서1) 론
蒼耳子 (Xanthium sibiricum Patr.)는 菊花 科에 속하는 도꼬마리 (Xanthium strumarium L.)열매로서 氣味는 苦溫 無毒하고 主治는 惡 血, 癥結, 積聚, 久服長肌肉, 風痒, 肺痿, 頭瘡, 癰腫, 癘瘍, 陰㿉, 奔豚腎氣, 吐膿, 臟冷, 尿血腫 痛, 萬病積聚, 風疹瘙痒, 鼻淵, 疥癬, 肝熱, 瘰 癧, 瘡疹, 遍身瘙痒, 骨折, 濕痺, 疔腫, 惡瘡등의 效能을 主張하고 있다 1-3). 許 4) 등은 一切風氣 風濕痺 風瘙癮疹痒 四肢拘攣痛 拘攣痛惡肉 鼻 淵流涕 麻風 疥瘡 大腹水腫 一切風濕痺 四肢拘
•교신저자 : 임종국, 경북 경주시 석장동 707 동국대학교 한의과대학 경혈학교실, Tel. 054-770-2365, Fax. 054-770-2649, E-mail : [email protected]
攣 一切腫毒 疔瘡 頑癬 皮膚病 風瘙癮疹腫痒 諸風瘡癮疹 鶴掌風 牛皮癬 鼻淵 風寒濕痺症 癧 瘍風 風濕痺 四肢拘攣 瘡腫등의 臨床應用을 報 告하였다. 劉 등5-6)에 의하면 鼻咽癌 甲狀腺癌 骨肉癌 胸腫瘤 鼻腔癌 陰莖癌 顱腦腫瘤 惡性腫 瘍 骨癌 腦腫瘍 各種癌 등에 효능이 있는 것으 로 알려져왔다. 또한 약침요법7)은 본초학적으 로 유효한 약물이나 처방을 선택하여 증류 또 는 알코올 추출등의 방법을 이용하여 주사액으 로 만들어 경락학적으로 유효한 경혈이나 아시 혈 또는 피부 양성반응점에 주입함으로써 생리 기능을 강화시키고, 병리적인 상태를 개선시키 는 신침요법의 일종으로 수침요법, 혈위약물주 사요법이라고도 한다. 악성종양은 병리학적으 로는 암이라 규정하고 있으며, 빠른 침윤성 성
蒼耳子 藥鍼液의 암억제 물질로서의 효과
이기택1․조경희1․손윤희2․남경수2․임종국1
동국대학교 한의과대학 경혈학교실1․의과대학 약리학교실 및 난치병한양방치료연구센터2
Screening of Xanthium sibiricum Patr. Aqua-acupuncture Solution as the Cancer Chemopreventive Agent
Ki-Taek Lee1․Kyoung-Hee Cho1․Yun-Hee Shon2․Kyung-Soo Nam2․Jong-Kook Lim1
Dept. of AM-Meridian & Pointology, College of Oriental Medicine1,
Dept. of Pharmacology, College of Medicine and Intractable Disease Research Center2, Dong-Guk University
Abstract
Xanthium sibiricum Patr. aqua-acupuncture solution (XPAS) and Xanthium sibiricum Patr.
water-extracted solution (XPWS) were prepared and investigated for the potential of cancer chemoprevention. The following effects as chemopreventive agents were measured. : (a) Inhibition of DMBA-induced cytochrome P4501A1 activity (b) Inhibition of free radical formation in human leukemic cells. There was sligt inhibitory effect on the activity of cytochrome P4501A1 enzyme with the treatment of XPAS. Free radical formation was inhibited by 50.5% and 43.7% with XPAS at the concentration of 0.1×, 0.5
×, respectively. These results suggest that XPAS has chemopreventive potential by inhibiting the activity of cytochrome P4501A1 and free radical formation.
Key Words : Xanthium sibiricum Patr., Cytochrome P4501A1 activity, Free radical formation J. Kor. AM – M eridian & Pointology Soc.
장과 체내 각 부위로의 확산 및 전이와 같은 특 이성을 지니고 있어 생명의 위험을 초래할 뿐 만 아니라 현재 인류에게 있어서 가장 큰 위험 성 있는 전신성 질환으로 인식하고 있다. 이러 한 악성종양을 치료하기 위하여 여러가지 치료 법들이 도입되고 있으나 한계성 및 독성문제, 부작용등의 문제점을 가지고 있는 실정이다.
이러한 문제를 해결하기 위한 방안으로 새로운 천연산물에서 안전성이 있는 약물개발이 절실 히 요구되고 있다 8). 암예방은 발암과정의 초 기단계에서 암발생을 예방하거나 억제시키며, 암으로 진행된 것을 전환시키는 것을 의미하며 최근에는 암이 발병하기 전에 막을 수 있는 암 예방 물질의 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다. 암예방 물질은 발암 물질의 대사과정에 변화를 가져오거나 암화과정시 생성되는 대사 물질 또는 대사과정시 생성되는 부산물과 상호 작용 하여, 특정 효소의 발현 및 기능을 변화시 킬 수 있다. 따라서 이러한 특성을 이용하여 암 예방 물질을 조사, 개발 할 수 있으며, 암화과 정이 다단계로 진행되기 때문에 발생초기뿐만 아니라 후기단계에서도 암의 진행을 막을수 있 다. 현재, 암발생 억제물질의 효능을 연구하는 데 있어서 생화학적 표식자 (biochemical marker)를 사용하고 있다 9). 이 표식자들은 암 화과정시 발암과정에서 특이적으로 생성되는 대사물질 뿐만 아니라 그외 부산물과도 반응하 며 다양하고 많은 발암기전을 저해할수록 효과 적인 암예방물질로 간주된다.
본 연구에서는 창이자 약침액과 열수추출액을 비교해서 암 개시 과정과 관련한 cytochrome P4501A1 활성을 측정하고, 암촉진 과정과 관련 하여 free radical assay 생성에 미치는 효과를 측정하여, 창이자 약침액과 열수추출액의 암예 방 및 억제 효과에 대해 증명하고자 한다.
재료 및 방법
시약
Cytochrome P4501A1 활성 측정에 사용된
시약인 ethoxyresorufin, NCTC-135 medium, antibiotics, dimethylsulfoxide (DMSO), cytochrome C, bovine serum albumin (BSA), glucose-6-phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase, NADP+, 9,10-Dimethyl-1,2- benz-anthracene (DMBA), ethoxyresorufin, free radical formation inhibition 측정에 사용 된 시약인 phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA), RPMI-1640 medium, Hanks balanced salt solution (HBSS), bicinchoninic acid protein kit는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)은 JBI사 (Daegu, Korea) 제품을 사용하 였다. 기타 시약은 세포 배양용 및 특급 시약을 구입, 사용하였다.
약침액및 열수추출액의 조제
창이자는 동국대학교 부속한방병원에서 구 입한 뒤 정선하여 사용하였고, 약침액의 추출 용매인 물은 이온교환수지를 통과시킨 증류수 를 사용하였다. 약침액과 열수추출액은 윤 10) 등이 보고한 바와 같이 수제 알콜침법에 의하 여 조제하여 사용하였으며, 3×, 5× 약침액은 1×를 감압농축하여 사용하였고, 0.1×, 0.5×
농도는 증류수로 희석하여 조제하였다.
세포배양
계대 보존 중인 NCTC-clone 1469 (from : mouse liver) 세포는 10% FBS가 포함된 NCTC 135를 배양액으로 사용하였으며, 배양 액은 3 또는 4일 간격으로 교환해 주었다. 세포 는 액체질소의 기체상태 (-150℃)에 보존해 두 었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여 서 사용하였다. 또한 HL-60 cell은 한국세포주 은행 (KCLB)으로부터 분양받아 계대배양하여 사용하였다. 배양용 배지는 RPMI-1640 (Gibco)에 20% FBS를 첨가하여 사용하였다.
세포의 생존은 trypan blue dye exclusion 방 법으로 확인하였다.
마이크로좀의 분리 및 Cytochrome P4501A1의 활성 측정
랫의 간 조직으로부터의 마이크로좀의 분리 는 Pohl과 Fouts 등11)의 방법을 참고하여 실시 하였다. 관류법으로 DMBA를 처리하고 24시간 뒤 랫의 복피를 절개하여 1.15% KCl 완충용액 으로 간을 perfusion 시킨 후 적출하였다. 적출 된 간은 여러번 세척 후, 조직균질기 (Teflon Plotter Elvehiem Homogenizer, Glas-Col, U.S.A.)를 이용하여 마쇄하였다. 이 마쇄 균질 액을 7,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상 층액을 다시 77,000×g에서 60분간 원심분리 한 뒤, 형성된 침전물은 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 재현탁하여 microsome 분 획으로 실험에 사용하였다. 이상의 모든 과정 은 4℃에서 실시하였다. Microsomal protein 농도를 결정하기 위하여 standard로서 BSA를 사용하여 bicinchoninic acid protein kit로 실
시하였다 12). 정량된 분획은 일정량씩 나누어
실험에 사용할 때까지 -70℃에서 냉동보관하였 다.
Cytochrome P4501A1는 ethoxyresorufin-O -deethylase (EROD) 활성으로 측정하였다 13). 위의 방법으로 분리한 microsomal protein (2
㎎/㎖) 200 ㎕에 640 ㎕의 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), 100 ㎕의 BSA(10 ㎎/㎖), 20
㎕의 0.25 M MgCl2, 40㎕의 cofactor solution, 2.5 unit의 glucose-6-phosphate dehydroge- nase, 10 ㎕의 substrate(1 ㎎ of ethoxyre- sorufin in 10 ㎖ of methanol), 10 ㎕의 각종 농도의 창이자 약침액을 첨가했다. 모든 시약 들을 잘 섞은 후, 37℃에서 4분간 반응시키고, 2 ㎖의 methanol로 반응을 종결시켰다. 2,000
×g에서 20분동안 원심분리하여 상층액을 취 하고, 형광분광광도계 (SHIMADZU RF-5000, spectrofluorophotometer)로 측정 (550 nm excitation and 585 nm emission) 하였다. 양 성대조군은 β-naphthoflavone을 사용하였고, negative control로서는 증류수를 사용하였다.
이 실험은 3회 반복 실험으로 수행 하였으며,
각각의 결과는 control에 대한 각 sample들의 저해도 정도를 percentage로 나타내었다.
자유기 소거효과 측정
Free radical 소거효과는 Davis의 방법 14)으 로 실시하였다. 1×106 개의 HL-60 세포를 HBSS에 부유시켜 96-well plate에 접종시키고 free radical을 형성시키기 위하여 8 μM TPA 를 처리하여 1 시간 동안 CO2 배양기 (37℃, 5% CO2)에 배양 하였다. 그 후, 창이자 약침액 을 0.1×, 0.5×, 1×를 각각 처리한 뒤, 160 μ M cytochrome C을 각 well에 첨가하여 배양 기에 20분 동안 배양하였다. Cytochrome C의 환원은 550 nm에서 측정하였다. Maximum free radical 형성을 보기 위해서 TPA에 cytochrome C를 처리하였고, positive inhibi- tor로는 TPA에 ascorbic acid, cytochrome C 을 첨가하였으며, negative inhibitor로서는 TPA와 cytochrome C에 창이자 약침액 및 열 수추출액의 추출용매인 물을 사용하였다. 창이 자 약침액과 열수추출액에 의한 자유기 소거효 과는 다음과 같은 공식으로 계산되었다.
통계학적 처리
실험결과는 통계처리를 하여 평균±표준편 차로 나타내었으며, 실험에 대한 유의성 검정 은 Student`s t-test를 수행하여 결정하였다.
실험결과
Cytochrome P4501A1의 저해 효과
Cytochrome P4501A1은 phase Ⅰ 효소로 발 암을 유도하기 때문에 이 효소의 작용을 억제하 는 것은 암예방효과 기작의 하나이다. 따라서 창 이자 약침액 및 열수추출액에 의한 cytochrome P4501A1 효소활성 억제효과를 조사하기 위하 여 각 농도에 대한 저해도를 측정하였다. 창이자 약침액은 1×, 3×에서 17.2%, 16.9%의 증가를
보였으며, 열수추출액은 저농도에서는 12.7%의 저해율을 보이다가 농도가 증가할수록 오히려 약침액에 비해 저해 효과가 높아짐을 알 수 있었 다 (Fig. 1). 이 결과로 창이자 약침액 및 열수추 출액은 cytochrome P4501A1 활성에 현저한 저 해 효과를 가져왔다.
자유기 소거 효과
TPA에 의해서 유도된 자유기 (free radical) 를 소거시키는 효과를 살펴 본 결과, 창이자 약 침액의 경우 0.1×, 0.5×에서 50.54%, 43.73%
의 소거효과가 있었고, 1×의 농도에서부터 고 농도까지는 약 38%까지 free radical 형성을 차단시켰다 (Fig. 2). 이 결과들을 통해 창이자 약침액은 발암물질에 의해 형성된 자유기를 효 과적으로 저해시켰다.
고 찰
암예방 (chemoprevention)은 암화과정 (car- cinogenesis)을 연장, 억제시키거나 암화된 것 을 전환 (reversion)시키는 작용이다. 현재 암 예방 물질에 대한 많이 연구가 진행되고 있으 며, 효과적인 암예방 물질 (chemopreventive agents)의 연구를 위해 생화학적 표식자 (bio- chemical markers)를 사용하고 있다 . 이 표식 자들은 암화과정시 발암물질의 대사물질과 그 의 부산물과도 반응하며 다양하고 많은 발암기 전을 저해할수록 효과적인 암예방물질로 간주 된다. 외부의 발암물질은 cytochrome p-450- dependent monooxygenase system에 의해 대 Fig. 1. Effect of XPAS on DMBA-induced cytoch-
rome P4501A1 activity. Experimental details are described in Material and Methods. Values represent mean±SD (n=3). The value of each group statistically significant as compared with control (* : p<0.05, ** : p<0.01).
* **
0 5 10 15 20 25
0 1 2 3 4 5 6
Concentration (X)
% of inhibition
XPAS
Fig. 2. Effect of XPWS on DMBA-induced cytoch- rome P4501A1 activity. Experimental details are described in Material and Methods. Values represent mean±SD (n=3). The value of each group statistically significant as compared with control (* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.005).
***
**
*
*
0 5 10 15 20 25
0 1 2 3 4 5 6
Concentration (X)
% of inhibition
XPWS
Fig. 3. Effect of XPAS on free radical formation in TPA- induced HL-60 cells. Experimental details are described in Material and Methods. Values represent mean±SD (n=3).
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0.1 1 Ascorbic acid (0.2 µg)
Concentration (X)
% of inhibition
XPAS
사되어 전자친화적물질 (electrophilic product), epoxides 또는 매우 독성이 강한 물 질이 된다 15). 따라서 cytochrome P450 효소 의 활성을 억제시킬 수 있다면 암예방의 효과 가 있을 것이므로 창이자 약침액을 이용하여 DMBA에 의해 유도된 cytochrome P4501A1 효소의 억제율을 측정한 결과, cytochrome P4501A1 효소의 활성을 저해함을 관찰할 수 있었다. 유리 라디칼은 체내에서 지질과산화를 유발하여 독성을 일으키는 과정에 관여한다고 알려져 있다. 정상적인 경우에는 생체내에서 병적 상태가 진행되나 과잉의 단백질 분해효소 에 의한 가수분해를 받을 경우에는 oxidase형 으로 형질전환이 일어나며 16-17). 그 대사과정 에서 생성되는 세포내의 활성 산소종은 DNA 손상, 노화와 관련된 세포의 퇴화 및 암의 발생 을 일으키게 된다 18). 유리 라디칼과 관련한 활 성 산소들은 산소의 대사동안 생화학적 반응에 의해 생성되며, tumor promotion에 중요한 작 용을 한다 19). 나아가 tumor promotion을 저해 하는 것으로 알려진 protease inhibitors가 free radical 형성을 저해할 수 있고, vitamin A 유도체가 tumor promotion을 억제하고 여 러 retinoid 화합물은 phagocyte O2- 생성의 저
해제이다 20). 그러므로 free radical scaven-
gers의 섭취에 의해 free radical에 의한 손상 에서 정상조직을 보호할 수 있을 것이다. TPA 에 의해 유도된 유리 라디칼은 창이자 약침액 을 처리하였을 때, 상당한 소거 효과가 나타났 다.
이상의 결과를 종합해 볼 때 창이자 약침액 은 효과적으로 cytochrome P4501A1을 억제, 유리 라디칼 소거효과가 있었으므로 외부 물질 또는 대사물에 의해 일어날 수 있는 돌연변이 와 암 발생을 억제할 것으로 사료된다.
참고문헌
1. 李時珍. 本草綱目, 北京 : 人民衛生出版, 1992
; 1102-1104.
2. 康秉秀. 本草學, 서울 : 永林社, 1988 ; 141-142.
3. 金永坂. 臨床配合本草學, 서울 : 永林社, 1988
; 651-652.
4. 許 浚. 東醫寶鑑, 서울 : 大星文化社, 1991
; 230,405,451,726.
5. 劉春安. 抗癌中草葯大辭典, 湖北科學技術出 版社, 1994 ; 507-510.
6. 李佩文. 中西醫臨床腫瘤學, 1996 ; 1076.
7. 金廷彦. 奇蹟의 藥鍼療法, 서울 : 金剛出版社, 1987 ; 53-106.
8. Sharma S, Stutzman JD, Kelloff GJ and Steele VE : Screening of potential chemopreventive agents using biochemical markers of carcinogenesis. Cancer Res, 54(22): 5848-5855, 1994
9. Wattenberg LW. Chemoprevention of cancer. Cancer Res, 1985 ; 45(1): 1-8.
10. 윤성묵, 조경희, 손윤희, 남경수, 임종국 (2001) 생약 약침액에 의한 phase Ⅱ 효소 활성 유도. 대한경락경혈학회지 2001 ; 18(1):
1-9.
11. Pohl RJ and Fouts JR. A rapid method for assaying the metabolism of 7-ethoxyresorufin by microsomal subcellular fractions. Anal Biochem, 1980
; 107(1): 150-155.
12. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ and Klenk DC. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem, 1985 ; 150: 76-85.
13. Song LL, Kosmeder JW, Lee SK, Gerhauser C, Lantvit D, Moon RC, Moriarty RM, Pezzuto JM. Cancer chemopreventive activity mediated by 4'-bromoflavone, a potent inducer of phase II detoxification enzymes. Cancer Res, 1999 ; 59: 578-585.
14. Davis RW, Thomas M, Cameron J, St. John TP, Scherer S, Padgett RA. Methods Enzymol, 1980 ; 65: 404-411.
15. Jollow DJ, Smith C, In: Jollow KJ, Kocsis
JJ, Snyder R, Vainio H, eds. Biologically Reactive Intermediates. New York, Plenum Press, 1977 ; 42-59.
16. Tubaro E, Belogi L and Mezzadri CM : Antiplatelet effect of a new inhibitor of thromboxane synthase and thromboxane A2 receptors. Areneimittelforschung (Drug Res.), 1976 ; 26: 2185-2186.
17. Tubaro E, Lotti B, Croce C, Caballo G, Borelli G. Liver xanthine oxidase increase in mice in three patholgoical models. A possible defence mechanism. Bichem Pharmacol, 1980 ; 29(3): 1939-1943.
18. Cerutti PA. Prooxidant states and tumor promotion. Science, 1985 ; 227(4685):
357-381.
19. Kennedy AR, Troll W and Little JB. Role of free radicals in the initiation and promotion of radiation transformation in vitro. Carcinogenesis, 1984 ; 5(10):
1213-1218.
20. Troll W, Klassen A and Janoff A.
Tumorigenesis in mouse skin: inhibition by synthetic inhibitors of proteases.
Science (Washington DC), 1970 ; 169(951):
1211-1213.
