Antioxidant and Cell Proliferation Effects of Acanthopanax senticosus for Extract in Human Osteoblast-like MG-63 Cell Line

(1)

694

©The Korean Society of Food Science and Technology

가시오가피 추출물의 항산화활성 및 MG-63 조골세포 증식과

alkaline phosphatase 활성에 미치는 효과

임소영·임재윤

1

_·이충수

1

_{·장여정·박정우·윤 선*}

연세대학교 식품영양학과, 1_{우석대학교 약학대학}

Antioxidant and Cell Proliferation Effects of

Acanthopanax

senticosus

Extract in Human Osteoblast-like MG-63 Cell Line

Soyoung Lim, Jae-Yoon Leem

1

, Choong-Soo Lee

1

, Yu-Jung Jang, Jeong-Woo Park, and Sun Yoon*

Department of Food and Nutrition, Yonsei University

1

College of Pharmacy, Woosuk University

Abstract Acanthopanax senticosus

is a common Asian herb also known as “Siberian Ginseng”. It is often used as a

traditional herbal medicine for reducing damage in the liver, kidney, bone and muscle. In the present study we investigated

the ferric reducing/antioxidant power and total phenolic contents of the ethanol-/water-extracts obtained from the stems and

leaves of

Acanthopanax senticosus

. Osteoblast cellular proliferation was evaluated using the MTT and alkaline phosphatase

activity assays in the human osteoblast-like MG-63 cell line.

extracts exerted remarkable ferric

reducing/antioxidant power and contained high amount of phenolics. Among the extracts the stem-/ethanol-extract showed

the highest antioxidant activity and total phenol content. Interestingly a highly positive correlation was found between

antioxidant activity and total phenol content (

p

< 0.01). Proliferation of MG-63 osteoblast cells was highest in the stem-/

ethanol-extract and alkaline phosphatase activity significantly increased in the water-extract of the stems (

p

< 0.05). These

findings suggest that

extracts have antioxidant activity for preventing oxidative stress-related

diseases and may have beneficial effects on bone health through the proliferation of osteoblast cells.

Key words: Acanthopanax senticosus

, antioxidative activity, total phenol content, human osteoblast-like MG-63 cell line,

alkaline phosphatase activity

서

론

오가피 또는 가시오가피

(

Acanthopanax senticosus

Harms,

Eleutherocosis maxim

)

는한반도와 시베리아 및중국의 고지대에

자생하는

Araliaceae

에속하는다년생낙엽관목으로서 내건성및

내한성식물이다

.

예로부터 오가피속식물의뿌리와줄기를생 약에서 오가피

(

Acanthopanacis Cortex

Radicis)

라 하며

,

동의보감 을 위시한 한약 집성방

,

신농본초경 및 본초강목에 이르기까지 고전한의서에오가피의약리효능이탁월한것으로기록되어있 다

(1).

오가피는고전에 따르면발산

,

구풍작용등의 대사촉진제 로이용되어져왔고

,

음위

,

강장

,

강정

,

진경

,

근골동통

,

산기복통

,

요슬동통등에유효한약물로알려져있다

(2).

일명

“

시베리아인삼

”

이라고불리는가시오가피는 강장제로서 기관지 천식치료

,

체력증진

,

근골격 증진

,

항암

,

항노화

,

항피 로

,

그리고인삼에버금가는신진대사작용

(adaptogenic activity)(3)

이있다고알려져있다

.

우리나라를비롯한동양에서주로강장

,

강정

,

신경통

,

중풍

,

고혈압

,

당뇨병및노인성질환을위한귀중 한한약재의 하나로 사용되고있다

(4). 1969

년

Brekhmann

등

(6)

에의해오가피의뿌리에서

lignan

계배당체의분리와그생리적 활성에대한연구가시작되었으며

,

특히

Brekhmann

등이가시오 가피에

adaptogen

으로서 효능이있음을 주창한이래인삼과 함께 국내외적으로 중요한약용식물로서 연구대상이 되고있다

.

중추 신경계에 대해서 진정

,

흥분의 양면성을 나타내어

,

인삼과같이

adaptogen

의 성격을보이지만

,

그 작용기전이 인삼과 상이한 것 으로보고되었다

(5).

가시오가피 나무의 근피나 줄기에서 수많은유효성분들이 분 리된 바있으며

,

이성분들의생리적 활성연구도많이 수행되고 있다

.

오가피의 생리적활성에대한연구가이루어진후부터 오 가피의 항암작용

(6),

항피로효과

(5)

등에대한 각종연구가보고 되어 많은관심이집중되고있으며

,

실제로임상에서는 류마토이 드관절염에사용하고있다

.

한국산오가피류의 효능에대해서는간해독작용

,

동물의생 명연장

,

대사촉진

,

단백질합성 촉진 등이보고되었으며 지리오 가피나무에서 얻은배당체에관한실험에서항

histamine

작용

,

항당뇨 작용

,

해독작용 등의 생리활성을 보고하였다

.

또한최근 오가피의항암작용

,

수명연장시험

,

항피로효과등에대한각종 연 구가보고되어많은관심이집중되고있다

.

특히

,

오가피효능성 분의 일종인

eleutheroside E

에대한생체효능 실험보고에 의하 면항암작용

(7), T

세포증가

(8),

정력증대

,

학습력향상

,

위궤양억

*Corresponding author: Sun Yoon, Department of Food and

Nutri-tion, Yonsei University, 134 Shinchon-dong, Seodaemun-gu, Seoul,

Korea

Tel: 82-2-2123-3119

Fax: 82-2-365-3118

E-mail: [email protected]

(2)

제

(9)

등이밝혀졌고

, chiisanoside

는 혈당저하

(10),

항암 효과

(11)

등의효능이확인되었다

.

오가피의항산화작용에 대해서도계속보고되고 있는데

,

항산 화작용은암

,

면역기능 저하

,

혈관계질환

,

노화의발생이나진 행의주요 촉진인자로 생체내에 존재하는

free radical

의관련 과이에중재되어지는작용기작이 오래전부터 알려져왔으며

,

항산화제는 체내의

free radical

을소거함으로써 이와관련된 질 병예방에 이용될수있는 것으로사료되고 있다

.

따라서항산화 활성의측정은 암이나노화의 진행을 억제할수있는 천연물질 의규명에 이용될수있다

(12).

골다공증은동일연령과성별의정상인에비하여골밀도가현 저하게감소된상태로서

(13),

어떠한연령층에서도 발생할수있 으나남성과여성모두 노화과정에서파골세포작용의증가로인 하여유병률이 증가하며

,

특히여성의 경우폐경이후에 여성호 르몬인에스트로겐분비의감소에의해골밀도의감소현상이더 욱심하여 골다공증에대한 발병률이 남성보다현저히 높은것 으로알려져있어

,

이에대한연구가활발히진행되고있다

(14-17).

최근에는에스트로겐투여에의한위험성을보완하기위해한 약재및식품등천연물의 활성성분을이용한 대체요법에대 한연구가 활발히 진행되고 있다

(18-23).

폐경기 골다공증 예방 및치료를 위한 대표적인 대체 요법으로 이소플라본

(isoflavone)

과같은 식물성에스트로겐

(phytoestrogen)

의 경구투여 또는이 를다량 함유하고있는식품의 섭취가시도되고있다

.

또한서양 에서는 이소플라본의 생리작용을 규명하고 이와 더불어 골다공 증환자들에게 이소플라본을 보충식으로 급여해야 한다는 주장 이현실화되고 있다

(18,19).

그러나오가피의골다공증예방효능에관한연구는거의이루 어지지않은실정이며

,

그작용 기전또한밝혀진바가없다

.

한 의학전통문헌과 임상경험을 바탕으로 효과적인 골다공증 예방 후보한약을 검색하여 오가피를 찾을 수있었다

.

또한

, Yang

등

(24)

은가시오가피가 함유된성장촉진용 조성물의 골성장효과 연구의결과오가피가골무기질밀도를증가시키는효과를가지 며성장 촉진및골강화에응용할수있는소재로개발가능성 이있음을제시하였다

.

따라서 오가피를이용하여우수한골다공 증예방용건강기능식품의개발이가능할것이라고 생각된다

.

이 에본연구에서는가시오가피추출물의추출 용매

,

추출부위

(

잎

,

줄기

)

및산가수분해 전처리에 따른가시오가피 추출물의항 산화활성을알아보고

,

각각의가시오가피추출물이

MG-63

조골 세포 생존력과 증식률 및

alkaline phosphatase(ALP)

활성을 측정 하여가시오가피추출물이조골세포활성에미치는영향을분석 하였다

.

이와같은연구를통하여오가피추출물의 항산화활성 과조골세포 증식효능을 검증하여골다공증 개선가능성을 확 인하고자한다

.

재료 및 방법

가시오가피의 추출 및 시료 준비 강원도양구의농장에서구입한생지가시오가피의줄기와잎 을분리하여

80

o

C

_에서

15

_시간_동안_열풍_{건조하였다}

.

_농가의_경 우는

60

o

C

_에서

36

_시간_동안_{건조하였다}

.

_건조_후_오가피의_줄기 와잎의중량은각각처음중량의

1/2, 1/4

정도가감소하였으며

,

수분은약

4%

정도였다

.

건조된가시오가피의줄기

50g

과잎

30 g

에각각

13

배의증류수혹은

50%

에탄올을첨가하여

90

o

C

_에서

8

시간동안추출하였다

.

추출물을원심분리하여상등액을취하고

filter(1

µ

m pore size)

로여과한후얻어진여액을동결건조하여시

료로 사용하였다

.

추출물의수득률은

SE(ethanol extract of stem),

SW(water extract of stem)

가 각각

2.8, 2.5%, LE(ethanol extract

of leaf)

와

LW(water extract of leaf)

는각각

16.2, 16.3%

이었다

.

위 과정으로 얻어진 줄기와 잎의 최종 추출물의 일부를

1 N

HCl

을처리하여

100

o

C

_에서

2

_시간_동안_열_{가수분해하였다}

.

_가수

분해가 끝나면

10 N NaOH

로시료를중화시킨 후

glucose assay

kit(Sigma, St. Louis, MO, USA)

를 이용한

glucose

정량을 통해 가수분해가 잘되었는지확인 후본실험에사용하였다

.

본실험 에 사용한

Trolox((+/

−

)-6-hydroxy-2,5,6,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid), gallic aicd,

MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

와

glucose assay kit

는

Sigma-Aldrich

에서구입하였다

.

가시오가피 추출물의 항산화 활성 및 총 페놀 함량

FRAP(ferric reducing ability of plasma) assay:

FRAP

분석

은

Benizie

와

Strain(25)

의 방법을 응용하여 가시오가피 시료 내

항산화력을측정하였다

.

이방법은

colored ferrous tripyridyl

triaz-ine complex

에 의해

ferric ion

이

ferrous

로 전환되어지는 과정을 분석함으로써 시료내의 총항산화력을 측정하는방법이다

.

사용 되는시약은

300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6)

와

2.4.6-tri(2-pyridyl)-1.3.5-triazine(TPTZ) reagent,

그리고

20 mM FeCl

3이다

.

TPTZ reagent

는

10 mM

의

TPTZ

를

40 mM HCl

에 용해시켰다

.

Acetate buffer, TPTZ reagent, FeCl

3

solution

을혼합하여

(10 : 1 : 1)

37

o

C

_에서

10-15

_분간

incubation

_{시켜두었다}

.

_이때_모든_시약_제조

와 시료의 희석 시에는

Chelex-treated(2 g/L) de-ionized Milli-Q

water

를 사용하였다

. Trolox standard

는

10% methanol/water

에 녹 여

1 mM

로만들어

100

µ

L

씩분주하여 사용전까지 −

80

o

C

_에_저

장해두었다

.

희석시킨 가시오가피 추출물과

pre-warmed working FRAP

reagent

를

96-well plate

에분주한후약

15

분간

incubation

시키고

microplate reader

를사용하여

550 nm

에서흡광도를측정하였다

.

총 페놀 함량

(Total polyphenol content)

측정

:

가시오가피 추

출물의총페놀함량을측정하기위하여

Folin-Denis

방법을이용

하였다

.

가시오가피 추출 시료 용액

20

µ

L

에

3

차증류수

1,200

µ

L

을 첨가한 수

Folin & Ciocalteau’s phenol reagent 100

µ

L

을 넣고잘섞은후

5

분동안상온에서 반응시켰다

.

혼합한용액을

20% Na

2

CO

3용액

300

µ

L

를넣어다시혼합한다음

380

µ

L

의증 류수를 넣어총혼합액의 양을

2 mL

로정용하였다

.

이혼합 용 액을

23

o

C

_에서

2

_시간 _동안 _방치시킨 _후

760 nm

_에서

absorbance

를 측정하였다

.

측정된 흡광도는

gallic acid

를 이용하여 작성된 표준곡선을이용하여검량선을작성하여총페놀함량을계산하였다

.

조골세포 활성에 미치는 영향

조골세포 배양

(monolayer culture):

본실험에 사용한

human

osteoblast-like MG63

세포는 한국 세포주 은행

(

서울대학교 의과

대학

, Seoul, Korea)

에서분양받아본연구실에서 계대배양하여

사용하였다

. MG-63 human osteoblast

세포를 세포배양 접시에 부착시키고

penicillin

및

streptomycin

이함유된

1%

antibacterial-antifungal solution(Gibco, Grand Island, NY, USA)

과

10% FBS

(Gibco)

를첨가한

Phenol-red free DMEM(Gibco)

을사용하여배양

하였다

.

배양액은

2-3

일에 한번 씩 교체하며

, 1 : 1

로 희석한

Tryphan blue

용액과반응하여 염색되지않은살아있는세포를

계수하였다

.

배양시습도는

95%,

온도는

37

o

C

_를_{유지하면서}

5%

(3)

가시오가피추출물처리후세포생존력및 증식률

:

조골세포

의증식측정은단시간에 대량검색이 가능한

MTT colorimetric

assay

방법

(Cell titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation

assay: Promega)

을 사용하여 측정하였다

. 96-well plate

에

2

×

10

3

cells/well

의농도로 분주하고

24

시간 후에 가시오가피 추출물을 농도별

(0, 5, 10, 15, 20, 25

µ

g/mL)

로투여하여

3

일간배양하였다

.

3

일째 되는 날

MTT(20

µ

L/well)

시약을 첨가하고

2

시간 동안

37

o

C

_에서_배양한_후

MTT

_가

formazan

_으로_분해되는_양을

ELISA

reader

를이용하여

490 nm

에서흡광도를측정하여결정하였다

.

각 각의처리군을

6 well

씩준비하고

6

회반복실험을하였으며

,

각 오가피추출물에대한세포증식효과는

6

번반복실험의평균값 을취한 후아무것도 처리하지 않은

DMEM

용액에배양한 대 조군에대한백분율로표시하였다

(26).

염기성인산분해 효소

(alkaline phosphatase: ALP)

활성측정

:

ALP

활성도 검사는 p

-nitrophenyl phosphate(pNPP, Sigma, St.

Louis, MO, USA)

의가수분해반응에

ALP

가촉매로작용하는것

을이용하여

,

가수분해반응의산물인 p

-nitrophenol

의양을측정

함으로써

ALP

의농도를간접적으로 산출하는것이다

.

이때세포

수의차이가

ALP

활성도에영향을미칠수있으므로총단백질

양을측정하여나누어줌으로써단위세포수당

ALP

활성도를

계산한다

.

본실험에서는

MG-63

조골세포를

6-well plate

에

1

×

10

5

cell/

well

농도로 분주하고 밀생 단일층이 형성될 때까지 배양한 다 음

, 10% FBS, 1% antibiotics

와가시오가피 추출물이 적정농도 별

(0, 5, 10, 15

µ

g/mL)

로함유된배지로교환한후

, 48

시간동안 배양하였다

.

이후 각각의

well

에서 배양액을 제거하고

0.25%

trypsin/1 mM EDTA

로처리하여세포를분리한다음세포부유액 을

4

o

C, 8,000 rpm

_에서

10

_분_동안_{원심분리하였다}

.

_상층액을_제거 하고

, PBS

로세척한후

,

분리한세포를얼음에 옮겨

0.5% Triton

X-100 100

µ

L, PBS 200

µ

L

을첨가하고

1

시간동안방치하여세 포막을파괴하였다

.

그후

4

o

C, 8,000 rpm

_에서

10

_분간 _{원심분리한} 후상층액을 모아

ALP

활성도 측정에사용하였다

.

96-well plate

에각

well

당 세포용해액

90

µ

L

에

1 M Trizma

base buffer(pH 10) 150

µ

L, 5 mM MgCl

2

30

µ

L

와

5 mM pNPP

30

µ

L

를첨가하여

37

o

C

_에서

1

_시간_동안 _반응시켜 _기질은

pNPP

의양을

ELISA reader(Wallac Victor2)

를이용하여

405 nm

에서비 색정량하였다

.

단백질 농도는 표준시료로서 소의 혈청 알부민

(bovine serum

albumin: BSA)

을 이용한

Bradford

법을 사용하여 측정하였다

.

실

험은

5

번반복시행하였으며각실험에서얻어진

ALP

활성도는

단백질양으로 보정하여 대조군의

ALP

활성에대한 시료첨가

군의

ALP

비를

%

로계산하였다

(27).

자료 처리

자료분석은

SPSS(12.0.1 for Windows) program

을이용하여통 계분석을시행하였다

.

모든연속형변수의평균과 표준편차를구 하였으며

,

군별차이는

One-way ANOVA

의

Scheffe

와

Duncan

법 을이용하여분석하였다

.

가시오가피추출물의 용매

,

부위

,

전처 리에따른변화차이는

paired

t

-test

를이용하여분석하였다

.

결과 및 고찰

가시오가피 추출물의 항산화 활성 및 총 페놀 함량 자유라디칼은주로노화와질병의원인으로알려져있다

(28).

특히자유라디칼이생체막의구성성분인불포화지방산을공격 하여 생성되는과산화 지질의축적은 생체기능의 저하나노화 및성인병을유발하는 것으로알려져있다

.

그러므로활성산소 를방어하는 항산화 물질이이러한 질병의치료 가능성때문에 주목을받고있으며

,

그중천연물에서 추출한천연항산화제에 관한연구가활발하다

.

그중페놀화합물의 다양한항산화력은 그 구조적인특징과 관련성이 높은데

,

이들은금속 킬레이트제

,

환원제로서

,

활성산소의 소거제로서

,

사슬절단 항산화제

(chain

breaking antioxidants)

등으로서의 역할에기인하는것으로알려져 있다

(29).

항산화활성

:

FRAP assay

에의한가시오가피추출물의 항산화

활성도를 측정하여

TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)

법으로항산화효과를비교하여

Fig. 1

와

Table 1

에나타내었다

.

가시오가피 추출물중줄기의에탄올 추출물

(SE)

의

TEAC

값 이

782.60

±

53.55

µ

M Trolox equivalent

로가장높았고

,

산가수분 해처리한줄기에탄올추출물

(SE-HCl)

의

TEAC value

도

759.24

±

20.73

µ

M Trolox equivalent

로높은항산화활성을 나타내어줄 기의에탄올 추출물이줄기의 물추출물이나잎추출물들보다항 산화 효능이 뛰어난 것으로 나타났다

.

이는 항산화능이 높다고 알려진 곰취의경우보다 약

70,000

배정도 높은수치로서

,

가시 오가피줄기의에탄올추출물이갖는항산화능이매우뛰어나다 고할수있다

.

추출용매에 따른오가피의 부위별항산화 활성을비교해 보 았을때

,

에탄올을 추출용매로사용한경우잎

(LE)

보다는줄기

(SE)

의에탄올추출물이 유의적으로높은항산화활성을보였으 나

(

p

< 0.001),

물추출물에서는줄기

(SW)

보다잎

(LW)

이유의적으 로높은항산화활성을보였다

(

p

< 0.01).

추출용매가 가시오가피 추출물의 항산화 활성에 미치는영향 을알아보기위하여

,

용매별비교를해보았을때

,

줄기

(

p

< 0.01)

와잎

(

p

< 0.05)

모두 에탄올추출물에서유의적으로높은항산화 활성을나타내었다

.

Fig. 1. Comparisons of TEAC values of

extracts by FRAP assay.

SE: the ethanol extract of stem, SW: the

water extract of stem, LE: the ethanol extract of leaf, LW: the water

extract of leaf,

□

: raw material,

▨

: hydrolyzed material by 1 N

(4)

Kim

등

(30)

은가시오가피 에탄올추출물의

free radical

소거능 력이물추출물보다높았고

,

부위별로는추출용매에 관계없이줄 기

>

뿌리

>

잎의순서로소거능력이높다고보고하였으며

,

이는 본실험결과를뒷받침해준다

.

1 N HCl

처리에따른가시오가피 추출물의항산화효능을평 가해보았을 때

,

줄기의경우에는 에탄올추출물과물추출물모 두유의적인차이가없었으나

,

잎추출물의 경우에는에탄올추 출물

(

p

< 0.01)

과물추출물

(

p

< 0.05)

모두

1 N HCl

가수분해에의 해항산화활성이유의적으로감소하는것으로나타났다

(Fig. 1).

따라서본연구에서는가시오가피추출물의성분에관한연구는 수행하지않았으나

,

가시오가피 추출물에는항산화 활성을가지 는성분이 다량함유되어있으며

,

잎추출물에포함되어 있는항 산화성분은산에의해영향을 받는다고사료된다

.

총 페놀함량

:

식품속에 함유되어있는 많은생리활성 화학 물질중에서 페놀은가장 널리함유되어 있으며높은 항산화활 성을가지는 것으로알려져 있다

(31,32).

본실험에서는가시오가 피추출물의총페놀함량을구하기위하여

gallic acid

를페놀표 준물질로하여함량을계산하였다

.

8

가지가시오가피시료에서의

gallic acid

를기준으로한총페 놀함량은

Fig. 2

과

Table 2

에나타내었다

.

각각의가시오가피추 출물 중 줄기의 에탄올 추출물

(SE)

의 총 페놀 함량이

7.593

±

0.016 mM gallic acid equivalent

로가장높았고

,

산가수분해처리

한줄기에탄올 추출물

(SE-HCl)

의총페놀함량도

5.887

±

0.005 mM gallic acid equivalent

로높은수치를나타내었다

.

부위별총페놀함량을비교해 보았을때

,

에탄올추출물에서 는잎

(LE)

보다는줄기

(SE)

에서총페놀함량이 유의적으로높은 것으로나타났으나

(

p

< 0.001),

물추출물에서는줄기

(SW)

보다잎

(LW)

에서총페놀함량이유의적으로높았다

(

p

< 0.001).

추출용매가가시오가피추출물의총페놀함량에미치는영향 을 알아보기 위하여 용매별로 비교해본 결과

,

줄기

(

p

< 0.001)

와 잎

(

p

< 0.001)

모두에탄올 추출물에서 유의적으로 높은페놀함 량을나타내었다

.

Kim

등

(33)

은가시오가피유식물체추출물에서항산화활성물 질을분리 동정하였으며 이들의항산화 활성이매우 높다고보 고하여 가시오가피 추출물이 천연 항산화제로서의개발 가능성 이높음을 시사하였으며

, Davydov

등

(34)

은가시오가피추출물에 는다수의 항산화페놀물질이 함유되어있음을보고하였다

.

1 N HCl

처리에 따른가시오가피시료들의총페놀함량변화 를평가해보았을때

,

모든시료에서

HCl

가수분해에의해총페 놀함량이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다

(

p

< 0.001)(Fig.

2).

따라서가시오가피추출물에함유되어있는페놀성분들은산 가수분해에 의해 영향을 받으며

,

높은 항산화 효능을 위해서는 산가수분해전처리를시행하지않은오가피추출물을이용하는 것이바람직하다고 사료된다

.

가시오가피추출물의항산화활성과총 페놀 함량의상관관계 분석

:

가시오가피 추출물시료들의항산화활성과총페놀함량 의상관관계를살펴보면

Fig. 3

과같다

.

TEAC

값으로 표현된가시오가피 추출물의항산화활성과 총 페놀함량은강한양의상관성을보였다

(

p

< 0.001).

그러므로 가 시오가피추출물의높은항산화활성은추출물에함유되어있는 다량의페놀화합물에기인한것이라고 할수있다

.

추출 부위 및 용매, 전처리 조건에 따른 가시오가피 처리가 조 골세포 증식 및 ALP 활성에 미치는 영향 조골세포 생존율 및 증식률에 미치는 영향 분석

:

부위

,

용매 및전처리에 따른 가시오가피추출물이 조골세포 생존및증식 에미치는효과를알아보기 위하여

MTT assay

를실시하였다

.

여 러차례시행한예비실험결과에의해세포독성이나타나기시 작하는 고농도를 제외하고 시료처리 농도

(0, 5, 10, 15, 20, 25

Table 1. TEAC values of

extracts

(250

µ

L/mL)

Treatment

part

Raw

1 N HCl

Solvent

TEAC value (

µ

M)

1)

Ethanol

Stem

_Leaf

782.60 _227.14

±_±

_5.45

53.55

ba2)

759.24

90.52

_±±

3.21

20.73

ea

Water

Stem

_Leaf

118.34 _179.26

±_±

_6.53

4.06

dec

110.34

132.77

_±±

2.42

9.97

ded

1)

Data indicate means

_±

SD.

2)

Values with different superscript within in a column are significant

difference (F = 591.790,

p

< 0.01) by Duncan’s multiple range test.

Fig. 2. Comparisons of total polyphenol contents of

extracts.

SE: the ethanol extract of stem.

SW: the water extract of stem, LE: the ethanol extract of leaf, LW:

the water extract of leaf,

□

: raw material,

▨

: hydrolyzed material

by 1 N HCl.

Table 2. Total polyphenol contents of

extracts (5 mg/mL)

Treatment

part

Raw

1 N HCl

Solvent

Gallic acid equivalent (mM)

1)

Ethanol

Skin

_Leaf

7.593 _2.219

±_±

0.016 _0.003

a2)c

5.887

0.841

_±±

0.005

bh

Water

Skin

_Leaf

1.458 _1.719

±_±

_0.013

0.010

ed

1.041

1.381

_±±

0.008

0.005

gf

1)

Data indicate means

_±

SD.

2)

Values with different superscript within in a column are significant

(5)

µ

g/mL)

를선택하였으며

,

조골 세포생존율 및 증식률은 아무런 시료도처리하지않은배양액만넣어준

control

군에대한비율로 나타내었으며그결과는

Fig. 4

와같다

.

줄기의에탄올 추출물

(SE)

의경우

,

산가수분해전처리를하지 않은시료를

5

µ

g/mL

처리한군의 경우를제외하고모든농도에 서유의적으로조골세포 증식효과를나타내었다

(

p

< 0.05).

특히 줄기의 에탄올 추출물

(SE) 20

µ

g/mL

를 처리한 군과

1 N HCl

로 가수분해한줄기에탄올 추출물

(SE-HCl) 10

µ

g/mL

와

25

µ

g/mL

를처리한 군에서유의적으로높은증식효과를보였다

(

p

< 0.01).

잎의에탄올추출물

(LE)

을처리한경우는

,

거의 모든농도에서

control

군에비해 세포증식이증가한 것으로나타났으나

, 1 N HCl

로 가수분해 한 시료

(LE-HCl)

를

5

µ

g/mL

와

10

µ

g/mL

로 처리한 군

(

p

< 0.05)

을제외하고는 유의적인차이를나타내지않았다

.

줄기의물추출물

(SW)

의경우

, 10

µ

g/mL

와

15

µ

g/mL

을처리해 준군에서만 유의적으로세포가증식하는것을보였으며

(

p

< 0.05),

잎의 물 추출물

(LW)

을 처리한 세포군에서는

control

군에 비해 세포증식효과를 보였으나유의적인차이는보이지않았다

.

산가수분해전처리여부가조골세포증식에미치는영향을분 석해 보았을때

,

잎의에탄올 추출물

5

µ

g/mL

와

10

µ

g/mL

를 처 리한군을제외한모든군에서

1 N HCl

로가수분해한시료처 리에의한조골세포 증식률의차이는나타나지않았다

.

이는산 가수분해에 의해

glycoside

형태의비활성물질이

aglycone

의활성 형으로 전환되었다하더라도 페놀 화합물과 같은다른 활성성분 들에도영향을 미쳤을가능성이있다

.

이는추후연구를통하여 산가수분해에 따른 오가피추출물의 성분분석을 통하여검증 해야할것이라고사료된다

.

추출용매에따른가시오가피시료의조골세포증식효과를비 교해 보았을때

,

에탄올 추출물이물추출물보다유의적으로 높 은조골세포증식 효과를나타내었으며

(

p

< 0.05),

추출부위별로 비교해 본결과

,

잎추출물보다는 줄기추출물이효과적으로 조 골세포를증식시키는것으로나타났다

(

p

< 0.05). Kim

등

(30)

에의 하면약콩은

0.001

과

0.01 mg/mL

농도에서

,

대두추출물은

0.001,

0.01

및

0.1 mg/mL

농도에서조골세포

(MG-63)

의증식을대조군에 비하여 유의적으로증가시켰다고 보고하였다

.

이는조골세포 증 식효과를나타낸제니스틴이나다이드제인의표준품농도와비 교하였을때

,

약콩과 대두추출물은 더낮은이소플라본을 함유 하고 있었음에도 더욱 현저한 조골세포 증식 효과를 나타냈다

.

이러한결과는약콩및대두에함유된저농도이소플라본과다 른물질과의상호작용에의한시너지효과때문으로풀이되었다

.

ALP 활성에 미치는 영향 분석:

ALP

는거의 모든조직에 존 재하며 특히골조직에 존재하는

ALP

는골성장이 활발히일어 날때그활성이증가한다

.

그러므로 조골세포활성을알아보는 Fig. 3. The correlation of TEAC (Trolox equivalent antioxidant

capacity) value and total polyphenol content.

Correlation is

P

value <0.001 level. r = 0.984.

Fig. 4. Cell proliferation effect of Acanthopanax senticosus extractson MG-63 cell line.

A: ethanol extract of stem (SE), B: water extract of

stem (SW), C: ethanol extract of leaf (LE), D: water extract of leaf (LW),

□

: raw material,

▨

: hydrolyzed material by 1 N HCl. *: Significantly

different from control(0) at

p

< 0.05. **: Significantly different from control(0) at

p

< 0.01.

†

: Significantly differently by paired t-test at

(6)

biomarker

로서

MG-63

조골세포에서의

ALP

활성을측정함으로써

,

가시오가피추출물이조골세포의활성에미치는형향을알아보 았다

. ALP

활성은아무런시료도 처리하지않은 배양액만넣어준

control

군에대한비율로나타내었으며 그결과는

Fig. 5

와같다

.

각오가피 시료를농도별

(0, 5, 10, 15

µ

g/mL)

로처리한 결과

,

줄기의물추출물

(SW) 15

µ

g/mL

를처리한경우

(

p

< 0.05)

를제외 하고는염기성 인산분해 효소활성을 증가시키는효과를 나타 내지않았다

.

본실험에서는조골세포 증식에 큰효과를보였던 줄기의에 탄올추출물의처리가조골세포의

ALP

활성을유의적으로증가 시키지못하고

,

오히려잎추출물에서유의적으로 증가시키는것 으로나타났는데

,

이는가시오가피의 부위별로존재하는활성성 분의 종류와 함량이 다르기 때문이라고 사료된다

.

따라서 활성 성분의규명과 추출조건을 최적화하는 공정개발에 대한연구 가수행되어야 할것이다

.

요

약

본연구에서는가시오가피추출물의부위

,

추출용매

,

산가수 분해전처리에따른항산화활성을알아보고자

FRAP assay

를실 시하였으며

,

총페놀 함량을측정하고

,

가시오가피 추출물의 항 산화활성과총페놀함량간의상관관계를 분석하였다

.

또한가 시오가피추출물 처리가조골세포증식률과

alkaline phosphatase

활성에미치는영향을분석하여가시오가피의골다공증예방가 능성을규명하고자하였다

.

연구결과 가시오가피에 함유된 총 페놀 함량과

FRAP

법으로 측정된항산화 활성간에 양의상관관계가 있는것으로 나타났 으므로

,

가시오가피의 항산화활성은 함유된폴리페놀에 의해나 타나는것으로 풀이된다

.

그러나가시오가피에 함유된 폴리페놀 함량과항산화활성은가시오가피의부위와추출용매및산처 리여부에따라차이가나는것으로나타났다

.

또한가시오가피 의에탄올 추출물이 물추출물에 비하여조골세포 증식을유의 적으로 증가시켜주는 것으로나타났다

.

가시오가피의 물추출물 은조골세포에서염기성인산 분해효소의활성을유의적으로증 가시켰다

.

이는가시오가피의 부위와추출용매 및전처리 과정 에따라추출되는활성성분의종류와양에차이가있기때문으 로풀이된다

.

이결과는가시오가피의 가공법을선정하는데 고려 되어야할중요한사항으로 사료된다

.

본연구를통하여가시오 가피의 항산화활성과 조골세포증식 효과가제시되었다

.

한국산 가시오가피를건강기능식품 소재로개발하기위해서는동물 실 험과 인체시험을 통한심도있는 연구가수행되어야 할것이다

.

감사의 글

본연구는

Brain Korea 21 project,

식품영양유전체사업과 보건

복지부 보건의료기술진흥사업의 지원에 의하여 이루어진 것임

(A05-0716-AD0501-05N1-00040B).

문

헌

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Fig. 5. The effect of Acanthopanax senticosus extracts on alkaline phosphatase (ALP) activities of MG-63 cell line.

A: the ethanol extract

of stem (SE), B: the water extract of stem (SW), C: the ethanol extract of leaf (LE) D: the water extract of leaf (LW),

□

: raw material,

▨

:

(7)

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2-isopente-nyl)-adenosine and 1-beta-

D