원고 접수일 2012년 7월 30일, 원고 수정일 2012년 9월 10일, 게재 확정일 2012년 11월 22일
책임저자 변준호
(660-702) 진주시 강남로 79, 경상대학교 의학전문대학원 구강악안면외과학교실, 경상대학교 건강과학연구원, 의생명과학사업단(BK21)
Tel: 055-750-8258, Fax: 055-761-7024, E-mail: [email protected]
RECEIVED July 30, 2012, REVISED September 10, 2012, ACCEPTED November 22, 2012
Correspondence to June-Ho Byun
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Gyeongsang National University School of Medicine, Institute of Health Sciences, Biomedical Center (BK21)
79, Gangnam-ro, Jinju 660-702, Korea
Tel: 82-55-750-8258, Fax: 82-55-761-7024, E-mail: [email protected]
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인간 골막기원세포와 Polydioxanone/Pluronic F127 담체를 이용한 골형성
박봉욱ㆍ이진호1ㆍ오세행1ㆍ김상준1ㆍ하영술2ㆍ전령훈3ㆍ맹건호3ㆍ노규진3ㆍ김종렬4ㆍ변준호
경상대학교 의학전문대학원 구강악안면외과학교실, 경상대학교 건강과학연구원, 의생명과학사업단(BK21),
1한남대학교 생명나노과학대학 신소재공학과, 2경상대학교병원 임상의학연구소, 3경상대학교 수의과대학 수의산과, 4온 종합병원 턱얼굴센터
Abstract
In vivo Osteogenesis of Cultured Human Periosteal-derived Cells and Polydioxanone/Pluronic F127 Scaffold
Bong-Wook Park, Jin-Ho Lee 1 , Se-Heang Oh 1 , Sang-June Kim 1 , Young-Sool Hah 2 , Ryoung-Hoon Jeon 3 , Geun-Ho Maeng 3 , Gyu-Jin Rho 3 , Jong-Ryoul Kim 4 , June-Ho Byun
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Gyeongsang National University School of Medicine, Institute of Health Sciences, Gyeongsang National University, Biomedical Center (BK21),
1Department of Advanced Materials, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University,
2Clinical Research Institute, Gyeongsang National University Hospital,
3
Department of Obstetrics/Theriogenology and Biotechnology, College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University,
4
Maxillofacial Center, On Hospital
Purpose: The purpose of this study is to examine in vivo osteogenesis of cultured human periosteal-derived cells and poly- dioxanone/pluronic F127 scaffold.
Methods: Two one-year-old miniature pigs were used in this study. 2×106 periosteal-derived cells in 1 mL medium were seeded by dropping the cell suspension into the polydioxanone/pluronic F127 scaffold. These cell-scaffold constructs were cultured in osteogenic Dulbecco's modified Eagle's medium for 7 days. Under general anesthesia with azaperone and tilet- amine-zolazepam, the mandibular body and ramus of the pigs were exposed. Three bony defects were created.
Polydioxanone/pluronic F127 scaffold with periosteal-derived cells and the scaffold only were implanted into each defect.
Another defect was left empty. Twelve weeks after implantation, the animals were sacrificed.
Results: New bone formation was clearly observed in the polydioxanone/pluronic F127 scaffold with periosteal-derived cells.
Newly generated bone was also observed in the scaffold without periosteal-derived osteoblasts and empty defect, but was mostly limited to the periphery.
Conclusion: These results suggest that cultured human periosteal-derived cells have good osteogenic capacity in a poly- dioxanone/pluronic F127 scaffold, which provides a proper environment for the osteoblastic differentiation of these cells.
Key words: Periosteal-derived cells, Polydioxanone scaffold, In vivo osteogenesis
서 론
골 조직공학의 최종 목표는 정상적인 골조직과 유사한 조직을 형성하는 것이라 할 수 있으므로 이를 위해서는 골 전구세포의 조골세포로의 분화뿐 아니라 다공성을 나타내며 삼차원적 구조를 가지는 적절한 담체로의 적용 및 광화가 이루어져야 한다. 이상적 인 담체는 적용된 후, 주위조직과의 생물학적 반응 동안 생체적합 성과 서서히 체내에서 분해되며 자가조직으로 치환되는 생분해성 을 가지고 있는 것이라 할 수 있으며 이에 덧붙여 조직공학적으로 는 배양된 세포와의 상호작용을 통하여 관련 세포의 표현형의 발현에 긍정적인 효과를 제공하여야 한다고 할 수 있다. 담체와 관련하여 콜라겐 등의 천연고분자, 수산화인회석이나 인산칼슘과 같은 바이오세라믹, 그리고 합성 고분자 등, 상당히 다양한 담체가 조직공학 분야에 실질적으로 이용되고 있다. 콜라겐의 경우 골 유기질 성분의 약 95%를 담당하고 있으며 특정세포와의 유합 시, 이 세포들을 위한 기질 역할과 함께 적절한 표현형의 발현 등에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 조직공학적 골형성뿐 아니라 조직공학적인 피부형성, 혈관이식 및 연골형성 등에 많이 이용되고 있는 실정이다[1-4]. 이전에 본 연구자들은 합성고분자 의 하나인 다공성 polydioxanone/pluronic F127 담체에 인간 골막기원세포를 유입하여 그 조골활성 정도를 생체외(in vitro) 세포배양 실험을 통하여 평가한 적이 있는데 본 연구에서는 미니 돼지를 이용하여 다공성 polydioxanone/pluronic F127 담체에 인간 골막기원세포를 유입하여 그 골형성 정도를 평가하였다[5].
적절한 강도를 가지고 있는 polydioxanone은 생체적합성과 서 서히 생체내 분해되는 생분해성으로 이미 여러 의학관련 분야에서 이용되고 있다[6-8]. 합성고분자를 배양된 세포와 함께 적용하여 생체적합성 세포-담체 형성물의 제작을 위해서는 담체의 표면에 친수성 처리를 시행하여 관련된 세포가 잘 접착하고 증식할 수 있도록 하여야 한다. 본 연구에 사용된 담체는 친수성 처리를 위한 부가제로 pluronic F127을 사용한다. Polyethylene glycol 과 polypropylene glycol에 대한 수용성의 혼성중합체로 생체적 합성이 뛰어나고 부착되는 세포들에 대하여 특이적인 독성을 잘 나타내지 않는 것으로 알려진 pluronic F127을 부가제로 사용하 여 담체로 적용된 인간 골막기원세포의 부착 및 증식을 촉진시키 도록 하였다. 그리하여 본 연구에서는 미니돼지를 이용한 동물실 험을 통하여 다공 크기가 100∼200 μm이며 표면처리 기술의 하나인 미세분말 열압착법(melt-molding particulate-leaching method)을 통하여 제작된 친수성 polydioxanone/pluronic F127 담체에 인간 골막기원세포를 유입하여 그 골형성 정도를 평가하고자 한다.
연구방법
1. 다공성 polydioxanone/pluronic F127 담체의 제작
이전에 언급된 방법을 통하여 다공성 polydioxanone/pluronic F127 담체를 제작하였다[5]. 이의 과정을 간단히 요약하면, poly- dioxanone (molecular weight 200,000, Samyang, Ulsan, Korea)와 pluronic F127 (molecular weight 12,500, BASF, Mount Olive, NJ, USA)이 일정비율로 혼합되어 있는 poly- dioxanone/pluronic F127 입자를 냉동 분쇄기를 이용하여 균일 한 미세 혼합분말로 만들고 80
oC로 예열된 열압착기를 이용하여 polydioxanone/pluronic F127 필름을 제조한 다음, 미세분말 열압착법을 통하여 배양된 세포들이 잘 유입될 수 있도록 친수성 처리를 하였다. 미세분말 열압착법과 관련하여서는, 다공성을 위 하여 NaCl 입자를 막자 사발을 이용하여 분쇄한 후, 횡동 재질로 제작된 몰드에 NaCl 입자를 균일하게 분포시키고 몰드에 맞게 제작한 polydioxanone/pluronic F127 필름 시료를 위치시킨 후, 다시 NaCl 입자를 균일하게 덮어주었다. 이후 이 몰드를 180oC로 미리 예열시킨 압축성형기에서 압축시킨 후, 분리하고 분리된 몰드에 NaCl 결정이 함유된 디스크형 시편을 얻었다.
이 시편을 차가운 물에서 4시간 동안 세척하여 NaCl 결정을 완전 히 제거한 후, 24시간 상온에서 진공 건조하여 다공성, 친수성 및 유연성을 가지는 다공성 고분자 담체를 제조하였다. 골 조직공 학에서는 주로 100∼200 μm 정도의 다공 크기가 유리하다는 의견이 많음을 고려하여 본 연구에 이용하고자 하는 친수성 poly- dioxanone/pluronic F127 담체는 다공의 크기가 100∼200 μm 이고 10×10 mm의 크기를 가지며 높이는 4∼5 mm 정도가 되도록 제작하였다[9-11].
2. 골막조직으로부터 골막기원세포의 채취 및 polydioxanone/
pluronic F127 담체로의 유입
골막기원세포를 추출하고 증식하는 과정은 이전 연구방법에
의하여 실시하였다[5,12]. 간단히 요약하면, 경상대학교병원의 윤
리위원회(GNUHIRB-2009-057)를 따르고 환자 동의하에 매복된
하악 제3대구치의 발치과정에서 약 5×20 mm의 골막을 채취하
여 여러 개의 조각으로 자르고 100 mm culture dish에 넣은
후 넣은 후 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin,
그리고 100 μg/mL streptomycin이 함유된 Dulbecco's modi-
fied Eagle's medium (DMEM) 배지에서 37
oC, 5% CO
2배양기
를 통하여 배양하였다. 약 90%의 세포군집(confluence)을 나타
내면 증식된 세포들을 트립신 처리시키고 1,500 rpm에서 원심분
리하여 계대배양을 실시하였다. Passage 3을 거친 후, 골막기원
세포들은 2×10
6cells/plate의 밀도로 100 mm plate에 주입하
고 골형성 유도인자인 50 μg/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate,
Fig. 1. Alkaline phosphatase (ALP) staining in periosteal-derived
cells. ALP-positive periosteal-derived cells are indicated by blue/purple staining. ALP expression increased up to 2 weeks with a decrease thereafter. Bar=200 μm.10 mM β-glycerophosphate, 그리고 10 nM의 dexamethasone 이 함유된 DMEM로 구성된 골형성 유도 배지에서 배양하였다.
1 mL의 배양액에 함유된 약 2×10
6개의 골막기원세포를 poly- dioxanone/pluronic F127 담체에 여러 번 뿌린 후, 이 세포-담체 형성물을 골형성 유도배지에서 배양하였다.
3. 알칼리성 인산분해효소에 대한 조직화학적 검사(histo- chemical detection of Alkaline phosphatase) 및 alizarin red S 염색
인산염 식염수로 세포층을 세척한 후, 3.7% 포름알데히드와 90% 에탄올로 2분간 고정하고 10분간 Tris Buffer saline (TBS) 에 세척하였다. 이후 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 와 nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT, Amresco, Solon, OH, USA) 알칼리성 인산분해효소 기질로 실온에서 10분간 염색하여 알칼리성 인산분해효소의 발현을 관찰하였다. 무기질이 침착된 기질을 적색으로 표현되게 하는 alizarin red S 염색을 통하여 골기질 형성 정도 또한 관찰하였다. 배양된 세포를 인산염 식염수 로 세척하고 4% 포름알데히드로 10분간 고정하였다. 이후 2%
alizarin red S 용액으로 5분간 부드럽게 진탕한 후 탈염수로 여러 번 세척하여 여분의 염색액을 제거하였다. 알칼리성 인산분
해효소에 대한 조직화학적 검사와 alizarin red S 염색은 배양 1, 2, 그리고 3주에 시행하였다.
4. 골막기원세포가 함유된 polydioxanone/pluronic F127 담체를 미니돼지에 이식
경상대학교 수의과대학의 동물실험 윤리규정을 준수하면서 두 마리의 생후 약 1년 된 미니돼지를 이용한 동물실험을 진행하였다.
kg당 4 mg의 azaperone (Janssen, Beerse, Belgium)과 kg당
10 mg의 tiletamine-zolazapam (Virbac, Carros, France)을
이용하여 전신마취시킨 후, 악하부 절개 및 접근을 통하여 하악골
의 골체부와 하악지를 노출시켰다. 미니돼지에서 의미있는 골형
성을 관찰하기 위하여 담체의 크기와 유사하게 3개의 결손부를
형성하여 두 곳에는 각각 골형성 배지에서 1주일 배양된 세포-담
체물과, 골막기원세포 유입이 없는 담체를 주입하고 나머지 한
결손부는 빈 공간을 유지시켰다. 시술 후, 상처 부위는 층층 봉합
하였으며 일주일간 하루에 한 번씩 1세대 세파계 항생제를 근육주
사 하였다. 12주 후, 미니돼지를 희생시켜 관련 절편을 채취하여
통상의 방사선 사진을 촬영하였고 관련된 절편을 10% 중성 포르
말린에 12시간 고정하고 5% 질산에서 3일간 탈회하였다. 파라핀
블록을 만들고 4 μm 두께로 절편을 만든 후 silane을 코팅한
Fig. 2. Alizarin red S staining in periosteal-derived cells. Alizarin
red S-positive mineralization deposits were first observed at 2 weeks of culture. The mineralization was increased at 3 weeks of culture. Bar=200 μm.slide glass에 부착하고 통법에 따라 H&E 염색을 시행하였으며 정상적인 골부위와 이식된 골편의 근심부를 관찰하였다.
결 과
1. 골막기원세포의 조골세포로의 분화
배양 2주에 알칼리성 인산분해효소의 활성도가 가장 높았으며 이후 감소하는 양상을 나타내었다(Fig. 1). 무기질이 침착되어 적색으로 인기되는 의미있는 골기질 형성은 배양 2주에 나타나 이후 증가되는 양상을 나타냈다(Fig. 2). 이러한 결과들은 이전의 연구결과와 유사하여 본 연구에서 사용된 골막기원세포도 조골세 포로 잘 분화됨을 관찰할 수 있었다.
2. 미니돼지에서 골막기원세포가 유입된 polydioxanone/
pluronic F127 담체의 골형성
미니돼지를 이용한 동물실험 후, 12주가 지나 희생시켰을 때,
임상적으로, 그리고 방사선학적으로도 골막기원세포가 유입된 polydioxanone/pluronic F127 담체의 경우에서 가장 골형성이 우수한 것을 관찰하였다. 골막기원세포가 없는 polydioxanone/
pluronic F127 담체 부위와 아무것도 이식하지 않은 부위도 어느 정도 골형성이 이루어졌다. 조직학적 소견에서도 상당량이 골이 골막기원세포가 유입된 polydioxanone/pluronic F127 담체 부 위에서 관찰되었으며 polydioxanone/pluronic F127 담체 부위 와 아무것도 이식하지 않은 부위도 일부 골형성이 관찰되었으나 정상 골조직에 인접한 가장자리에서만 주로 관찰되었다. 빈 공간의 결손부위보다는 polydioxanone/pluronic F127 담체부위에서 조 금 더 골형성이 관찰된다고 할 수 있으나 관련된 세포가 유입된 경우에서 의미있는 골형성이 관찰됨을 알 수 있었다(Fig. 3).
고 찰
골 조직공학과 관련하여 과거에는 다양한 조직으로부터 골
전구세포의 획득을 목표로 하는 것으로 골 전구세포를 조골세포로
Fig. 3. Representative in vivo mine-
ralization. Clinical and radiologic examinations revealed that newly formed bone was seen more clearly in the defect with polydioxanone/pluronic F127 scaffold with peri- osteal-derived cells. Anterior bor- ders between the defects and the native bones were examined for his- tological findings. Newly formed bone (N) was considerably detected in the polydioxanone/pluronic F127 scaf- fold with periosteal-derived cells.
Newly generated bone was also ob- served in the defect filled with the unseeded polydioxanone/pluronic F127 scaffold and empty defect but was limited to the periphery in H&E staining. Solid arrows indicate the defects with the polydioxanone/
pluronic F127 scaffold with peri- osteal-derived cells. Dotted arrows indicate the defects with the poly- dioxanone/pluronic F127 scaffold without periosteal- derived cells.
Bar=100 μm.
분화시키는 데 관심을 가졌던 것이 사실이나 이제는 단순하게 원천이 되는 전구세포에서 조골세포의 획득을 목표로 하지 않고 골 전구세포에서 조골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있는 방법 및 여러 가지 담체와의 유합을 통하여 우수한 골형성 결과가 보고되고 있다. 담체와 관련하여서도 각종 방법을 통하여 골 조직 에 유리하게 개발된 담체뿐 아니라 담체에 여러 가지 성장인자 및 유전자를 이식하여 결손부위에서 그 효과를 발휘하는 것 등이 보고되고 있는 실정이다[13-16]. 골 조직공학뿐 아니라 골 이식재 와 관련하여서도 합성고분자에 대한 보고가 증가하고 있다. 그러 나 일반적으로 대부분의 합성고분자들은 제작 시 사용된 용매의 잔존으로 소수성을 나타내므로 담체로 제작 시, 담체의 다공성 내로 배양된 세포를 적용하려 하여도 그 세포의 접착에 불리한 점이 있으며 일단 접착된 세포들도 소수성 다공성 표면에서 증식 하기기 쉽지 않다. 그리하여 세포 유입 없이 담체 자체를 임상의학 각 분야에서 이식재 등으로 바로 적용하는 경우가 많다. 이에 대한 보완으로 에틸알코올과 물의 혼합액을 사용하여 세포 배양액 이 담체 다공질 사이로 잘 스며들도록 전적심 방법이 사용되기도 하나, 잔여 에틸알코올의 독성과 고분자 지지체 다공질 자체를
근본적으로 친수성으로 바꾸어 줄 수 없다는 점이 단점으로 나타 나고 있다[5,17,18]. 본 연구에서는 polydioxanone 담체에 plur- onic F127을 부가제로 친수성 처리하여 세포 친화성을 증가시켰 다. Pluronic F127은 polyethylene glycol과 polypropylene glycol에 대한 수용성의 혼성중합체로 생체적합성이 뛰어나고 부착되는 세포들에 대하여 특이적인 독성을 잘 나타내지 않는 것으로 알려져 있으며 이러한 pluronic F127의 담체로의 부착은 최근에 개발한 표면처리 기술인 미세분말 열압착법을 통하여 이루 어졌으며 이를 통하여 100∼200 μm 다공성의 친수성 poly- dioxanone/pluronic F127을 제작하여 본 연구에 이용하였다[5].
사실 골 조직공학에서 담체의 다공 크기와 관련하여서도 많은
논란이 있다. 다공의 크기는 담체에 적용된 세포의 부착, 형태유지
및 표현형의 발현에 중요한 영향을 미친다. 특히 담체에 다공을
형성할 때 깊숙한 부위까지 세포의 유입이 증가하도록 다공 크기
를 달리하여야 한다고 알려져 있으며 골 조직공학에서는 일반적으
로 100에서 200 μm의 다공 크기가 조골세포의 활성에 유리하다
는 보고가 있으나 일부 학자들은 50에서 125 μm의 크기면 세포
유입 및 골형성에 충분히 긍정적인 역할을 한다고도 보고하고
있다[9-11,19].
이전에 본 연구자들은 polydioxanone/pluronic F127 담체에 골막기원세포를 유입하여 그 조골활성 정도를 생체외 세포배양 실험을 통하여 평가한 적이 있는데 본 연구에서는 골막기원세포를 polydioxanone/pluronic F127 담체에 유입하여 동물모델인 미 니돼지를 이용하여 그 골형성 정도를 평가하였다. 동물모델로서 미니돼지는 여러 가지 장점을 제공한다고 할 수 있다. 미니돼지는 인간의 구조 및 기능과 관련하여 그 재연성에서 많은 장점을 가지고 있으며 특히 골조직과 관련하여서는 그 재형성 과정에서 나타나는 현상이 조직학적으로 사람의 것과 상당히 유사하다고 알려져 있어 골 조직공학에서 생체내 실험에서 많은 장점을 제공 한다고 알려져 있다[20,21]. 본 연구에서는 이전의 생체외 실험 결과와 마찬가지로 polydioxanone/pluronic F127 담체에 인간 골막기원세포를 유입하였을 경우, 동물모델을 희생하였을 당시의 임 상적 사진과 이후 표본을 만들어 관찰한 조직학적인 평가에서 그 골형성 정도가 상당히 우수함을 관찰할 수 있었다. Polydioxanone/
pluronic F127 담체 자체만으로도 일정부분 골형성이 이루어지 는 것을 관찰할 수 있었으나 정상 골조직에 인접한 가장자리에서 만 주로 관찰되었다. 아무것도 이식하지 않고 빈 공간으로 결손부 를 남겨둔 곳에서도 정상 골조직에 인접한 가장자리에서만 일부 골형성이 이루어짐을 관찰하였다. 본 연구의 골형성과 관련하여 polydioxanone/pluronic F127 담체의 흡수기간이 중요한 요소 가 될 수 있다. Polydioxanone/pluronic F127 담체의 흡수기간 은 정확하게 알려져 있지 않으며 적용되는 동물 개체, 개체 내에서 의 부위 등, 여러 요소에 따라 다를 수 있고 일반적으로는 수주 정도에서 수개월 정도 걸린다고 알려져 있으며 다른 종류의 합성 고분자인 poly-lactic-co-glycolic acid보다는 흡수가 늦으며 poly-caprolactone보다는 흡수가 빠르다고 알려져 있다[22].
향후에는 골형성에 대한 정량적 평가와 함께 다양한 골 관련세 포에 대한 연구가 진행되어야 할 것이라 생각하며 실험에 이용된 미니돼지의 개체수가 적어 골형성과 관련된 통계학적 의미를 제공 하는 것은 어려우나 polydioxanone/pluronic F127 담체에 골 막기원세포를 유입하였을 경우 유용한 골형성을 나타내는 것으로 관찰되어 polydioxanone/pluronic F127 담체는 골 조직공학에 서 담체 자체로 사용되기 보다는 적절한 골 관련세포가 유입되었 을 경우, 골 관련세포의 활성에 긍정적인 역할을 제공하여 유익한 골형성을 제공한다고 할 수 있을 것이다.
결 론
미니돼지를 이용한 동물실험에서 다공성 친수성 polydioxanone/
pluronic F127 담체에 골막기원세포들을 유입하였을 경우, 그 골 형성 정도가 우수하였으며 polydioxanone/pluronic F127 담체 만 적용된 결손부와 아무것도 이식하지 않고 빈 공간으로 결손부
를 남겨둔 곳에서도 일정부분 골형성이 이루어지는 것을 관찰할 수 있었으나 정상 골조직에 인접한 가장자리에서만 주로 관찰되었 다. 이러한 결과들은 골막기원세포들이 polydioxanone/pluronic F127 담체에서 우수한 골형성 능력을 제공한다고 할 수 있으며 polydioxanone/pluronic F127 담체 또한 골막기원세포의 조골 활성에 긍정적인 영향을 제공한다고 할 수 있을 것이다.
Acknowledgements
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education, Science and Technology (2010-0007397).
References
