5와 1 mM)을 작성하였고, TEAC 값은 mM Trolox equivalent/g (mM TE/g)으로 나타내었다(25).

Oxygen radical absorbance capacity(ORAC) 측정 ORAC는 Prior 등(26)의 방법을 변형하여 측정하였으며 과산화물 생성을 위해 AAPH를 사용하였다. 96-well black microplate에 1,000 nM의 fluorescein solution 150 μL와 시료 50 μL를 넣고 37°C에서 10분간 incubation 한 후, 25 μL의 120 mM AAPH를 혼합한 다음 fluorescence spec- trophotometer로 형광의 강도를 측정하였다(excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm). 결 과는 시료와 대조군의 형광도 간의 면적(area under curve) 차이로 계산하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 Minitab 16(Minitab Inc., State Col- lege, PA, USA) 프로그램의 one-way ANOVA로 통계처리 하였으며 Tukey test 방법으로 검증하여 P 값이 0.05 미만 을 유의한 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

소리쟁이 뿌리의 추출 수율, 총 페놀 함량, 플라보노이드 함량

소리쟁이 뿌리의 추출물과 분획물의 추출 수율은 Table

1과 같다. WE 및 EE 수율은 각각 20.65%, 16.49%로 WE가 더 높았으며, 소리쟁이의 구성 성분 중 극성이 큰 성분들이 많으므로 극성이 4.3인 에탄올보다 10.2인 물에 더욱 잘 추 출된 것으로 생각된다.

EE를 다시 n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol 그리고 aqueous layer로 계통 분획한 결과, BF 의 수율이 6.32%로 가장 높았으며, 다음으로 HF(4.86%), EAF(2.93%), AF(1.37%) 및 DCMF(0.68%) 순이었다. 다 양한 식물들에서 발견되는 페놀산과 플라보노이드, 타닌 등 의 페놀성 물질은 각각 충분한 생리활성을 가지고 있고 강력 한 항산화제 및 킬레이트제로도 알려져 있다(27). 소리쟁이 뿌리의 추출물과 분획물의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 Table 2와 같다. 총 페놀 함량은 EAF에서 83.26 mg gallic acid equivalent/g(mg GAE/g)으로 가장 높았으 며, DCMF(28.16 mg GAE/g), EE(21.84 mg GAE/g), AF (19.79 mg GAE/g), BF(19.03 mg GAE/g), WE(17.25 mg GAE/g), HF(10.68 mg GAE/g)의 순이었다. 이처럼 WE와 EE 추출물과 추출 후 다른 유기용매에 의해 분획에 따른 추 출 함량의 차이는 페놀성분이 가지고 있는 극성과 유기용매 가 가지고 있는 극성의 차이에 기인하는 것이라고 여겨진다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of Rumex crispus L.

root extracts and ethanol fractions. EC50 means the effective concentration of substance that causes 50% of the maximum response. Means with different letters (a-e) on bars are sig- nificantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<

0.05. WE, water extract; EE, ethanol extract; HF, n-hexane frac- tion; DCMF, dichloromethane fraction; EAF, ethyl acetate frac- tion; BF, n-butanol fraction; AF, aqueous fraction.

Table 3. DPPH radical scavenging activity of Rumex crispus L. root extracts and fractions

Sample¹⁾ 6.25²⁾ 12.5 25 50 100 200

WE EE HF DCMF

EAF BF AF Ascorbic acid

5.8±1.37^f3)4) 9.7±1.97^e 1.8±1.55^e 8.4±1.82^d 37.4±13.91^d 6.4±1.11^e 14.1±3.40^e 66.6±0.39^d

19.0±1.60^e 20.6±2.75^d 4.4±1.52^e 16.8±2.80^de 55.0±2.20^c 18.9±4.31^d 24.8±2.19^d 85.1±0.29^b

29.42±0.82^d 37.8±2.19^c 11.2±1.10^d 26.8±3.28^c 70.0±2.11^b 34.1±2.26^c 39.1±3.15^c 86.8±0.06^b

49.8±3.90^c 63.0±3.06^b 22.3±2.20^c 47.9±2.67^b 88.2±2.41^a 54.7±3.65^b 66.0±4.71^b 85.9±0.16^b

73.6±3.43^b 82.9±1.75^a 45.1±6.32^b 66.0±2.39^a 91.2±0.29^a 71.3±4.88^a 83.0±3.33^a 86.1±0.01^ab

82.2±0.53^a 84.8±9.71^a 75.7±5.55^a 75.5±4.58^a 91.0±0.14^a 85.9±1.76^a 84.0±0.35^a 86.0±0.17^a

1)Abbreviations are the same as in Table 2.

2)Concentration (μg/mL).

3)All value are mean±SEM of triplicate analysis.

4)Means with different superscripts (a-f) in the same row are significantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

Kim 등(15)은 소리쟁이 뿌리 추출물을 각기 다른 용매를 사용하여 분획한 결과 EAF에서 총 페놀 함량이 높았다고 보고하였다. 플라보노이드의 함량은 DCMF가 30.67 mg quercetin equivalent/g(mg QE/g)으로 가장 높았으며, 다 음으로 HF(24.15 mg QE/g), EAF(21.31 mg QE/g), EE (14.58 mg QE/g), WE(13.04 mg QE/g), AF(11.52 mg QE/

g), BF(11.28 mg QE/g) 순이었다. 항산화제로 잘 알려진 phenolic acid, flavonoid, anthocyanins 같은 총 페놀의 주요 구성 성분들은 식물의 뿌리나 잎에서 만들어지는 물질 로 천연 항염, 항암, 항산화제로 알려져 있으며 페놀 함량과 항산화 활성은 유의적인 상관관계가 있다고 보고되었다 (28). 하지만 Table 1, 2의 결과, 추출 용매 및 분획물의 수율과 총 페놀과 플라보노이드 함량을 비교해 보았을 때 상관관계는 없는 것이 확인되었고, 이는 추출 용매 및 분획 에 의한 항산화, 항염증 등의 기능성 소실은 없는 것으로 판단된다.

DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 1 및 Table 3과 같다. 모든 추출물과 에탄올 추출물 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 농도 의존적으로 증가하는 경향 을 보였다. EAF(11.9 μg/mL)의 활성(EC₅₀)이 WE와 EE 추 출물과 다른 분획물에 비교하여 높았으며, 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid의 EC50(6.1 μg/mL)과 유사하였다. 다 음으로 AF, EE, BF, WE, DCMF 순의 소거 활성을 보였으며 HF는 가장 낮았고 EC50은 각각 44.2 μg/mL, 46.5 μg/mL, 55.1 μg/mL, 60.8 μg/mL, 65.6 μg/mL 및 126.2 μg/mL였 다. 특히 100, 200 μg/mL 농도에서는 ascorbic acid의 소거 율과 비교하였을 때 유사하거나 높은 경향을 보였다. 이는 총 페놀 함량과 완전히 일치하지는 않았지만, EAF와 HF에 서는 비례함을 확인할 수 있었으며, 소리쟁이 뿌리 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량과 연관에 의한 것으로 판단된 다. Hydroxyl group을 가지고 있는 페놀성 화합물들은 자 유라디칼에 전자나 수소를 공여하여 안정한 화합물로 변화 시킨다고 알려져 있다(29). 이 때문에 DPPH 라디칼을 이용

한 전자공여능 측정법이 많이 활용되고 있고 이를 이용한 소리쟁이 뿌리의 항산화 활성에 관한 연구도 비교적 많이 이 루어지고 있다. Kim 등(30)은 100 μg/mL의 농도에서 96%

의 소거 활성능을 보였으며 한국산 약용식물 중 감잎, 고로 쇠나무 잎, 모과나무 잎, 산수유 잎과 비교하였을 때 더 우수 한 DPPH 소거 활성을 가지고 있음을 확인한 바 있다. 또한, Suh 등(31)의 ethyl-acetate와 butanol을 이용한 소리쟁이 뿌리 추출물의 DPPH 항산화 소거능과 총 페놀 함량이 서로 비례관계가 성립되었다는 연구 결과는 본 연구 결과와 유사 하였다. 따라서 소리쟁이는 높은 폴리페놀 화합물 및 플라보 노이드 함량을 가지는 우수한 항산화 소재라고 생각된다.

Superoxide 라디칼 소거 활성

인체 내에서 미토콘드리아 호흡 중에 생성되는 O₂·^- 자유 라디칼은 강력한 반응성을 동반하지 않는 약산화제이지만 대부분의 산화 반응이 O₂·^-와 긴밀한 연관성을 가지고 있다.

O2·^-의 불균등화로 인하여 과산화수소와 산소가 생성되는

Fig. 2. Superoxide radical scavenging activity of Rumex crispus L. root extracts and ethanol fractions. EC50 means the effective concentration of substance that causes 50% of the maximum response. Means with different letters (a-f) on bars are signifi- cantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

WE, water extract; EE, ethanol extract; HF, n-hexane fraction;

DCMF, dichloromethane fraction; EAF, ethyl acetate fraction;

BF, n-butanol fraction; AF, aqueous fraction.

Table 4. Superoxide radical scavenging activity of Rumex crispus L. root extracts and fractions

Sample¹⁾ 6.25²⁾ 12.5 25 50 100 200

WE EE HF DCMF

EAF BF AF Ascorbic acid

18.7±1.09^f3)4) 15.9±1.38^f 8.47±1.38^c 26.3±2.23^f 49.4±2.90^e 22.7±1.54^f 21.0±1.88^f 11.4±0.64^d

29.7±2.02^e 26.6±2.10^e 9.41±0.90^bc 33.6±1.29^e 67.7±2.25^d 27.0±1.32^e 26.7±1.60^e 12.5±0.64^cd

39.7±3.78^d 40.9±1.88^d 13.1±0.80^bc 46.5±1.02^d 80.4±1.32^c 34.1±0.78^d 33.9±2.73^d 16.0±1.81^cd

50.8±2.03^c 57.8±3.98^c 19.1±2.44^ab 58.1±0.75^c 86.2±0.46^b 46.8±1.51^c 43.2±3.65^c 16.8±0.71^c

62.7±1.31^b 72.1±4.70^b 23.4±0.84^a 70.3±0.80^b 91.7±0.69^a 67.2±1.34^b 60.2±1.32^b 26.4±3.49^b

72.5±0.89^a 76.7±2.33^a 28.8±1.40^a 75.4±1.07^a 91.4±0.73^a 84.1±0.90^a 72.2±0.41^a 41.2±1.15^a

1)Abbreviations are the same as in Table 2.

2)Concentration (μg/mL).

3)All value are mean±SEM of triplicate analysis.

4)Means with different superscripts (a-f) in the same row are significantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

반응 중간체로 작용하여 활성산소의 생성과 직접 연관이 되 어 있는데 이는 세포와 정상적인 조직에 영향을 주어 암이나 당뇨 같은 질병을 유발할 수 있다(32). 소리쟁이 뿌리 추출 물과 분획물의 O2·^- 소거 활성은 Table 4 및 Fig. 2와 같다.

모든 추출물과 분획물에서 O₂·^- 소거 활성이 농도 의존적으 로 증가하는 경향을 보였다. EAF의 EC₅₀이 4.45 μg/mL로서 가장 높았으며 DCMF(45.83 μg/mL), EE(51.72 μg/mL), BF(61.00 μg/mL), WE(61.46 μg/mL), AF(71.29 μg/mL) 의 순이었고, HF와 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid 는 다소 낮았다.

Rhim 등(33)의 연구에서는 소리쟁이 뿌리를 에탄올로 추 출한 후 100 μg/mL, 500 μg/mL 및 1 mg/mL 농도에서의 O₂·^- 소거 활성이 각각 21.5%, 61.1% 및 78.9%였으나, 양 성대조군으로 사용한 catechin의 superoxide 소거 활성은 0.01, 0.1, 0.5 및 1 mg/mL 농도에서 각각 1.8, 22.3, 60.8 및 80.4%의 소거 활성을 보고하였다. 이는 본 연구에서 에탄 올 추출물의 200 μg/mL 농도의 활성(76.7%)이 1 mg/mL

농도에서의 superoxide 라디칼 소거 활성과 유사하여 다소 차이를 보였다. 이는 사용된 소리쟁이 추출물이 특정 부위가 아닌 뿌리, 종자 및 지상부 모든 부위를 사용했기 때문에 차 이가 나는 것으로 생각된다. 분획물로부터의 O₂·^- 소거 활성 에 관한 연구는 이루어지지 않아 본 연구 결과와 비교할 수 없었다.

Hydroxyl 라디칼 소거 활성

지질, 단백질 및 DNA와 반응하여 지질 과산화를 촉진하 는 것으로 알려진 hydroxyl 라디칼은 반응과정 중에 중금속 이온이 있어야 하는 Fenton reduction에 의하여 강력한 활 성산소가 생성된다. 소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획물의 OH·

소거 활성은 Table 5 및 Fig. 3과 같다. 모든 추출물 및 분획 물에서 hydroxyl 라디칼 소거 활성이 농도 의존적으로 증가 하였으며, 특히 모든 추출물과 분획물의 100, 200 μg/mL의 농도에서는 대조군인 Trolox와 비교하였을 때 유사하거나 높은 소거율을 보였다. EAF, DCMF의 EC₅₀은 각각 0.65 μg/mL, 0.54 μg/mL로 가장 높은 OH· 소거 활성을 보였으 며, 이는 대조군인 Trolox와 유사하였다. 반면 AF(43.12 μg/mL), HF(60.05 μg/mL)는 상대적으로 낮은 소거 활성을 보였다. 많은 식물의 생리활성 중 자유라디칼 소거는 2차 대사산물인 폴리페놀 화합물의 phenolic acid, cinnamic acid, flavonoid, anthocyanin, benzoic acid 등과 같은 성분 에 의존적이기 때문에 이들 물질의 함량에 따라 항산화 활성 이 증가하는 경향을 보인다(34,35). 본 연구 결과에서도 폴 리페놀 함량이 EAF, DCMF 순으로 많았고 HF가 가장 적었 는데, 이는 hydroxyl 라디칼 소거 활성 경향과 정확히 일치 하는 것을 확인하였다. Anusuya 등(36)은 Rumex nepal- ensis 뿌리의 물 추출물의 EC₅₀이 32.9 μg/mL라고 보고하 였으며, 본 연구와 유사한 범위의 소거 활성을 보였다.

FRAP assay

FRAP 방법은 DPPH 라디칼 소거 활성과는 다른 항산화 검정법으로 산화환원반응에 의한 메커니즘 즉, Fe³가 Fe²로 환원될 때 발생하는 청색 파장을 특정 파장에서 측정하여

Fig. 3. Hydroxyl radical scavenging activity of Rumex crispus L. root extracts and ethanol fractions. EC50 means the effective concentration of substance that causes 50% of the maximum response. Means with different letters (a-f) on bars are signifi- cantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

WE, water extract; EE, ethanol extract; HF, n-hexane fraction;

DCMF, dichloromethane fraction; EAF, ethyl acetate fraction;

BF, n-butanol fraction; AF, aqueous fraction.

Table 6. FRAP, TEAC, and ORAC Hydroxyl activity of Rumex crispus L. root extracts and fractions

Sample¹⁾ FRAP²⁾

(mM FeSO4/g) TEAC³⁾

(mM TE/g) ORAC⁴⁾ (mM TE/g) WE

EE HF DCMF

EAF BF AF Ascorbic acid

34.5±0.11^d5)6) 48.1±0.47^b 13.7±0.15^e 37.7±0.77^cd 135.6±3.62^a 33.1±0.80^d 40.8±0.16^c 145.3±2.65^a

1.2±0.08^e 2.5±0.11^c 0.4±0.06^f 3.6±0.11^b 5.7±0.00^a 2.0±0.13^d 2.3±0.13^c 3.3±0.13^b

1,286±154^cd 1,396±204^bc 983±88^cd 1,790±246^b 4,817±331^a 909±121^d 945±87^d 1,846±212^b

1)Abbreviations are the same as in Table 2.

2)Ferric reducing antioxidant power.

3)Trolox equivalent antioxidant capacity.

4)Oxygen radical absorption capacity.

5)All value are mean±SEM of triplicate analysis.

6)Means with different superscripts (a-f) in the same column are significantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

Table 5. Hydroxyl radical scavenging activity of Rumex crispus L. root extracts and fractions

Sample¹⁾ 6.25²⁾ 12.5 25 50 100 200

WE EE HF DCMF

EAF BF AF Trolox

31.8±1.09^f3)4) 34.8±0.90^f 30.3±3.09^f 56.7±3.37^f 76.9±1.24^e 47.8±1.14^f 29.3±1.33^f 69.7±0.83^f

35.5±1.66^e 46.9±1.56^e 34.0±2.41^e 68.6±0.52^e 88.8±2.07^d 56.3±1.07^e 35.6±1.39^e 76.2±0.67^e

53.9±1.09^d 57.3±1.84^d 42.3±1.90^d 78.8±0.66^d 100.2±2.25^c 68.5±1.23^d 46.4±2.24^d 81.4±1.01^d

56.4±1.93^c 73.7±1.78^c 51.7±1.48^c 88.8±0.95^c 107.1±0.94^b 77.6±1.29^c 57.7±0.98^c 86.4±1.68^c

70.2±1.61^b 87.4±1.21^b 65.5±0.53^b 94.0±2.62^b 109.2±0.93^a 88.5±1.25^b 72.0±0.96^b 89.0±0.88^b

85.5±1.03^a 98.8±0.72^a 81.0±1.01^a 100.3±4.26^a 109.1±1.15^a 99.3±0.72^a 86.4±1.03^a 91.3±0.87^a

1)Abbreviations are the same as in Table 2.

2)Concentration (μg/mL).

3)All value are mean±SEM of triplicate analysis.

4)Means with different superscripts (a-e) in the same column are significantly different by Tukey’s multiple comparison test at P<0.05.

환원력을 계산하는 방법이다. 이 때문에 환원력에서의 흡광 도 수치는 그 자체가 시료의 환원력을 나타내며, 높은 항산 화 활성을 가질수록 흡광도의 수치가 높게 나타난다. FRAP assay 결과는 Table 6과 같다. EAF의 환원력은 135.6 mM FeSO₄/g으로 가장 높았으며, ascorbic acid(145.3 mM FeSO₄/g)와 유사하였다. 다음으로 EE(48.1 mM FeSO₄/g), AF(40.8 mM FeSO₄/g), DCMF(37.7 mM FeSO₄/g), WE (34.5 mM FeSO4/g), BF(33.1 mM FeSO4/g), HF(13.7 mM FeSO4/g) 순으로 FRAP 값이 높았다. 이러한 결과는 DPPH의 항산화 소거능과 유사한 경향을 보였다. Hydrox- yl group을 가지고 있는 페놀 화합물들은 수소이온을 내주 어 산화제로 작용하는 Fe³ 이온을 Fe²로 환원시켜 자유라디 칼을 중화시키는 것으로 알려져 있다(37). 즉, 추출물 및 분 획물의 hydroxyl groups에 의한 환원력이 높아져 활성산소 연쇄반응을 억제함으로써 항산화 활성을 나타낸 것으로 보 인다. Kim 등(30)의 연구에 의하면 소리쟁이 주정 추출물의 FRAP 값이 5.47 mM Fe²/g으로 나타났으며, 여주잎의 FRAP 값은 0.42 mM Fe²/g, 오미자 껍질은 0.30 mM Fe²/g

으로 소리쟁이 추출물의 FRAP 활성이 10배 정도 큰 항산화 활성을 가지고 있다고 보고하였다. 본 연구에서의 소리쟁이 추출물의 환원력과 비교하였을 때 같은 mM/g 농도에서 환 원력이 낮은 이유는 추출에 사용된 용매의 차이에서 오는 것이라 여겨진다. 반면, Maksimovic 등(38)은 소리쟁이 열 매의 메탄올 추출물의 FRAP 값이 9.9 mM FeSO₄/g이라고 보고하여 뿌리 추출물의 환원력이 열매 추출물의 환원력보 다 높은 것으로 생각된다.

TEAC 라디칼 소거 활성

TEAC assay 방법은 ABTS 양이온 라디칼의 흡광도가 항산화제에 의해 감소하는 원리에 기초한 것으로 potas- sium persulfate와 ABTS의 산화에 의해 라디칼을 형성시 킨 후 각각의 시료에 대한 자유라디칼 소거능을 측정함으로 써 항산화능을 확인할 수 있다. TEAC 라디칼 소거 활성은 0.43~5.65 mM TE/g(Table 6)이었으며, 각 분획물의 차이 가 크게는 13배 이상이었다. 소리쟁이의 EAF가 5.65 mM TE/g으로 항산화 활성이 가장 컸으며 ascorbic acid(3.3 mM

TE/g)보다 높았다. 다음으로 DCMF(3.6 mM TE/g), EE (2.5 mM TE/g), AF(2.3 mM TE/g), BF(2.0 mM TE/g), WE(1.2 mM TE/g) 및 HF(0.4 mM TE/g)의 순이었다. 소리 쟁이 뿌리는 페놀성 화합물과 함께 anthraquinones도 함유 하고 있고, 이들을 포함하여 carotenoids, flavonoids 등은 모두 phytochemical로써 항암, 항염 및 항산화 활성이 뛰어 난 화합물로 알려져 있다. Wu 등(39)은 anthraquinones을 가지고 있는 Aspergillus versicolor를 TEAC assay를 통 해 항산화 활성을 확인하였다고 보고하였다. 본 연구 결과에 서 총 페놀 함량과 ABTS 라디칼 소거 활성은 유사한 경향성 을 나타내었으며, 에틸아세테이트 추출물의 IC50 값은 0.17 μg/mL로 ascorbic acid의 3.35 μg/mL보다 높은 ABTS 라 디칼 소거 활성을 가지고 있었다. Butanol 분획, chloro- form 분획, methanol 분획, 물 추출물 순(21.42~133.4 μg/

mL)으로 ABTS 라디칼 소거 활성을 보이며, hexane 분획 의 경우 이 소거 활성을 확인할 수 없었다고 보고한 Kim 등(15)의 연구 결과와 비교하였을 때 일치한 경향성을 나타 냈다.

ORAC assay

ORAC assay는 peroxyl 라디칼에 의해서 야기된 과산화 에 대한 항산화 물질의 저해 정도를 측정하기 위하여 고안된 실험방법으로 식품에 대한 항산화력을 평가할 수 있는 대표 적인 항산화 지표로 사용되고 있다. 소리쟁이의 ORAC 값은 Table 6과 같다. EAF의 ORAC 값은 4,817 mM TE/g으로 ascorbic acid의 ORAC 값인 1,846 mM TE/g보다 더 높았 으며, DCMF(1,790 mM TE/g), EE(1,396 mM TE/g), WE (1,286 mM TE/g), HF(983 mM TE/g), AF(945 mM TE/

g), BF(909 mM TE/g)의 순이었다. 본 연구에서 결과 값이 다른 항산화 연구의 값보다 높은 것은 ORAC 방법이 친수성 항산화 성분과 친유성 항산화 성분에 모두 반응하기 때문으 로 판단된다. 이러한 결과는 본 연구에서 추출물과 분획물의 총 페놀 함량 패턴과 거의 유사한 경향을 보였다. 이는 Hwang 등(40)의 감귤 추출물의 페놀성 화합물 함량과 ORAC 간의 상관계수를 분석한 연구에서 상관관계가 0.884로 밀접한 관계가 있다고 보고한 것과 일치함을 확인하였다. 따라서 소리쟁이 뿌리 추출물 또한 높은 페놀성 화합물로 인한 우수 한 항산화 활성을 나타내는 것이라고 판단된다.

요 약

본 연구에서는 소리쟁이 뿌리의 항산화 활성을 확인하고자 물과 에탄올 추출물 및 에탄올 분획을 이용하여 다양한 항산 화 실험을 통해 활성산소종의 소거 활성을 확인하였다. 소리 쟁이 뿌리에 포함된 총 페놀 함량은 EAF가 83.26±2.49 mg GAE/g으로 유의적으로 가장 높았으며, DCMF, EE, AF, BF, WE 및 HF의 순이었다. 반면 총 플라보노이드 함량은 DCMF에서 30.67±0.97 mg QE/g으로 가장 높았다. DPPH

소거 활성에서는 모든 추출물과 분획물에서 농도 의존적으 로 높아졌음을 확인할 수 있었으며, EAF는 EC₅₀ 값이 11.9

±2.5 μg/mL로 양성대조군인 ascorbic acid와 비슷한 활성 을 나타내었다. Superoxide 라디칼 소거 활성 및 hydroxyl 라디칼 소거 활성 역시 모든 추출물과 분획물이 농도에 비례 하여 증가하였다. 특히 superoxide 라디칼 소거 활성은 모 든 추출물과 분획물에서 ascorbic acid보다 높거나 유사했 던 반면, hydroxyl 라디칼 소거 활성은 EAF와 DCMF에서 대조군인 Trolox와 유사한 활성을 나타내었다. ABTS를 이 용한 라디칼 소거 활성, FRAP를 이용한 총 항산화능 측정 및 ORAC에 의한 항산화 활성을 측정한 결과에서도 소리쟁 이 뿌리 추출물과 분획물에서 항산화능을 확인할 수 있었고 ORAC 법에서는 EAF에서 양성대조군인 ascorbic acid보다 훨씬 높은 항산화능을 가지고 있음을 확인하였다. 본 연구 결과에서 EAF의 항산화 활성이 유의적으로 가장 높은 반면, HF의 항산화 활성은 비교적 낮았으나 전체적으로 소리쟁이 뿌리 추출물과 분획물의 다양한 라디칼의 소거 활성과 환원 력으로 강력한 항산화 효과를 나타내며, 이러한 효능은 적어 도 자유라디칼의 산화 억제와 높은 총 페놀 함량에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서 소리쟁이 분획 추출물이 활성산소 에 의해 발생하는 산화적 스트레스를 예방 차원에서 효과적 으로 감소시킬 수 있는 항산화제로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

감사의 글

본 논문은 농림축산식품부 농림축산식품연구센터지원사업 (과제번호: 714001-07-5-SB110)의 지원에 의해 수행되 었으며, 이에 감사드립니다.

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