Effect of Hataedock Method with Coptidis Rhizoma and Glycyrrhiza Uralensis in Allergic Rhinitis-induced Obese Mice

비만 유발 생쥐에서 Th2분화조절을 통한 황련-감초 하태독법의 알레르기성 비염 발현 억제효과

안상현¹․정아람²․김기봉^2,3

1세명대학교 한의과대학 해부학교실, ²부산대학교 한의학전문대학원 한방소아과학교실, ³부산대학교한방병원 한방소아과

Received: April 21, 2019 ∙ Revised: May 10, 2019 ∙ Accepted: May 17, 2019 Corresponding Author: Kibong Kim

Department of Korean Pediatrics, Pusan National University Korean Medicine Hospital, Geumo-ro 20, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea Tel: +82-55-360-5952 / Fax: +82-55-360-5952

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Abstract

Effect of Hataedock Method with Coptidis Rhizoma and Glycyrrhiza Uralensis in Allergic Rhinitis-induced Obese Mice

Ahn Sang Hyun

․Jung A Ram

․Kim Ki Bong

1

Dept. of anatomy, college of Korean Medicine, Semyung University

2

School of Korean Medicine, Pusan National University

3

Dept. of Korean Pediatrics, Korean Medicine Hospital, Pusan National University

Objective

This study is to learn the effects of Hataedock method using Coptidis rhizoma and Glycyrrhiza uralensis mixed extract on inflammatory response in allergic rhinitis-induced obese NC/Nga mice.

Materials and Methods

The mice were fed with high fat-diet to be obese, and were divided into 3 groups as follows; allergic rhinitis-induced obese mice group with Hataedock method (CGT, n=10), no treatment group (Ctrl), allergic rhinitis elicited obese mice group (ARE). To induce allergic rhinitis, NC/Nga mice of 3 weeks age were sensitized on 7, 8 and 9 weeks by ovalbumin antigen in intraperitoneal space. After 7 days of final sensitization, allergic rhinitis was initially induced in mice through nasal cavities for 5 days. After 1-week, allergic rhinitis was induced again by the same method. Histological examination was used to identify distribution of IL-4, CD40, STAT6, FcɛRI, substance P, MMP-9, NF-κB p65, iNOS and COX-2.

Results

Hataedock method significantly reduced IL-4, STAT6 and CD40 response (p<0.05). In CGT, the inhibition of Th2 differentiation decreased inflammatory mediators such as FcɛRI, substance P, MMP-9, NF-κB p65, iNOS and COX-2 (all p<0.05). The immunological improvement led reduction of respiratory epithelial damage and mucin secretion in goblet cell.

Conclusion

The results of this study show that the Hataedock method suppresses the expression of allergic rhinitis by decreasing the inflammatory mediators through the regulation of Th2 differentiation even when the inflammation reaction is increased by obesity. Therefore, Hataedock may have potential preventive measure of allergic rhinitis accompanied by obese.

Key words: Hataedock, Coptidis rhizoma, Glycyrrhiza uralensis, Allergic rhinitis, Obesity, Th2 differentiation

ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), https://doi.org/10.7778/jpkm.2019.33.2.022

Ⅰ. Introduction

비만은 전 세계적으로 인체의 건강을 위협하는 주 요문제로 대두되고 있으며, 국내에서도 서구화된 식 사습관 및 생활수준 향상 등의 이유로 점차 그 유병률 이 증가하고 있다. 전 세계적으로 성인 뿐 아니라 소 아비만의 유병률도 점차 증가하는 추세로 2-19세의 소아청소년기 비만 환자는 2015-2016년에 18.9%로 보고되어, 1999-2000년의 13.9%에 비해 크게 증가한 결과를 보인다

. 특히, 소아청소년시기의 비만은 심 혈관계, 내분비계의 다양한 합병증을 야기할 뿐 아니 라

, 성인기 비만으로 이어져 고혈압, 인슐린 저항성, 이상혈당증, 지방간 등 심각한 문제로 이어질 수 있으 므로 소아기 건강관리에 있어 중요한 문제로 인식할 필요가 있다

.

비만은 알레르기 질환과도 밀접한 연관이 있는데, 비만 자체가 T helper 2 (Th2) skewed condition으로 향 하는 면역학적 변화를 야기하여 알레르기성 비염, 아 토피피부염과 천식 등 각종 알레르기성 질환의 발병을 높이는 위험인자로 인식되고 있다

. 실제로 고지방섭 취는 염증발현의 위험을 높이고

, 비만 소아에서는 정 상체중 소아에 비해 총 Immunoglobulin E (IgE)가 높아 져 있는 경향이 있으며

, 소아기 BMI가 높을수록 알 레르기성 비염과 아토피피부염 발병률이 높아진다는 보고가 있다

.

한의학에서도 알레르기성 비염과 비만은 유사한 병 리기전을 가지는데, 비염의 경우 외감 (外感), 습열 (濕 熱), 음식노역 (飮食勞役), 칠정내울 (七情內鬱) 등이 원인이 되며

, 비만의 경우 비위의 수습 (水濕), 위열 (胃熱), 담탁 (痰濁)이 원인이 된다. 두 질환에서 공통적 으로 습 (濕)과 열 (熱)이 그 원인이 되며

, 비폐신 (脾 肺腎)이 함께 관여하므로 한의학적으로도 두 질환은 깊은 상관관계가 있을 것으로 생각된다.

소아에서 알레르기성 비염은 Th2 사이토카인의 과 발현으로 인한 Th2 우세형의 면역환경과 연관이 있다.

임신시기에는 유산 방지를 위해 모체가 Th2 편향된 면 역상태에 놓일 뿐 아니라, 임신 시 체중증가로 인한 전 염증효소인 tumor necrosis factor-α 활성화가 Interleukin (IL)-4의 증가를 야기해 Th2 편향된 면역상태를 야기한 다

. 모체의 이러한 변화는 태아에게 영향을 주어 태아 또한 Th2 편향된 면역상태로 출생하게 됨에 따라 출생 후 이른 시기에 알레르겐 감작 시 알레르기성 비염의

유발 가능성이 보다 높아진다

.

현재 알레르기성 비염 치료에 사용되는 항히스타민 제, 국소 스테로이드제, 혈관수축제 등은 증상조절에 는 효과적이나, 알레르기성 염증으로 이어지는 Th2 면 역 환경을 조절할 수는 없으며, 지속치료시 안전성의 문제가 야기될 수 있다

. 설하면역치료 (sublingual im- munotherapy)는 알레르기 반응을 조절할 수는 있으나 역시 안전성 문제에서 개선의 여지가 있다

. 따라서 최근 알레르기성 비염 관리에 있어 비염의 발현으로 이어지는 Th2 편향 면역반응을 조절하는 항염증제 개 발이 주목받고 있다

.

하태독법은 출생 직후 시행할 수 있는 예방적 치료 법으로써, 황련, 감초, 두시 등의 한약재 추출물을 천에 적셔 출생 직후 신생아의 입 안을 닦아주거나 소량 먹 여 태독 (胎毒)을 제거하는 방법이다. 급유방 (及幼方) 에서는 “아이의 질병은 복잡하고 다양하지만, 그 중 대 부분은 태중 (胎中)에서 받은 열독 (熱毒)이다." 라고 언급하고 있어, 이른 시기에 태독을 제거하는 것은 소 아에서 유병률이 높은 각종 질환들을 예방할 수 있는 효과적인 방법으로 생각된다

.

하태독법의 국내 실험연구로는 두시 하태독법의 알 레르기성 비염 완화효과에 관한 연구와 두시 및 황련- 감초 하태독법의 아토피피부염에 관한 연구들이 있다.

모든 연구들에서 NC/Nga 생쥐 모델에 하태독법을 실 시 후 IL-4 감소 및 비만세포 활성이 조절되는 결과를 보고하였으며, 이 외 각종 염증성 매개물인 nuclear fac- tor-κB (NF-κB) p65, inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase (COX)-2와 같은 각종 항염증성 지표 들의 발현이 억제되었음을 확인하였다. 이에 우리는 보다 염증발현의 가능성을 높이는 비만한 상황을 유발 하여, 이러한 상황에서도 알레르기성 비염의 발현이 억제되는지 확인하고자 하였다. 또한, 실제 임상현장 에서도 알레르기성비염과 비만을 함께 가지고 있는 소 아 환자들을 많이 접할 수 있으므로, 비만한 생쥐에서 알레르기성 비염 발현의 조절여부를 확인하는 것은 하 태독법을 임상에서 활용할 수 있는 근거마련에 도움이 될 것으로 보인다.

본 연구는 고지방식이를 통해 NC/Nga 생쥐를 비만

에 이르게 하여 염증 반응을 가속화할 수 있는 환경을

제공하면서 황련-감초 복합추출물을 이용한 하태독법

을 시행하였다. 이후 ovalbumin (OVA)를 이용해 알레

르기성 비염을 유발하였고, 그 결과 Th2 분화 조절을

통한 알레르기성 비염의 발현이 억제됨을 확인하였기

에 이를 보고하는 바이다.

Ⅱ. Materials and Methods

1. 황련-감초 추출물의 제조

증류수 1000 ㎖에 황련과 감초 각 100 g을 넣고 3시 간동안 전탕 후 침전물을 여과하였다. 그 여과액을 ro- tary evaporator를 사용하여 50 ㎖로 감압 및 농축 후 동 결 건조로 31 g의 추출물 (수득률 15.5%)을 획득하였 다. NC/Nga 생쥐에 획득된 황련-감초 혼합 추출물을 1회 경구 투여하였다 (20 ㎎/㎏).

2. 하태독법 실시와 알레르기성 비염의 유발

체중 13~15g의 태령 3주된 수컷 NC/Nga 생쥐 (오리 엔트바이오, 성남, 대한민국)를 사용하였다. 무처치 대 조군 (Ctrl, n=10), 알레르기성 비염유발 비만 생쥐군 (ARE, n=10), 황련-감초 하태독법 시행 후 알레르기성 비염유발 비만 생쥐군 (CGT, n=10)으로 나누었다. 실 험기간 동안 고지방식 (fat, 60%; carbohydrate, 20%;

protein, 20%; DIO DIET, USA)을 자율 섭식시켰다.

알레르기성 비염 유발을 위해 OVA (chicken egg al- bumin, grade V, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)를 항원으로 사용하였다. OVA는 생쥐에서 사람

의 비염과 가장 유사한 알레르기성 증상을 유발할 수 있는 항원이다

. 7, 8, 9주령에 OVA 25 ㎍:수산화알루 미늄겔 (Al(OH)3 gel 1 ㎎:인산완충용액 (phosphate buf- fered saline) 300 ㎕으로 제조된 0.1% OVA용액을 복강 주사하여 감작시켰다. 최종 감작 1주 후인 10주령에 OVA 100 ㎍:인산완충용액 20 ㎕을 5일 동안 생쥐의 비강에 점적해 알레르기성 비염을 1차 유발하였다. 1 차 유발 1주 후인 12주령에 같은 방법을 사용하여 2차 유발하였다 (Fig. 1). 알레르기성 비염 유발여부는 콧물 과 코 긁는 행동으로 확인하였다. 본 연구과정은 부산 대학교 IACUC 승인을 받아 시행되었으며 (IACUC number: PNU-2016-1187), 실험실 동물의 관리 및 사용 은 NIH 가이드라인에 따라 시행되었다.

3. 조직절편제작

각 군의 생쥐를 sodium pentobarbital 용액으로 마취 하고, vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin)을 사용하여 심장관류고정을 시행하 였다. 두경부를 분리한 후 비강 주변 구조물을 제거하 고, 10% 중성 포르말린용액에 24시간 동안 실온환경 에서 고정한 후 탈회액 (decalcification solution, BBC, UK)에 12시간 처리하고 세척하였다. 그 다음 파라핀에 통상적인 방법으로 포매하여 연속절편을 5 ㎛ 두께 로 만들고, 절편은 hematoxylin & eosin 법으로 염색하 였다.

Fig. 1. Protocol for allergen sensitization and challenge

Mice were sensitized on week 7, 8, and 9 by intraperitoneal injection of OVA emulsified in Alum (OVA 25 ㎍:Alum 1 ㎎: PBS 300 ㎕). On weeks 4 after initial sensitization, the mice were challenged with OVA (OVA 100 ㎍: PBS 20 ㎕) intranasally. On weeks 6 after initial sensitization, the mice were challenged with OVA (OVA 100 ㎍: PBS 20 ㎕) intranasally. Hataedock using of Coptidis Rhizoma and Glycyrrhiza uralensis (CG) was orally administered on weeks 3. Abbreviation: Alum, alum hydroxide; Ctrl, no treatment group; ARE, allergic rhinitis elicited group;

CGT, Hataedock using CG treated group before allergic rhinitis elicitation; HFD, High fat diet; OVA, Ovalbumin; PBS, phosphate buffered saline.

4. 조직화학

호흡상피에서 중성점액질 (neutral mucin)을 분비하 는 점액분비세포의 변화를 조사하기 위해서 periodic acid-schiff reaction 염색을 실시하였다. 우선 periodic acid에서 5분간 반응시키고 15분 동안 schiff reagent에 서 처리하였다. 이후 각 2분씩 sulfurous rinse에서 3회 세척한 후 hematoxylin에서 1분 동안 대조염색하였다.

호흡상피의 섬모 손상을 조사하기위해 phloxine-tar- trazine 염색법을 실시하였다. Mayer's hematoxylin에 5 분 동안 핵 염색을 실시하고 30분간 phloxine 용액에 반응시켰다. 그런 다음 tartrazine 용액에서 분별 후 관 찰하였다.

5. 면역조직화학

코 조직절편의 protein inactivation을 위해 proteinase K (20 ㎍/㎖)에 5분 동안 처리 후 10% normal mouse serum에서 2시간 동안 blocking 시켰다. 그리고 1차 항 체인 goat anti-IL-4 (1:50), goat anti-Signal transducer and activator of transcription 6 (STAT 6) (1:50), goat an- ti-Cluster of differentiation 40 (CD40) (1:50), goat an- ti-high-affinity IgE receptor (FcɛRI) (1:50), goat an- ti-substance P (1:100), goat anti-Matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) (1:100), goat anti-NF-κB p65 (1:250), goat anti-iNOS (1:100) 그리고 goat anti-COX-2 (1:100)에 72 시간 동안 4 ℃ humidified chamber에서 반응시켰다. 이 후 2차 항체인 biotinylated mouse anti-goat IgG (1:100) 에 실온에서 24시간동안 link 하고, avidin biotin com- plex kit (Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) 에 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 0.05%

3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematox- ylin으로 대조염색하였다. 1, 2차 항체는 모두 Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였다.

6. 영상처리 및 분석

면역조직화학 결과는 image Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화 (means ± standard error) 하였다. 각 군에서 임의 로 선정된 비점막 10개를 x400배율에서 촬영한 후 10,000,000 pixels을 영상분석 하였다.

7. 통계

영상분석 결과의 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)를 이루어졌으며, one-way ANOVA를 통해 유의성을 검증하고 (p<0.05), Duncan’s multiple range test로 사후 검증하였다.

Ⅲ. Results

1. 비점막 손상

알레르기성 비염 유발 후 아래코선반에서 점막상피 손상증가가 관찰되었다. CGT는 ARE에 비해 감소된 경향을 보였다. periodic acid-schiff reaction 염색 결과, 알레르기성 비염 유발 후 아래코선반의 호흡상피에서 분비소낭이 없는 술잔세포가 다수 관찰되었다. CGT는 ARE에 비해 술잔세포의 변화가 적었다. Phloxine-tar- trazine 염색 결과, 알레르기성 비염 유발 후 호흡상피 섬모 손상이 다수 관찰되었다 (Fig. 2).

Fig. 2. The alleviation of respiratory epithelial damages by Hataedock method

The arrows indicate goblet cell and asterisk (*) indicates respiratory damaged region. Abbreviations: Ctrl, no treatment group; ARE, allergic rhinitis elicited group; CGT, Hataedock using CG treated group before allergic rhinitis elicitation; H&E, Hematoxylin & Eosin; PAS, periodic acid-schiff reaction stain; PT, phloxine-tartrazine stain; RM, respiratory nucosa. Bar size, 50㎛.

2. Th2 분화 조절

ARE에서의 IL-4 양성반응은 세포질에서 강하게 관 찰되었고, ARE에 비해 CGT에서 40%의 유의한 반응 감소가 나타났다 (p<0.05). STAT6는 세포질에서 강한 양성반응을 보였고, ARE에 비해 CGT에서 43% 유의 성 있는 반응 감소가 나타났다 (p<0.05). ARE의 세포질 에서 강한 양성반응을 보인 CD40 양성반응은 CGT의 세포질에서 약한 양성반응을 보였고, ARE에 비해 CGT 에서 43%의 유의한 반응 감소가 나타났다 (p<0.05) (Fig. 3).

3. 비만 세포 활성 조절

비강 내 비만세포 활성에 관여하는 FcɛRI 양성반응 은 ARE에 비해 CGT에서 53% 유의성 있게 감소하였 다. 비강 내 소양감에 관여하는 substance P 양성반응은 CGT에서 ARE에 비해 55% 유의성 있게 감소하였다.

비점막내 부종을 유도하는 MMP-9 양성반응은 CGT에 서 ARE에 비해 41% 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 4).

4. 항염증효과

염증효소 전사인자인 NF-κB p65 양성반응은 CGT 에서 ARE에 비해 48% 유의성 있게 감소하였다. 염증 효소인 iNOS 양성반응 또한 CGT에서 ARE에 비해 39% 유의성 있게 감소하였다. 염증효소인 COX-2 양 성반응은 ARE에 비해 CGT에서 52% 유의성 있게 감 소하였다 (Fig. 5).

Ⅳ. Discussion

본 연구는 염증 발현 가능성을 높이기 위해 비만한 환경을 유발한 생쥐에서 하태독법을 시행한 후에 알레 르기성 비염 발현을 유도하여 Th2 분화 및 각종 염증 지표들의 분비가 억제되는지 확인하였다. 기존 연구에 서는 염증 발현 후 한약을 투여하여 치료여부를 확인 하였다면, 본 연구는 염증 발현 전에 한약을 투여하여

Fig. 3. The regulation of Th2 skewed condition

The IL-4, STAT6 and CD40 positive reaction decreased in the CGT compared with the ARE group (immunohistochemistry; Bar size, 50 ㎛).

Results from image analysis also shows the same results (*: p<0.05, compared with the ARE). Abbreviation: ARE, allergy rhinitis elicited group;

Ctrl, no treatment group; CGT, Hataedock using CG treated group before allergy rhinitis elicitation; CD40, cluster of differentiation 40; IL-4, Interleukin-4; RM, respiratory mucosa; STAT6, Signal transducer and activator of transcription 6.

Fig. 4. The regulation of mast cell activation

The FcɛRI, substance P, and MMP-9 positive reaction decreased in the CGT compared with the ARE (immunohistochemistry; Bar size, 50 ㎛).

Results from image analysis also shows the same results (*: p<0.05, compared with the ARE). Abbreviation: Ctrl, no treatment group; ARE, allergy rhinitis elicited group; CGT, Hataedock using CG treated group before allergy rhinitis elicitation; FcɛRI, high-affinity IgE receptor; MMP-9, RM, respiratory mucosa.

Fig. 5. The anti-inflammatory effects

The NF-κB p65, iNOS and COX-2 positive reaction decreased in the CGT compared with the ARE (immunohistochemistry; Bar size, 50 ㎛).

Results from image analysis also shows the same results (* p<0.05, compared with the ARE). Abbreviation: Ctrl, no treatment group; ARE, allergy rhinitis elicited group; CGT, Hataedock using CG treated group before allergy rhinitis elicitation; COX-2, Cycloxygenase-2; iNOS, Inducible nitric oxide synthase; NF-κB, Nuclear factor-κB; RM, respiratory mucosa.

염증 발현의 조절 여부를 확인하였다는 측면에서 한의 학의 예방의학적 측면에 중점을 둔 연구이다. 본 연구 결과, Th2 분화에 관여하는 IL-4, STAT6와 CD40 반응 이 감소되었으며, 비만세포 탈과립으로 인해 야기되는 여러 염증성 매개물들의 억제가 확인되었다. 이러한 면역학적 변화들은 최종적으로 비점막의 조직 손상완 화에 영향을 주었다.

알레르기성 비염은 흔한 면역 매개 질환 중 하나로, 생명에 위협을 주진 않으나 무시할 수 없는 사회적 비 용을 발생시킴과 함께 삶의 질을 저해하는 문제를 가 지고 있다. 알레르기성 비염은 전세계적으로 높은 유 병률을 가지는데 여러 연구에서 그 유병률을 10-15%

범위로 보고하고 있으나, 소아청소년 시기의 발병은 25%에 달하여 성인에 비해 높은 편이다

. 알레르기 성 비염은 Th2 우세한 면역상태로 야기되는 대표적인 질환으로

, 소아에서 보다 높은 유병률을 보이는 이유 는 성인기에 비해 영유아기에서 편향된 Th2 면역환경 을 가지기 때문인 것으로 볼 수 있다

. 따라서, 출생 후 Th2 과발현 상태가 이어지는 것을 억제하는 것이 Th2 연관 알레르기성 질환의 발현 예방에 도움이 된다.

출생 후 Th2 편향 면역환경을 Th1/Th2 균형 상태로 이 루어 가는 능력은 생후 첫 주 이내에 완성된다는 선행 연구

에 따라 출생 직후 시행할 수 있는 하태독법이 Th1/Th2 균형을 이루어가는 과정에 도움을 주어 알레 르기성 비염을 예방할 수 있는 의미 있는 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.

우리는 하태독법에 의해 Th2 분화가 조절되는지 확 인하기 위해 IL-4, STAT6 그리고 IL-4 활성에 의해 B cell로부터 발현되는 CD40 지표를 확인하였다. 그 결 과, IL-4와 STAT6가 CGT에서 유의한 감소를 보였으 며, CD40 양성반응 역시 CGT에서 ARE에 비해 유의하 게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. Th2 분화에 관여 하는 인자 중 하나인 IL-4는 대표적인 Th2 cytokine으 로써 IL-4의 발현은 B세포의 isotype switching을 유도 하여 IgE항체를 증가시킬 뿐 아니라, IL-4 수용체에 결 합하여 naïve T 세포가 Th2 세포로 분화되는 것을 촉진 한다

. STAT6는 이러한 신호를 전달하는 중심 전사조 절인자로 IL-4가 T세포를 Th2세포로 분화시키는 과정 뿐 아니라, B 세포의 IgE 발현에도 관여하여 Th2 매개 염증반응에 있어 필수적인 인자이다

. 본 연구결과는, 염증발현이 가중되는 비만한 상태에서도 황련-감초 하 태독법이 Th2 분화를 조절함으로써 알레르기성 비염 의 발현을 억제하는 효능이 있음을 보여준다.

알레르기성 비염에서 콧물, 코막힘, 코골이, 비소양 감과 같은 증상들은 IgE에 의해 매개된 비만세포의 탈 과립화로 인해 시작되며

, 비만세포 표면에서 발현되 는 FcɛRI수용체에 IgE와 항원이 결합하면 비만세포의 활성화가 야기되고, 이는 비만세포 탈과립화의 강력한 자극원이 된다

. 활성화된 비만세포는 susbstance P, MMP-9와 같은 다양한 염증성 매개물들을 분비하여 염증반응을 유도하고

, 비만은 지방조직 내의 비만세 포 활성도를 증가시켜 이러한 염증성 매개물들의 분비 를 더욱 촉진시킨다

. Substance P는 각종 cytokine의 분비 조절 뿐 아니라, 혈관 이완 및 투과성 증가, hista- min 분비 유발을 통해 염증반응에 관여하고, 알레르기 성 비염에서 비내 소양감을 유발하므로, 소양감을 보 다 객관적으로 확인할 수 있는 지표이다

. MMP-9은 호산구 및 대식세포 등 여러 염증세포들로부터 분비되 며 기저막의 주요성분인 교원질을 분해함으로써 염증 반응시 염증세포들의 이동을 촉진하여 비점막 과민성 을 유발한다

. 실험결과 susbstance P, MMP-9 양성반 응이 CGT에서 ARE에 비해 유의미한 수준으로 감소하 는 결과가 확인되었다. 비만세포는 Th2 cytokine에 의 해 활성화되기도 하지만, 활성화된 비만세포가 Th2 cy- tokine생성을 증가시켜 염증반응이 증폭되므로, Th2 반응 및 비만세포 활성 억제는 염증반응 제어에 있어 기본이 된다

. 연구 결과는 황련-감초 하태독법이 Th2 분화를 통한 비만세포의 탈과립화를 억제함으로써, 여 러 과립 매개 염증성 매개물들의 분비를 억제하는 효 과가 있음을 의미한다.

염증관련 전사인자인 NF-κB는 세포질에서 비활성 상태로 존재하다가 알레르겐을 포함한 여러 자극에 의 해 활성화되어 IL-1β, tumor necrosis factor-α와 같은 염 증성 사이토카인의 분비를 증가시키고, iNOS, COX-2 를 포함한 다양한 염증성 매개물들의 유전자 발현에

관여한다

. 또한 생쥐의 고지방 식이는 지방조직에

서 iNOS 발현을 현저히 증가시켜 iNOS-Nitric Oxide

(NO) 신호를 통해 호산구 증가 및 혈관확장에 기여하

는 NO를 생성함으로써 보다 염증이 잘 발현되는 환경

을 야기한다

. 이와 같이 알레르기 발현의 위험요인을

유도한 상황에서도 CGT에서 ARE에 비해 NF-κB,

iNOS, COX-2 양성반응이 유의미하게 감소함을 확인

할 수 있었다. 이는, 황련-감초 하태독법이 염증성 매개

물들의 발현에 영향을 주는 NF-κB pathway를 제어함

으로써, 알레르기성 비염의 발현을 조절했을 것으로

해석할 수 있다.

한의학에서 비만은 습 (濕), 담 (痰), 열 (熱) 등에 의 해 발생하는 것으로 보며, 소아에서의 알레르기성 질 환 또한 태독에 의한 것으로 야기된다고 볼 때 두 질환 은 ‘열’이라는 공통의 병인을 가진다. 태독을 제거하는 하태독법에는 여러 약재들이 사용되지만, 그 중 황련 은 심열 (心熱), 비위습열 (脾胃濕熱) 및 열독 (熱毒)을 제거하는 효능이 있으며, 감초 역시 청열해독 (淸熱解 毒) 효능이 있어 두 약재의 사용이 열성 질환에 효과가 있을 것으로 생각된다

. 소아는 순양지체 (純陽之體) 로 성인에 비해 보다 열성질환이 발현될 가능성이 높 다. 서양의학적 관점에서 염증성 사이토카인 활성화는 한의학적 관점의 ‘열’이 축적된 것과 연관이 있으므로

29)

, 본 연구에서 확인된 IL-4를 비롯한 여러 염증성 지 표 및 비점막 손상의 감소는 하태독법을 통한 열독 제 거로 인한 결과로도 해석할 수 있다.

황련의 주성분은 berberine, coptisine 등으로 berber- ine의 경우 Th1/Th2 cytokine의 유전자 발현에 관여하 여 Th2 bias를 억제하는 기전이 보고되어 있고, copti- sine는 IL-4분비와 비만세포 활성 조절을 통한 염증 억 제 효과가 보고된 바 있다

. 감초의 항염증효과도 다 수의 연구에서 보고되어 있는데, 감초의 주성분인 gly- cyrrhizin의 NF-κB발현 억제효과

및 isoliquiritigenin 의 COX-2와 iNOS의 발현 억제작용이 보고되어 있고

32)

, glycyrrhetinic acid의 butyrate 성분이 NF-κB 경로 조 절을 통해 염증을 억제하는 기전이 보고되어 있다

. 따라서 위 성분들의 약리학적 효능이 염증 억제에 영 향을 준 것으로 보인다.

하태독법에 대한 선행연구로는 정의 연구

에서 한 의사를 대상으로 한 하태독법 인식 조사 및 김 등의 하태독법 시행 후 어머니를 대상으로 한 만족도 조사

가 있다. 정의 연구

에서 한의사들이 하태독법을 임상 에서 적용하기 어려운 이유로 보호자 설득의 어려움을 꼽았는데, 황련-감초 하태독법이 알레르기성 비염의 발현을 억제해준다는 실험결과는 비만 및 알레르기성 질환에 대한 보호자들의 우려가 가중되는 상황에서 예 방의학적 가능성을 보여주어 임상에서의 활용도를 높 여 줄 것으로 기대된다.

이상의 결과로 황련-감초 하태독법이 비만으로 염 증이 가중되는 면역 환경에서도 Th2 편향으로 인한 염 증 반응을 제어함으로써 알레르기성 비염의 발현을 제 어하였음을 확인할 수 있었다. 향후 후속연구를 통해 소아에서 야기될 수 있는 다양한 염증촉발인자에서 하 태독법의 효능을 추가로 검증하고, 염증조절의 분자적

기전과 안정성 및 유효성 검증이 필요할 것으로 생각 된다.

Ⅴ. Conclusion

본 연구는 고지방식이를 통해 비만을 유발하여 염 증이 가중되는 상황에서 황련-감초 하태독법이 알레르 기성 비염 발현에 대해 억제 효과가 있는지 확인하고 자 하였다. 태령 3주된 NC/Nga mice에 OVA를 이용하 여 알레르기성 비염을 유도하였고, 아래코선반의 호흡 상피를 면역조직화학을 통해 관찰하여 아래와 같은 결 과를 얻었다.

1. CGT에서 ARE군에 비해 호흡상피의 손상이 적게 나타났으며, 술잔세포의 점액분비도 감소하였다 (p<0.05).

2. Th2분화 관련 지표인 IL-4, STAT6, CD40 양성반 응이 CGT에서 ARE에 비해 유의하게 감소되었다 (p<0.05).

3. 비만세포 활성과 연관이 있는 FcɛRI, substance P, MMP-9 양성반응이 CGT에서 ARE에 비해 유의 하게 감소되었다 (p<0.05).

4. 염증성 지표인 NF-κB p65, iNOS, COX-2 양성반 응이 CGT에서 ARE에 비해 유의하게 감소되었다 (p<0.05).

감사의 글

이 연구는 2016년도 정부(교육부)의 재원으로 한국 연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임 (No.

NRF-2016R1D1A1B03930474).

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