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감마선 조사에 의한 발생과정 중인 마우스의 소뇌발달에 관한 연구
박일권·이경열·박오성·김성화·이근좌1·이강이2·민태선3·육홍선4·변명우5·김무강*
충남대학교 수의과대학, 1충남축산위생연구소,
2대전대학교 한의과대학, 3한국과학재단
4충남대학교 생활과학대학 식품영양학과
5한국원자력연구소 방사선식품생명공학연구팀 (게재승인: 2005년 5월 18일)
The study for the mouse cerebellum developments irradiated with
γ-ray during embryogenesis
Il-Kwon Park, Kyoung-Youl Lee, O-Sung Park, Sung-Hwa Kim, Guen-Jwa Lee1, Kang-Yi Lee2, Tae-Sun Min3, Hong-Sun Yook4, Myung-Woo Byun5, Moo-Kang Kim*
College of the Veterinary Medicine, Chung Nam National University, Daejeon 305-764, Korea
1Chung Nam Veterinary Service Laboratory, Daejeon 314-140, Korea
2College of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon 300-716, Korea
3Department of Life Science, KOSEF, Daejeon 305-350, Korea
4Department of Food and Nutrition, College of Home Economics, Daejeon 305-764, Korea
5Korea Atomic Energy Research Institute, Team of Radiation Food and Biotechnology, Daejeon 305-353, Korea
(Accepted: May 18, 2005)
Abstract :In order to study about the lobule and layer formation and cell migration of the mouse cerebellum from at the birth to 15th day effected by 2.5, 5 and 10 Gy r-raddiation at the 19th pregnancy. The routine tissue preparation and staining procedure, Immunohistochemical staining method by the several antibody and western brotting method were utilized from the birth to the15th day. The results were as followings.
1. The body and cerebellum weights were more slowly increase of the the 2.5 Gy, 5 Gy and 10 Gy irradiation group compare to the control group, and the health condition of the 2.5 Gy group was a little bad. but the 10 Gy group was more severe and begun to die from the 12th day after birth.
2. The thickness, proliferation and migration of the 2.5, 5 and 10 Gy irradiated external granular cells from the maginal zone to the medullary area forming the molecular layer from the 6th day to the 15th day after birth were thinner, weaker and more slower according to the radiated dosages than the control group in the cresyl violet staining.
3. The proliteration, migration and lobulation of the 5 Gy radiated groups from the first day to the 15th day after birth were more weak, incomplete and irregular shape in the immunostaining with Dab, Cdk5, P35, calbindin and Zebrin antibody.
4. In the western blotting analysis using the Reelin, Dab, Cdk5 and P35 antibody. The Bands were in the 60 KD, 80 KD, 33 KD and 35 KD, and there were no differences between the control and irradiated groups in the molecular band except the Reelin.
5. As a results, the proliferation and migration of the outer granular and purkinje cells, and lobulation of the cerebellum by the several dosaege of the γ-ray radiation were proportionally incomplete according to dosage.
Key words :γ-ray, development, mouse, cerebellum
본연구는 2003년 6월 1일~2004년 5월 31까지의한국과학기술기획평가원원자력연구기반확충사업(관리번호 2003-6568)의지 원으로연구되었음.
*Corresponding author: Moo-Kang Kim
College of the Veterinary Medicine, Chung Nam National University, Daejeon 305-764, Korea [Tel: +82-42-821-6752, Fax: +82-42-821-8899, E-mail: mgkim@cnu.ac.kr]
서 론
소뇌신경세포와신경섬유의정확한위치관계에의한 특징적인신경배열때문에신경세포들의성질을결정하 고근본적인연관관계를이해하기위하여이분야에대
한연구가일찍부터외국에서진행된바있었고 [25] 최
근에들어국내에서도진행되고있다 [9, 26, 27, 52].
소뇌를형성하는세포에는 Cajal [8]에의해이미밝
혀진전통적인 6가지와최근밝혀진홑극솥세포(unipolar brush cells)와 candelabrum cell [8, 38]을합해현재까지 8가지의신경세포즉조롱박신경(Purkinje cells, 이하PC),
큰별신경세포(Golgi cells), Lugaro cells, 과립세포
(granular cells, 이하GC), 바구니세포(basket cells), 별세
포(satellate cells)가있다. 신경세포외에소뇌에는수입섬 유로서아래오리브핵(inferior olivary nucleus)에서기원 해 PC에직접접촉하는오름섬유(climbing fiber), 척수
에있는여러핵과뇌간과심부소뇌핵에서기원하여
GC나개재신경세포(interneuron) 등을통해자극을 PC에 간접적으로전달하는이끼섬유, 평행섬유라고부르는개
재신경세포들의축삭돌기가있고 또소뇌에서자극을 외부로내보내는 PC의축삭등으로이루어져있다. 소
뇌에서 솔섬유(brush cell) [23]가등쪽엽보다 배쪽엽에
많이존재하는것을제외하고다른세포들은피질을구 성하는엽을따라거의단조로운형태를구성하는것처 럼보인다. 기능적으로보면하나의이끼섬유는수백개
의수평섬유를통해수천개의 PC에영향을미치기도하 며이중분자층에있는위성세포, 바구니세포와 PC층
에 있는 candelabrum cells, 그리고 과립세포층에 있
는 Lugaro와큰별신경세포는 GABAergic으로억제성개
재신경이며과립과홑극솔세포는 glutamatergic 이다 [8,
28, 29, 30]. 분자층신경세포들의축삭돌기들은소뇌피
질밖구조에도달하지않고소뇌피질외부로부터받은정 보를 PC에전달하고 PC만이깊은소뇌핵(deep cerebellar neclei)과뇌줄기핵(brain stem nuclei), 천정핵등으로자
극을내보낸다 [16].
이러한 소뇌의발생과정에대해서는아직명확하게 밝혀지지않아소뇌의발생과소뇌를구성하는세포들 의이주와여기에관계되는요소들에대해많은학자들 이관심을가지게되었지만확실히밝혀야할문제들이 아직산적해있다. 이러한소뇌발생에대한연구를하기 위해신경관, 특히간뇌후부에대한유전표시자이며이 들이불활성일때능뇌앞쪽이없어지고후뇌가커지는
otx2 [44]. 중뇌후부의비정상적인확대를일으키는 Gbx2
[22, 49] 소뇌의원기(primordium)에서가장높지만앞쪽 덮개면(anterior tectal edge)쪽으로가면서차차줄어드는 En2 [18], 후뇌(hind brain)쪽에나타나며이들이발생과
정중부족하면중뇌와소뇌전체가없어지는 Fgf8 [11,
20, 21], 중뇌(mid brain)쪽에나타나는 Wnt [50]; 후뇌와
중뇌양쪽에나타나는 En 1-2와 Pax2-5 [6, 15, 18, 43],
이들을조절하는 Pax family 등 [45]의연구와소뇌의형
성과기능을 알아내기위해 zebrin과 calbindin 등 [26,
27]을이용한연구들이보고된바있으나본연구에서
처럼발생과정중인소뇌의층형성, 이소성 PC, 소뇌의
엽형성(lobulation), 신경세포이주(neuronal migration)와 그들의활성등을규명하기위해, 또발생과정중에방 사선을조사해서이들이어떠한방향으로어느정도영 향을미치는지를알아내기위한연구는거의없다. 본 연구에서는소뇌의층형성과엽형성확인을위해 cresyl violet 염색이소성 PC에대해 calbindin, 소뇌에서생
기는띠형성에 대해 zebrin II 항체를 이용한 염색을
하였으며, 세포골격재조합에의해신경세포자리잡기
(neuronal positioning)와이주를위해조롱박신경세포가
아닌소뇌의신경세포들에의해쥐임신 10일에서부터
14일경까지생산되어피질부위의세포밖에존재하는것
으로알려진 reelin 그리고 reelin의신경전달통로에관계
되어소뇌엽형성에많은영향을주는 Dab1, cell cycle
을조절하고 P35에의해활성화되며 cell 이주에영향을
주는 Cdk5, Cdk를활성화시키며중추신경발달에필수
적인 P35 등의항체를이용해서발생과정중각시기별
해당세포에서어떤크기의단백이어느정도발현되어 어느정도영향을미칠것인가를알아내고자하였다.
재료 및 방법
실험동물8주령 ICR마우스 250(암컷150, 숫컷 100)마리를방사
선조사선량(저, 중, 고)으로구분하였고분만한새끼들
은각일령별로 10단계(6h, 12h, 3d, 6d, 9d, 12d, 15d,
18d, 21d)로나누어단계별로 20~30마리씩되게하였
다. 실험기간동안실험동물사육은미국 NIH실험동물관
리및사육에대한지침에따라사육하면서합사시킨후
다음날아침질전(plug)이보이는쥐만을분리하여임신
0일로정하였으며뇌신경발생이완성되지않은임신 19
일째에 임신 쥐에 방사선(γ-ray)을 조사하여 출생 후
계획서에 따라 동물을 희생시켜 흉강을 열고 4%
paraformaldehyde in 0.1M PBS를좌심실로관류하였으 며체내를순환한후흘러나오는고정액의유출을위해 우심의를잘라개구하였다.
방사선 조사
예비실험을통해얻어진용량을참고하여임신 19일
째오전 9시에한국원자력연구소방사선조사실에서임
신한어미(v3)마리씩을대상으로 3단계조사량즉저선
량 2.5 Gy, 중선량 5 Gy, 고선량 10 Gy를조사하였으며
조사용량과부검일령에따라각그룹에서분만된약 30
마리씩의새끼들을대상으로하여이들의체중과소뇌 무게들을희생시킨즉시계측하였다.
조직표본제작
(1) 일반조직표본
소뇌의전반적인형태와증식하는신경세포들에의한 층형성등의관찰을위해서는 cresyl violet 염색을실시
하였으며 이를위해일반조직표본 제작방법에 따라
paraffin block을제작하여 5µm 두께로조직절편을만들 어염색한후관찰하였다.
(2) 동결조직표본
발생과정중뇌실주위신경상피세포로부터의세포증 식과이주, 엽형성과 PC돌기에의한띠형성과그기전 을확인하기위해서는 0.1M PBS에 paraformaldehyde를
4%되게희석한고정액으로관류고정한후뇌를분리하
여 4oC의 paraformaldehyde 용액에 24시간후고정하여 동결조직표본을제작하였다.
이때생기는뇌조직의변화와얼음결정생성을막기 위해 cryoprotect인 10%, 20%, 30%의연속 sucrose 용액 에뇌가충분히가라앉을때까지침적시킨후동결절 편기에서 40µm 두께로 동결절단하여면역염색부유
법으로염색하여관찰하였다. 이때 1차항체로사용된항 체는 calbindin, 23K-D, zebrin II, reelin, Dab I, Cdk5, P35
를사용하였다.
Western blotting analysis
각시기별방사선조사에의한단백질변화를관찰하 기위해서는각각의해당항체를이용하여실시하였다.
분석을위해소뇌조직을분리해서용해완충액에서균질 화하였으며단백질표본은 SDS-PAGE 표본완충액(62.5 mm Tris-Cl-ph6.8, 10% glycerol, 2% sodium dodecylsulfate (SDS), 5% 2-Mercaptoethanol, 0.05% bromophenol blue)
을 100oC에서 5분간끓인다음얼음에서식혀미리준비 된 SDS-polyacrylamide gel(10%)의각 well에해체된단 백질(denature protein sample)표본들을두고전기영동을
실시하였다. SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질들은
PVDF(polyvinyldinedifluride)(BioRad, U.S.A)에전기적으 로전이되었으며그막은 methanol로미리평행되게한
후증류수로세척하였다. 8장의 3M Whatman 종이를
anode I(Tris base 36.3 g, methanol 200 ml per liter), anode II(Tris base 3.025 g, methanol 200 ml per liter)와 cathod
완충액(Tris base 3.025 g, ammino-n-caproic acid 5.25 g,
methanol 200 ml per liter)에담궜다. 전이후막을차단
완충액(500M Tris-Cl 50 skim milk, pH8.0)에담궈 1시
간동안천천히흔들었고실온의탕기내에서 1차항체로 밤새도록반응시켜수세완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)으로수세한후막을 biotin이부
착된항토끼항체(vector U.S.A)로실온에서 30분간반
응시켰다. 막을완충액으로수세한후 chemiluminescence
용액(Super signal R substrate, PIERCE, U.S.A)에서
incubation하여 Hyperfilm TM-MP(Amersham, Sweden)에 노출시켰으며 DAB용액으로현상한후증류수에담궈
반응을정지시켰다.
결 과
체중은출생후부터증가하기시작하였으며방사선에 조사된마우스의체중은조사량에비례하여체중감소가
있는것을알수있었다(Fig. 1). 뇌중량은출생후 5일
까지는대조군, 조사군모두뚜렷한증가가없었으나그 이후부터증가하기시작하였으며대조군에비해방사선
2.5 Gy 조사군에서는큰차이가없었으나 5 Gy와 10 Gy
Fig. 2. Postnatal mouse brain weight changes in the 19th prenatal mouse cerebellum with the r-ray irradiation.
Fig. 1. Mouse postnatal body weigh changes in irradiation with r-ray radiation at the 19th prenatal embryo.
조사군에서유의하게감소하였으며 10 Gy 주입군은출
생후 13일째부터사망하기시작하였으므로다른군과
비교할수가없었다(Fig. 2).
Cresylviolet 염색표본에서출생후 12시간째대조군에
서는가장자리 층에외과립층들이 이미 나타났으며
2.5 Gy 군에서는대조군과별다른차이가없었다. 5 Gy
군에서는대조군에비해외과립층들이매우적게출현
하였으며 10 Gy 군에서는가장자리층에외과립층들의
출현을거의볼수없었다.
출생후 1일째에서도조사용량에비례하여외과립층
의출현이감소하였으며 6일째에서도비슷한경향이였 다. 출생후 15일째대조군에서는외과립세포들이내측 으로많이이동하였으나 2.5 Gy와 5 Gy, 10 Gy에서는용
량에비례하여내측으로의이동이미약하였다(Fig. 3).
Calbindin은 PC의세포질에풍부하게존재하기때문
에 PC의세포체와복잡한가지돌기들의분포양상을관
찰하기위해자주이용된다. 본연구에서 calbindin 23DK
단백질에대한항체를이용하여염색한소뇌를관찰한 결과출생후 1일, 3일, 6일, 9일, 12일, 15일째의대조
군에서는 PC들이뚜렷이염색되였고소엽형성도뚜렷
하였다. 2.5 Gy에서도대조군과 비슷하였으나 5 Gy와
10 Gy 조사군에서는 PC의출현이조사선량에비례하여
뚜렷하지못하였다(Fig. 4).
Fig. 3. Cells and layers of the 15th Postnatal mouse cerebellum irradiated with r-ray at the 19th prenatal embryo. Cresyl Violet Stain. Scale bar : 200µm.
Fig. 4. Cells and lobulation of the 1st, the 6th and the 12th postnatal mouse cerebellum irradiated with r-ray at the 19th embryo. Calbindin Stain. Molecular layer (ML); Purkinje cell layer (PCL); Internal granular layer (IGL); External granular layer (EGL). P1: Postnatal 1st day, P6: Postnatal 6th day, p12: Postnatal 12th day. Scale bar: 100µm.
소뇌의진화과정중에도유지되면서품종간에도차이
가있는것으로알려진 Parasagittal band가방사선조사
에의해어떻게변화되는지를알아보기위해 zebrin 항
체를이용하여면역염색방법으로관찰하였던바대조군
에비해 2.5 Gy에서는뚜렷한차이를구별할수없었으
나 5 Gy와 10 Gy 조사군에서는 band 형성이뚜렷하지 못하였으며존재하는 band 역시그배열이일정하지못
하였지만큰차이는구별되지않았다(Fig. 5).
이러한현상은 calbindin과 zebrin으로염색한표본을
FITC와 TRITC filter를이용한공초점현미경관찰한소
견에서도거의동일한결과였다(Fig. 6).
Reelin, Dab, Cdk5, P35의항체를이용하여출생후
일령에따르는소뇌의엽형성과신경세포의분열과이
주에관해 5 Gy를조사한집단을중심으로관찰하였던
바초기대조군에서보이는과립세포와 PC층이조사군
에서는보이지않었으며(Fig. 1일, 3일) 발생후기에대
조군의과립세포와 Purkinje 세포는본래의목적지인분 자층, PC층, 내과립층에자리잡고있으나조사군에서는 대조군의초기현상들처럼각층의형성이완성되지않 았었고외과립세포들이아직조롱박세포외층에나타나
는것을볼수있었다(Fig. 7). 이러한현상들을방사선
조사후 15일정도지나게되어야만소뇌신경세포들이
방사선조사의영향으로부터조금씩회복되어내과립층
쪽으로옮겨가게되는것으로사료된다(Fig. 7).
신경세포이주에관련되는것으로알려진각 Gene들
Fig. 5. Parasagital bands in the 15th postnatal mouse cerebellum irradiated with r-ray at the 9th embryo. Stained with Zebrin.
Fig. 6. Purkinje cell distridution and band pattern in the 6th mouse embryo cerebellum irradiated with r-ray. Calbindin and Zebrin Purkinje cells (arrow).
의방사선조사에의한출생후변화상태를보기위해
reelin, Dab1, Cdk5, P35에대해 western blotting 실시하 였던바 Reelin은 60 kDa, Dab1은 80 kDa, Cdk5는 33 kDa
그리고 P35는 35 kDa에서나타났으나 Reelin은조사군 에서출생후 6일까지나타나지않다가 9일부터흔적적
으로나타났고 Dab1은 P1에서대조군에비해약간의차
이가있는것처럼보이나다른유전자에서는별다른차 이를볼수없었다(Fig. 8).
고 찰
신경증식이원시뇌실상피세포에서생기는다른중추 신경부위와는달리소뇌는신경상피세포(neuroepithelial cell)가있는소뇌실구역(cerebellar ventricular zone, CVZ)
뿐만아니라외과립층(이하 EGL) [19]이라고불리는제
2의종자구역에서도신경증식이생기며외과립층(EGL)
은능형뇌의덮개판과날개판사이에있는후뇌의자유
Fig. 7. Layer formation and cell location in the 1, the 3 and the 15th postnatal mouse cerebellum stained with Reelin, Dab1, Cdk5, P35 antibody method.
Fig. 8. Western blooting analysis between the sham-irradiated group and 5 Gy irradiated group.
연인능형뇌입술의머리쪽으로부터기원한다 [16]. Mice
와 rat에있어서뇌실쪽에있는신경전구물의 대부분은
태아가자궁내에있는기간동안에생기는반면외과립
층의전구체들(Progenitor)은거의가신생아기에생긴다
[37]. 소뇌증식의다른특성은 GABAergic 개재신경의
전구물에서간질분열이일어나는것이고이개재신경은 종자신경상피에서신경아세포로되어피질로이주하면
서증식한다 [10]. 종자신경상피에서처음시작하는신
경세포는심부 핵신경세포(nuclear neuron, 이하NN)과
PC이며이들두집단의증식시기는 deep NN이 PC보다
약간먼저시작하지만실질적으로큰차이는없었다 [37].
마우스에서 PC [2, 37, 40]는임신 11일에서 13일까지의
3일동안에시작해서 12에서 15일까지의기간에소뇌판
으로이주하며거기에서이미이주되여있는 deep NN
아래, 그다음에는확대되고있는외과립층(EGL)아래에
서여러층의구조로남는다 [5, 7, 37]. 태아가태어나
는바로그전후에는 CVZ에유사분열상이없고유일한 활동종자층으로 EGL만존재하기때문에종전에는 CVZ
가 deep NN, PC and Golgi cells의기원이며 [8] 피질에
있는바구니와별신경세포는태어난후 1일에서 15일 사이에 EGL에서기원한다는보고 [37]가있었으나최
근비둘기와병아리를이용한 fate mapping 실험에서몇
몇연구자 [3, 4, 17, 34, 35, 36, 39] 들이 2차신경상피 인외과립층에서는과립세포만생기고분자층의개재신
경들은생기지않는다고하였고 zhang [53]은억제성개
재신경기원을명확히하기위해 beta-galactosidase gene
을가진 retrovirus를출생후 4~5일된 rat의심부소뇌조
직(deep cerebellar tissue)과 EGL에주입하여연구한결
과외과립층에 있는전구체는단지과립세포만생산하 고심부소뇌조직에서신경교세포, 바구니세포, 별세포,
그리고큰별세포가생긴다고함으로소뇌백질에서간질 성장을하는신경전구체가백질을거쳐피질로이주하
고피질에서다른형의 GABAergic 개재신경으로분화
함을재입증하였다 [19].
소뇌의 EGL로부터의신경분화는오로지과립세포전 구체로되는데뒷뇌의앞쪽부(rostral hind brain region)
에서는 배쪽신경세포(ventral neurons, neurons for the lateral pontine nucleus and the locus coerulers)로되기위 해마우스에서는머리쪽능형뇌입술전구체의머리쪽이 임신 10일째까지증식하기시작해서소뇌원기의표층을 덮기위해접선(tangenitally)을따라이주하며임신 15일 째까지그전구체는외측에서내측으로뒤쪽에서앞쪽 으로따라가면서소뇌의대부분을덮고과립세포전구체 는외과립층의표층절반에서 cronal팽창을한후분만이 가까워졌을때유사분열후의과립세포들로되고이들 은 신경교안내에 의해 신경이주(glial-guide neuronal
migration) [42]를안쪽으로방사상모양으로하면서대
량으로증식하고그들의마지막도착지인내과립세포층
에도달한다 [51]. 즉 EGL의심부에있는신경세포들이
소엽장축에대해 수평축극성(horizontal polality)돌기를
뻗고수평축극성과새로운원형질확장인수직축극성
(vertical polality) 사이의이행은세포체의기저극으로부
터백질쪽으로 내려가는새로운원형질성확장이성장 원추가되고핵은수직확장내에서내려간다고하였다
[8]. 즉과립세포이주는백질쪽으로내려가는원형질성
절편이길어지고세포내의핵이절편내에서수직으로 이주하는이두가지과정의결과이며신경이수직으로 내려갈때에는모세혈관이나교세포에의해서유도되는 저항이적은균열판을따라간다는연구가보고된바가 있다 [47].
발생하는소뇌에서 PC의숫자이상(staggerer)과위치
이상(reeler)이있는유전변이쥐를이용한연구에서조
롱박신경세포들이과립세포전구체의증식과정을조절한 다는것이제시되었으며 [32, 33]. 실제로 PC가존재하 고있어야할 EGL 바로밑에있지않을때(reeler mouse)
와그숫자가매우적을때(staggerer mouse)에는과립세
포의수가급격히감소되었고항 PC항체(anti P400)를 출생후 8일동안뇌실내로주사한후희생시켜쥐의등
쪽벌레엽의미세구조를전자현미경으로관찰하였을때 피질의많은부분에서 PC와그위에있는 EGL가실질 적으로사라졌었다 [31]. 이것은외과립층의정상적인
유사분열을위해서는 PC가가까이있어야하는것이필 수적이라는것을알게되였으며임신 15일째의 rat 태
아에 X-ray를조사했을때 PC의절반이죽었고이에수
반되어외과립층의뚜렷한감소와정상보다는 작은크
기의소뇌가생겼다는보고가있었다 [14].
Cajal [11]은 EGL가 2층즉 GCP가활동적으로증식
하는표층부와미분화유사분열후 postmitotic 과립세
포를포함하는깊은구역으로구성된다는것을보고한 바있고이것은 GCP가 EGL의깊은구역으로들어가그
들의분화를시작한다고했다. 최근 pon 등 [41]은어떤 세포질외물질(extracellular matrix, 이하ECM)에서나타
난정지신호의분자기전을발표하였으며이세포외물 질은당담백 glycoprotein인 vitronectin과 laminin이라고
하였다. 그러나여기에관련되는분자(molecular)의정확
한본성은아직확실히알려지지않았으며이러한분자 들은일과성이며과립세포의이주가완성된후에는신 경세포들을유도하는 Bergmann섬유가방사상신경교세
포(radial glial)의특성을잊어버리고방사성으로배열된
성숙한별아교세포(The Golgi-Bergmann glia)로된다고
하였다 [46]. 또 PC가없는성숙한변이마우스에태아
소뇌를이식한결과태아소뇌의 PC가이식부위를떠나