Vibrio Vulnificus 의 세균학적 성상에 관한 고찰

대한임상병리사회지

:

제 20권 제

1

호

1988

Vibrio Vulnificus 의 세균학적 성상에 관한 고찰

전남대학교병원 임상병리과

·

조 기 학

1.

서 론

1979

년 이후 우리나라 호남지방에서 여름철이면 주로

간기능이 저화되어 있거나， 심한 음주벽이 있는 사람이 생선 (raw

fish) , 조개 (clam) ， 낙지 (octopus) ， 개조개 (coc­

kle) ,

가재(lobster) ， 조개류 (shell fish) 동의 해산물을 생 식한 후에 갑작스런 오한， 발열， 피로， 의식혼탁 등의 전 신증상과 함께 수포， 피부괴사둥의 피부병변을 일으켜 용급실을 통해 입원한 환자가 집중적인 치료에도 불구하 고 병세가 급격히 악화되더 극히 짧은 기간내에 사망하 는 경우가 많아 신문지상에 ‘괴질’로 보도되었으며 이후 수년간 원인도 발혀지지 않은 채 또는 몇몇 학자들에 의 해서는 다른 균종으로 잘못 동정보고되어 많은 사람들의 두령움의 대상이 되었으며 특히 이외의 지방에서도 보고 가 속출하여 사회적인 관심이 되어 왔었다. 최근에 이

‘괴질의 원인균은 바닷물， 갯벌， 어패류 둥에 존재하며 유당을 발효시 키 는 호염 기 성 특성을 가진

Vibrio vulnificus

균으로밝혀졌다.

해수에서 유래하는 인간감염증1)의 원인균 또는 의섬되 는 굵으로 현재까지 알려진 것으로는

V.parahemolyticus , V.alginolyticus , V.vulnificus. V.fluvialis , V.hollisae , V.- metschnikovii

및 V.damsela둥의 Vibrio속과 그 외의 것 으로 Aeromonas 의 균속과

Plesiomonas shigelloides

및 V.cholera동을 들 수 있다. 이들 해수세균에 의한 감염은 주로 위장염， 설사증 내지는 콜레라양 병증 둥 장관 감염 증을 일으킴이 상례이나 가끔 창상 연부조직 감염을 일 으키기도 하고， 특히 기존질환이 있는 면역환자에 있어 서 는 중독한 기 회 감염

(opportunistic infection)

의 형 태 로 나타냐(예， 폐혈증) 생명의 위협까지 주는데 이중 대표 적 인 것 이

v.vnlinficus

감염증이 다.

이에 저자는 남부 해안지방에서 여름철이면 발생하여 많은 사망자를 내고 있는 괴질병의 원인올 규명하고자 1983 년부터 1987년까지 전남대학교 병원에 내원한 괴저 성 피부병변과 쇼크 상태인 환자중에서 혈액， 수포액， 조 직 동을 채 취 배 양 동정 하여 V.vulnificus로 확정 된 28균 주를 중심으로 미생물학적 실험과 문헌 고찰을 통해

V.

vulnificus균의 세균학적 성상을 규명하여 그 예방대책을

강구하는데 도움을 주고져 한다.

II. 시료 및 실험방법 1.시료

공시균은 1983 년부터 1987년 사이에 전남대학병원에

입원한

V. vulnificus

패혈증 환자들의 혈액 또는 피부병

변 둥에서 분리된 병원성

V.vulnificus

28주를 공시하였 다.

이 들 공시 란들은 m띠ified

salt water-yeast extract agar

2) 사면배지에 접종하여 배양시킨 후 실온에 보관하면서 해당실험에 사용했으며 매 2-4주마다 한번씩 계대배양 해주었다.

Modified salt water-extract

agar는 1000ml 의 증류수 에

KCl 0.75g , MgS0

4

7H

2

0 7.0g ,

NaC123.4g을 첨 가하여 제조한

Three Salt

Solution에

proteose pepton (Difco) O.

1 %, yeast extract(Difco) 0.1 %,

한천 (Difco)

1.5

%를 첨 가하여 만들었다.

2. 실험방법

1 )

생화학적 성상 및 각 배지 양상의 관찰

일차적 인 균의 동정 은

API (Analytical profile lndex) 20E system

(France) 을 이용하여 실시했으며， 생화학적 성상은 검사들에 사용된 배지 및 그 실험수기는 이미 발 표되어 여러 실험실 및 검사실에서 널리 쓰이는 방법 3)에 준하여 각 항목에 적합한 배지를 따로 재작하여 시험 관 찰하였다.

균 집 락 양상의 관찰은

modified salt water-yeast agar

사면배지에 유지하고 있는 병원성 균주들을 그람음성 장 내세균 분리시 널리 사용되고 있는

eosinmethylene blue (EMB) agar , Salmonella Shigella(S.S) agar , Mac Conkey (MC) agar, Endo agar, xylose-lysine deoxycholate(XLD) agar , Hektoen-enteric(HE) agar , thiosulfate-citrate-bile

salt(TCBS) agar

둥의 분리 또는 선택배지에 선상도말

하여 24시간 후에 관찰하였다.

-182-

-20

⁰

C , rc ,

실온(약20⁰C) ，

3TC ,

42⁰C 에서 각각 배양하고 시간별로 생균수 검사를 실시하여 그 결과를 근거로 증 식곡선을 작성하였다.

생균수 검사는 BAP를

plating

medium으로 하여

pour

plate 법으로 실시했다.

2)

염도와균증식과의 관계

1 % pepton

water를

pH

7.2로 맞추고 0%에 서 10% 까 지 식염의 농도차를 두어 균증식 여부를 관찰하였으며，

미국 Abbott사의

Microbiology system -2 (MS -

2) 를 이용 하여 측정하였다.

5)

항생제 감수성 검사

Bauer- Kirby Antibiotic susceptibility

test를 실시 하였 는데 배 지 는

Mueller- Hinton

agar를 높이 가 4mm 가 되 게 하고 란의 부유액은

MacFarland No.

0.5를 사용하였으며

3TC

incubator에서 18시간 배양 시칸후 판독하였다.

3)

pH 와 균증식과의 관계

1 % NaCl pepton

water에 pH를 4.0부터

4.5 , 5.0 , 6.0 , 7.

0 , 8.0 , 9.5 ,

10.0 의 범위에서 차둥을 두어서 35⁰C 에서 균의 증식여부를 관찰하였다.

ill. 결 과

1.

병원성

V.vulnificus

28주의 생화학적 성상 조사깐파 는 다음

Table

1 에서와 같다.

4)

온도와균증식

염도 실험에서 가장 좋은 농도로 나타난 2%와 3% 의 중간 2.5% 의 염도를 함유하도록 2% 의 NaCl 이 보강된

brain heart infusion

(BHI) 액에 병원성 균주를 접종한 후

Table 1. Biochemical characteristics of V.vulnificus isolated in this experiment

Experiment

%0아

f posìtìve

Hollis싸

%0아

f posltlve Biochemical tests

or substrates Result

HzS(Triple sugar iron agar) Urease

Indol V -P reaction Simmons citrate Motility Gelatinase

Lysine decarboxylase Omithin decarboxylase Arginine decarboxylase Glucose_ Gas

Glucose , Acid Lactose Cellobiose Maltose Salicin

Nitrate to nitrite Fermentation Oxidase

o % NaCl growth 0.25 % NaCl growth 6.0 % NaCl growth 8.0 % NaCl growth

g

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q

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vu

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V

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100 8 Result

+

+ + +

V

+ + + + + +

F

+

+

V

-183-

‘ : Standards by Hollis et a l.

** : Delayed reaction after 48 hours.

위

Table

1 에서 생화학적 성상은 대체로

Hollis

등4)이 위

Table

5에서 V.vulnificus는

pH

5.0에서 9.5 까지 상 조사 보고한 결과와 균 동정에 있어서 거의 일치했다. 당히 넓은 범위의 pH에서도 증식이 가능하였으며，

pH

세부적 인 생화학적 실험에서

Ornithin decarboxylase

10.0에서도 4주정도는 자랐다.

반응에는

Hollis

등은 66%가 양성이었다고 보고했으나

4.

염도

2 .5 % BHI

액체배지에 접종된 V.vulnificus외 본 실험에서 검출한 병원성 균주에서는 20주가 양성이어 여러가지 온도에서의 증식상은 다음

Fig.

1 에서와 서 71%를 나타냈었다. 또한 유당발효시험에서 주는

48

같다.

시 간 후에 야 양성 반응을 나타내 었으며

Simmon’s citrate

Fig.l에서 실온 37"C， 42"C에서는 24시 간 후에 약

l Cf cfu /

시험에서는 Hollis등은 76%가 양성이었으나 본 실험에서

ml

정도의 균수를 관찰할 수 있었으며 -20⁰C 와 4⁰C 에서 는 100%의 양성을 나타내었다. 는 균의 증식을 관찰할 수는 없었다.

위

Table

2에서

EMB , SS

및

DC

agar에서는 균의 증

5.

항생제 감수성검사 결과는

Table

6에서와 같다.

식에 의한 집락은 볼 수 없었으며 그외에는

Mac Conkey Table

6에서 다른 항생제는 감수성을 보였으나

colistin

agar상에서는 무색，

Endo agar

상에서는 pinpoint형태 8)만은 내성을 나타내고 있다.

XLD

agar 상에서는 분홍색， HE

agar

상에서는 짙은 녹색 의 중심부를 가진 녹색이었으며

TCBS

agar상에서는 청 색에서 녹색의 집락을 관찰할 수 있었다.

여러가지 장내세균 분리 및 선택배지상 균집락의 형태 학적 특징은

Table

2 에서와 같다.

Table 2. Growth chracteristics of V.vulnificus on various agar plates

Agar plate Eosin , methylene blue Salmonella shigella Desoxycholate MacConkey Endo Xylose-lysin

deoxycholate Hektone -enteric

Morphology : Size (mm) and color No growth No grwoth No grwoth 1 -2 , colorless Pinpoint 2 , pink

1-2 , Green with dark green center

Thiosulfate-citrate 1-2 , Green or blue

-bile -sucrose to green

Duration of incubation : 24 hours

2.

염분이 없는 배지에서는 균의 증식되지 않았으나 식 염농도 0.25%부터 6% 까지에서는 균의 증식하고 있 음을 Bllake⁵)와 Wach-Smuth⁶)둥의 보고에서와 같았 고 8%에서는 균의 증식이 없었다.

이상의 결과는또한 Oliver둥7)이 기술한유당발효 Vibrio 균의

Nurnerical

taxonomy중 치 명도가 높고

V.vu1nificus

가 주로 속하는

Cluster m

에 해 당했다 (Table

3 , 4

참조).

3.

배지의 pH 에 따른 V.vulnificus의 증식 결과는

Table

5에서와 같다.

N. 고 찰

V.vulnificus는

V.parahaemolyticus

및

V.alginolyticus

와 더불어

Halophilic

Vibrio에 속한다.5，6) 호염성 Vibrio증 V.parahemolyticus는 1950 년 이후 설사를 동반하는 장 내감염증이 중요한 원인균으로 알려져 왔.으며 9，10) 때로는 장외감염증에서 분리 보고된 예도 있다.11，12)

V.alginolyticus는 1973년 이후에 비로서 병원균으로 알려졌으며 주로 장외감염증을 일으키며 13，14) 1979 년 중 반까지 20편 이상의 문헌 보고 되었으나 그 균독력은 후 술할 V.vulnificus와 비교되지 않을 정도로 미약하여 창 상이나 고막천공시 등의 특수상태가 존재하지 않을 때는 감염이 일어나지 않은 것으로 알려져 있다.

V.vulnificus는 1964 년에 처음 논의된 것으로 전에는

“장엽 비브리오 유사” “해수 비브리오

biotype 6330"

또 는 L 十

(lactose fermenting)vibrio

둥으로 기 재 되 었다.

1973 년

Baurnann

퉁은 해양의 균분류학에 관한 연구 결과 장외감염에서 분리된 굵주중

L+

vibrio 의 특성을 갖는 종의 명명이 되지 않은 균주를

group C -

2¹⁵)라 하였 고 1976 년

DNA

reassociation실험을 통해 별개의 균주임 을 밝히고 이를

“ Beneckea

vulnifica" 로 명명하였다.

1976

년 미국

CDC (Center for Disease

Control) 의

Hollis

⁴⁾ 둥은 11 년 동안 사람의 장외감염에서 분리된 호염성 Vibrio를 재분석하고 이 중 다수가 명명이 안된 Vibrio임을 밝히고 그 생화학적 특성을 처음으로 보고 하였다. 그 후 1979년 Farmerll에 의 해

L+

Vibrio와

Beneckea

vulnifica를 합 쳐

Vibrio

vulnificus로 명 명 된 후 최 근에 널 리 사용되 고 있다.

본 연구에서 얻어진

V.

vu1nificus의 셰균학적 성상은

oliver

둥이 기술한 자연환경에서분리한 유당발효

Vibrio

균주들의

nurnerical

taxonomy7)중

clusterm

에 해 당하는 데， 이

cluster

m 에는 표준균주로 공시한 V.vulnificus로 확인 동정된 균주들이 주로 포함되며 치명도가 높고 바

-184-

Table 3.

Biκhemical

characteristics and group determination of V.vulnificus isolated by C.N.U.H from olnver ’ s criteria Presence of trait by cluster No. V.vulnificus

Biochemical tests I n m N V isolated by

(n=12) (n=8) (n=33) (n=11) (n=5) C.N.U.H.

Oxidase + + + + + +

Catalase + + + + + +

Fermentation of lactose V + ^V + + +

Sucrose

Salicin V V + + + +

Gas from dextrose

Hydrolysis of starch + + + + +

Hydrolysis of geltion V + + + + +

TSI K/ A + + + + + +

HzS(on TSI) + + ^V +

V-P

LDC V + + + + +

ODC V V V + ^V

ADC

Urease +

Indol V V V +

Growth in NaCl , 0.1 % V

3.0% + + + + + +

6.0% + + ^V + ^V +

10.0% V

Growth at 5 C

42 C V + + + ^V +

Sensitivity to V + +

penicillin

Colistin V +

Table 4. Lethality rate(%) of lactose fermenting Vibrios in mice*

Group NO.of

strains싹

% of lethality

Cluster 1 13 16.7

Cluster n 8 87.5

Cluster m 33 82.4

Cluster N 11 18.2

Cluster V 5 0.0

‘ A 0.5ml dose of a stationary-phase culture grown at 23 C in brain heart infusion broth was injected intrapartioneally into ICR mice.

** Cited from Olliver et al’bibliography

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2 6 10 14 18 24

Fig. 1. Effect of temperature on the multiplication of V.

vulnificus in 2.5 % NaCl brain heart infusion broth.

-185-

Table 5. Effect of media pH on the growth of V.vulnificus in 1.0 % NaCl peptone water pH

Strain 4.0-4.5 5.0 6.0

V. vulnificus

isolated from + +

C.N.U.H

Table 6. Susceptibility tests of V.vulnificus by C.N.

U.H

V.vulnificus Antimicrobial Disc

by C.N.U.H

agent content

(n=28)

Penicillin G 10 units S

Ampicillin 10 ug S

Carbenicillin 100 ug S

Kanamycin 30 ug S

Gentamicin 30 ug S

Amikacin 10 ug S

Tobramycin 10 ug S

Colistin 10 ug R

Cephalothin 30 ug S

Tetracycline 30 ug S

Chloramphenicol 30 ug S

S , susceptible R , Resistant

닷물이나 갯벌

plankton

둥에서 보다 조개류 및 굴 둥외 해산물에서 분리율이 높은 것이 특징이다. 본 실험에 공 사한 병원성 균주가 분리된 환자들 중 피조개 및 낙지 등 을 생식한 과거력이 많았던 것이 특기할 만한 소견이었 다.

Kreger¹⁸)둥은

V. vulnificus

배양액으로부터 항원성을 가진 이열성의 독소를 분리 정제하여 분리된 독소가 포 유동물의 적 혈 구를 파괴 하고，

chinese hamster ovary cell

에 대해 세포독성이 었으며， 기니픽 피부의 혈관 투과성 을 증가시키며， 마우스에 대해 치명적이라는 사실을 밝 혀내고 그 사실들이

V.vulnificus

감염증시 나타나는 임 상증상들과 부합되고 독성이 강한 균주에서 독소의 생산 이 더 많았다는 점에서 독소가

V.vulnificus

감염증의 병 인으로서 중요하다고 강조했다.

Carruthers¹⁹)동은 V.vulnificus가

V.parahaemolyticus

보다 혈청의 살균작용에 덜 영향을 받는다고 했으며，

Tamplin

20)등은 V.vulnificus가 다른 Vibrio속들 보다 혈 청보체계를 활성화시키는 정도가 낮다고 보고했는데 이

10.5

7.0 8.0 9.5 10.0

- 11.0

+ + + ^V

대장균을 잘 죽이지 못한다는 Fierer등에 이르기 까지 연 구보고들을 종합하여 보면 V.vulnificus가 가진 특질 등 이 Oliver등이 실험 분류한

cluster

m 와 부합하며 마우스

를

82.4

%나 치사시켰다는 결과를 잘 입증하여 주고 있다.

또한 본인이 실험 동정한 병원성

V.vulnificus

28주 전 부가 Oliver등이 분류한

cluster

m 에 해당 되었다는 사실 을 볼 때 간장질환이 있는 환자에서

V.vulnificus

패혈증 이 잘발생하는 이유를 설명할수 있으리라사료된다.

본 실험을 통하여

V.vulnificus

세균은 rc 나 20⁰C 에 서도 완전히 사멸되지 않는다는 결과로 부터 저온에는 상당한 내성을 지니고 있음을 의미하며 월동한 균들은 5월에서 10월 사이에 더운 날씨로 바닷물의 온도가 상승 함에 따라 활발히 증식하여 해산물을 오염시켜 이들에 감수성이 있는 환자들이 어패물을 생식했을 때 패혈증을 용이하게 일으킬 수 있으리라 유추할 수 있다.

V.vulnificus는

halophilic organism

이 라는 점 때 문에 Hollis퉁이나 Farmer등이 실험하고 균을 명명한 이후에 도 각 병원이나 실험실 등에서 쉽게 동정하지 못하고

Aeromona

hydropila 나

Pseudomonas

spp등으로 잘못 동 정 하기 쉽 다. 이 는 V.vulnificus가

halophilic organism

이 기는 하나 0.25%에서도 균이 잘 증식되므로 병원 실험 실에서 보통 사용하는

BAP(blood agar

plate) 등의 배지 에 는 0.5% 의 NaCl 이 함유하므로 V.vulnificus가 다른 균 과 같이 증식하는데도 저해요인이 없다. 더우기 BAP 의 배지상에서의 집락 성상이

Aeromonas hydrophila , Pseu- domonas

spp나

V.vulnificus

균주가 거의 동일하게

gree-

nish 한 균색소를 생성하고 용혈성과 점액성이 있다. 또한 생화학적 반응에서도

oxidase

test가 다같이 양성이어서 군집락의 관찰로나 간단한 생화학적 실험으로는 호염균 인 V.vulnificus와 비호염균인

Aeromonas

hydrophila와

Pseudomonas

spp. 과의 감별이 어렵다. 그리하여 비호염

균을 동정 하기 위 해 보통 사용하는

API (Analytical prople Index)

20E 에

D.W (distilled

water) 를 사용하나 호염균 에는

D.W.

대신

0.85% NaCl

용액으로 균을 부유시켜 사 용하여야 균이 잘 성장하여 정확한 동정을 기대할 수 있 다.

는

V.

vulnificus가 다른 vibrio들과는 달리 패혈증을 잘 일 이러하므로 V.vulnificus로 의심되는 균주는

halophilic

으킬 수 있는 이유로 생각되고 있다. 또한 간경화 환자의 orgamsm 이라는 사실을 염두해 두고 동정등을 하여야 한 혈청이 정상인의 사람 혈청보다 혈청에 감수성이 있는 다고 사료된다.

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Study on the Bacteriological Proporties of Vibrio Vulnificus

Kee-Hak Cho

Department of Clinical Pathology, Chonnam National University Hospital

Abstract

V.vulnificus has been recognized as a serious pathogen causing life threatening spticemia. Its infection developed after eating raw oyster or raw fish, especially in patients with preexisting_ liver disease, alcohlism and diabetes mellitus. From January 1983 to December 1987, auther isolate the 28 cases of the V.vulnificus from necrotic skin lesion, bulla fluid and blood of septic patients admitted to the CNUH.

The results obtained are as follows.

1. Without certain inhibitory factors, V.vulnificus grew well on common blood agar and classified as Oliver'

s group ill by biochemical characteristics.

2. V.vulnificus grew vere poorly without the added NaCI, but grew well on media with 0.25-6.0% NaCl, es- pecially 1-3% NaCI, which is same as that of sea- water.

3. Range of pH for growth is relatively wide, pH 5.0-9.

0.

This organism grew at 24-42°C but the optimal tem- perature for growth was 37"C. Because V.vulnificus did not proliferate but survive at 5 OC or -20 OC, it was suggested that this organism could pass the winter.

4. In susceptibility test, this organism were susceptible to most of tested antibiotics except to colistin.

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These results indicate that person with preexisting severe hepatic dysfunction, heavy alcohlism and certain immunosuppressive states should avoid having raw sea

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