Antibacterial and Antioxidative Activities of Epimedium koreanum Nakai Extracts

삼지구엽초 추출물의 항균 및 항산화 활성에 대한 연구

원두현¹, 구현아¹, 김혜진¹, 한샛별¹, 박진오², 박수남¹*

1서울과학기술대학교정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소

2대봉엘에스(주)

Received : December 18, 2012 / Revised : May 20, 2013 / Accepted : May 21, 2013

서 론

신체는항상다양한유해물질에노출되어있으며피부는 이러한외부유해물질로부터체내를보호하는역할을한다^. 피부에손상을일으키는대표적요인으로는자외선^, 공해^, 미 생물등을들수있다^. 미생물에의해피부가손상되는예로 는여드름균^{(P. acnes)}이대표적이다. P. acnes는모낭내에 서성장하며다량의 superoxide anion (O₂·⁻)을형성시키고 linoleic acid를감소시킨다^. 이러한작용은피부의방어기 능을약화시키고염증부위를더욱확장시켜여드름을악화 시킨다[9, 11, 12, 19, 22]. 이외에도피부상재균에는비듬이 나지루성피부염을발생시키는 Pityrosporum ovale를포함

하여 Escherichia coli, S. aureus, B. subtilis, Pseudomonas

aeruginosa 등이있다^. 이러한피부상재균은피부의항상성

을악화시키고심할경우질병을일으키기때문에화장품분

야에서는이를막기위해 methyl paraben과같은방부제가

사용되고있다^. 하지만최근 ^paraben 류를포함하는합성방

부제의안전성에대한문제가대두되면서이를대체할수있 는천연방부제연구가활발히진행되고있다[3, 4, 14, 21].

미생물외에도자외선과공해는피부에산화적스트레스 를유발한다. 특히자외선에의한산화적스트레스는피부노 화의주요요인이다^. 피부가자외선에노출되면활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이생성되어주요조직을손 상시키고결과적으로 주름과 같은 노화를 야기하게된다 [2, 8, 18, 20]. ROS란유해한산소종으로, hydroxyl radical (·OH), superoxide anion radical (O₂·⁻), singlet oxygen (¹O₂), hydrogen peroxide (H₂O₂), peroxyl radical (ROO·^), hydroperoxide (ROOH) 등이포함된다^. 이들은높은산화력 Antibacterial and Antioxidative Activities of Epimedium koreanum Nakai Extracts. Won, Doo Hyun¹, Hyun A Gu¹, Hye Jin Kim¹, Saet Byeol Han¹, Jino Park², and Soo Nam Park¹*. ¹Department of Fine Chemistry, Nanobiocosmetic Laboratory, and Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, Seoul 139-743, Korea, ²DAEBONG LS, Incheon, Korea

In this study, the antibacterial and antioxidative activities of Epimedium koreanum Nakai were investigated for applications as cosmetic ingredients. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of fraction-bacterium, that showed high antibacterial activity from disc diffusion assay on human skin pathogens, were tested. The ethyl acetate fraction on Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Propionibacterium acnes and 50% ethanol extract on S. aureus exhibited higher antibacterial activities than methyl paraben, well known as a preservative. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activities of 3 fractions of E.

koreanum Nakai were lower than (+)-α-tocopherol, known as a typical antioxidant. From the results of the scavenging activities of various ROS generated in Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ systems (OSC₅₀), 50% ethanol extract (OSC₅₀ = 2.46 ± 0.06 μg/ml) and agly- cone fraction (OSC₅₀ = 1.45 ± 0.02 μg/ml) showed high activities similar to L-ascorbic acid (OSC50 = 1.50 ± 0.85 μg/ml), used as reference. The cellular protective effects (τ50) on photohemolysis by ¹O₂ generated by photosensitization reaction were tested. The cellular protective effect of 50% ethanol extract (τ50 = 37.0 ± 0.3 min) was similar to (+)-α-tocopherol (τ50 = 38.0 ± 1.8 min), used as reference. In particular, the τ50 of aglycone fraction results were 165.9 ± 7.2 min. This is a high cellular protec- tive effect, more than 4 times that of (+)-α-tocopherol. These results indicate that E. koreanum Nakai extract, and its fractions, could be utilized as a cosmetic ingredient possessing antibacterial and antioxidative activities.

Keywords: Epimedium koreanum Nakai, antibacterial activity, Propionibacterium acnes, antioxidant, cosmetics

*Corresponding author

Tel: +82-2-970-6451, Fax: +82-2-972-9585 E-mail: [email protected]

© 2013, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology

을바탕으로세포용혈^, 지질과산화^, 피부탄력유지에필 수적인콜라겐^, 엘라스틴섬유의절단등을일으켜노화를 가속화시킨다[13, 15, 16].

이러한 손상으로부터 피부를 보호하기 위해 체내에는 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxide (GPx), catalase (CAT)와같은효소적항산화제와^, 비타민 ^C, 비타 민 ^E와같은비효소적항산화제들이존재한다^. 체내항산화 제들은서로상호보완적으로작용하여항산화방어막을형 성하고있다^. 하지만과량의 ^ROS가생성될경우체내의항 산화방어막은무너지게되며외부에서보충된항산화제는 이러한항산화네트워크를보호하고회복시킨다^. 따라서화 장품산업에서는오랜기간항산화제에관한연구가진행되

어왔다[6, 7, 10]. 항산화제연구에는크게합성항산화제와

천연항산화제가있는데^, 최근에는천연방부제와동일한이 유로천연물을이용한항산화제에대한많은연구가진행되 고있다^.

이번실험에서사용한삼지구엽초(E. koreanum Nakai)는 식용^, 약용으로사용되는매자나무과식물이다^. 삼지구엽초 에대한항산화활성연구는일부보고된바가있으나^, 대부 분이라디칼소거활성에집중되어있고제한된추출방법 을이용하였기때문에화장품원료로서가능성을확인하는

데부족함이있었다^{[5, 17].} 따라서이번연구에서는다양한

추출^, 분획조건을이용하여^, 피부에서생성되는여러 ^ROS 에대한총체적인항산화실험과피부에존재하는균종에대 한항균효과를확인함으로써삼지구엽초의화장품원료로 서응용가능성을복합적으로확인해보았다^.

재료 및 방법

기기 및 시약

Varian (Australia)사의 ^{Cary 50}을 UV-VIS spectro- photometer로, Milton Roy Co. (USA)의 Spectronic 20D는 적혈구광용혈실험에사용하였다^. 화학발광실험에사용한 6-channel LB9505 LT는 Berthold (Germany)사의제품을 사용하였고^{, pH meter}는 Hanna (Korea)사제품을사용하 였다^.

비교물질로사용한 ^(+)-α^-토코페롤, L-ascorbic acid, 화학

발광실험에사용한 EDTA, luminol, 적혈구광용혈실험에

서광증감제로사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에 사용한 DPPH radical은 Sigma (USA)에서구입하여사용하 였다^{. FeCl}3·^6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을^, H₂O₂는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사제품을 사용하였다^{. Na}2HPO₄·^12H2O, NaH₂PO₄·^2H2O, NaCl, 에 탄올^, 메탄올^, 에틸아세테이트^{, n-}헥산등각종용매는시판 특급시약을사용하였다^.

삼지구엽초의 분획 및 추출

실험에사용된삼지구엽초는경동시장약업사를통해한 약재로판매되는원료를구입하였다^{. 100 g}의건조된삼지 구엽초를 ^{4 L}의 ^50% 에탄올용액에 ^{24 h}동안침적시킨후 여과건조하였다^. 이렇게얻어진분말일부는실험에사용하 였고^, 일부는에틸아세테이트분획을만드는데사용하였다^. 에틸아세테이트분획을만들기위해^{, 50%} 에탄올추출물 을감압농축하였다^. 그후 ^n-헥산을사용해 ^50% 에탄올추 출물 내에 잠재적으로 광증감 반응을 일으킬 수 있는

chlorophyll을제거하였다^. 이후에틸아세테이트분획을감

압해분말을얻은후실험에사용하였다^.

마지막으로아글리콘분획을얻기위하여에틸아세테이트 분획에서얻은분말일부를사용하였다^. 에틸아세테이트분 획을산가수분해반응을통해당을제거시켜아글리콘분 획을얻었다^. 산가수분해를시키기위해에틸아세테이트분 말에 H2SO4 및아세톤용액을넣고, 환류법을이용해 4 h 동 안중탕가열하였다^. 환류시킨용액을 5% KOH/MeOH 용 액으로중화적정후다시에틸아세테이트를넣어분획시켰 다^. 분획한에틸아세테이트층을감압·농축하여얻어진분 말을당이제거된아글리콘분말로실험에사용하였다^.

이와같이얻어진삼지구엽초 ^50% 에탄올추출물^, 에틸아 세테이트분획및아글리콘분획을이용하여항균및항산 화효능을살펴보았고^, 결과적으로화장품및식품원료로서 그응용가능성을확인하였다^.

삼지구엽초 추출물의 항균활성 측정

Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정: ^Gram (+)에속하는 S. aureus, B. subtilis, Gram (−⁾에속하는 ^E.

coli, P. aeruginosa, 피부질환을 일으키는 P. ovale, P.

acnes에대한항균활성을 disc diffusion assay로측정하였 다^. 실험에 사용된 ⁶종의 균주는 한국 미생물 보존센터 Table 1. List of strains and cultivation condition used for anti- microbial experiment.

Strains Media Temperature Time

S. aureus ATCC6538 MH^a 37^oC 24 h

B. subtilis ATCC19659 MH 37^oC 24 h

E. coli ATCC23736 MH 37^oC 24 h

P. aeruginosa ATCC29336 MH 37^oC 24 h

P. ovale ATCC12078 Pityrosporum medium^b

30^oC 72 h P. acnes ATCC6919 RC^c 37^oC (CO₂) 72 h

aMueller-Hinton medium.

bMalt extract agar 6%, oxbile 2%, tween 40 1%, glycerol monooleate 0.25%.

cReinforced clostridial medium.

(KCCM)에서분양받았다^. 배양된균주는 ¹×^{107 CFU/ml}으 로조절하였고^, 배지조성은 ^{Table 1}에명시하였다^{. Paper} disc (diameter 8 mm, Roshi Kaisha. Ltd., Tokyo, Japan) 에 0.5, 2.5 mg의시료를흡수^, 건조시켰다^. 배양된각균주 를 ¹⁰⁰ μ^l씩 평판배지에도말한 후^, 시료를 흡수한 ^paper disc를도말한평판배지위에 밀착시켜배양하였다^. 그후 disc의 clear zone을측정하여항균활성을비교하였다^.

최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정: Paper disc 실험에서낮은농도^{(0.5 mg)}에서도 항균활성을보인분획및균주에대해더자세한활성을측 정하기위해최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 확인하였다^. 실험은 Castillo et al. [1]이 사용한 agar-dilution method을참고하여진행하였다^. 각각의균주 는 ¹×^{107 CFU/ml}로조절한후사용하였다^. 대조군으로화

장품에사용되는대표적방부제인 methyl paraben을사용

해비교하였다^. 각농도의샘플 ^{1 ml}를함유한배지 ^{10 ml} 를 petri dish에주입하였고^, 균을 ¹⁰⁰ μ^l씩도말한후배양 하였다^. 육안으로관찰하였을때^, 각각의균들이증식되지않 는농도를 ^MIC로결정하였다^.

삼지구엽초 추출물의 항산화 효과 측정

DPPH법을 이용한 Free Radical 소거 활성: ^DPPH 실 험법은라디칼의소거능력을확인할수있는대표적인실

험으로^, 비교적안정한라디칼인 ^DPPH에대한전자공여효

과(electron donating ability)를통하여환원력을측정한다^.

실험은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 1 ml, 에탄올

1 ml, 여러농도의추출물 ^{1 ml}을 ^vortexing한다음실온에

서 ^{10 min} 동안반응시켰다^. 동일한시간동안반응을시킨

후, spectrophotometer로 ^{517 nm}에서 ^DPPH의 흡광도를 측정하였다^. 아래의식을이용하여 ^DPPH 소거활성을계산

하였으며 대조군^(control)은 시료를 넣지 않았고^, 공시험

(blank)은 ^DPPH를넣지않고시료의영향을보정해주었다^. 데

이터는 ^DPPH의농도가 ^50% 감소되는데필요한시료의농

도(free radical scavenging activity concentration, FSC₅₀, μ^g/ml)로표기하였다^.

Luminol 발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H2O2계에 있어 서 활성산소 소거 활성(총항산화능):실험에서활성산소종

에의해 ^luminol이나타내는빛을화학발광기로검출하여측

정하였다^. 증류수 ^{1.78 ml}에시료를 농도별로첨가한 후^,

2.5 mM EDTA 40 μl, 5 mM FeCl₃·^6H2O 10 μ^{l, 35 mM} luminol 80 μ^l를넣고 hand-mixing하였다^{. 5 min} 동안항온 시킨후 ^Fenton 반응을일으키기위해서 ^{150 mM H}2O₂ 40

μ^l를넣고 ^{25 min} 동안화학적발광정도를측정하였다^. 대

조군^(control)으로추출물대신에증류수를넣었고^, 공시험

(blank)은 ^H2O₂와 ^FeCl3·^6H2O 대신증류수를첨가하여측 정하였다^. 소거활성은다음식을이용해계산하였고^, 데이 터에는각종활성산소소거활성에의한화학발광의세기가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity concentration, OSC₅₀, μ^g/ml) 로서표기하였다^.

Photohemolysis법을 이용한 세포 보호 효과 측정 적혈구 현탁액 제조: 적혈구는건강한성인남녀로부터 채혈하였고^, 즉시 ^heparin이첨가된시험관에넣었다^{. 3,000}

rpm으로 ^{5 min} 동안원심분리하여적혈구와혈장을분리

하였고^, 분리한 혈구는 0.9% saline phosphate buffered saline (pH 7.4, Na₂HPO₄·^12H2O 9.6 mM, NaH₂PO₄· 2H₂O1.6 mM)으로 ³회반복하여세척^, 분리하였다^. 분리한 적혈구는 ^4oC의냉장고에보관하면서사용하였고^, 모든실

험은채혈후 ^{12 h} 이내에행하였다^. 실험에사용된적혈구

현탁액은 ^{700 nm}에서 ^O.D.가 ^0.6이었으며이때적혈구수 는약 ^1.5×^{107 cells/ml}이다^.

삼지구엽초 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구현탁 액 ^{3.5 ml}에 추출물을 농도별로 각각 ⁵⁰ μ^l씩 첨가한 후 30 min 동안 pre-incubation 시켰다^. 그후광증감제로사용 된 ¹² μM rose-bengal 0.5 ml를가하고 ^{15 min} 동안광조

사하여광증감반응을일으켰다^{. 15 min}의광조사가끝난후

암반응시간에따른적혈구의용혈정도를 ^{15 min} 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)를 측정하였다^. 이

700 nm의파장에서적혈구현탁액의투광도증가는적혈구

의용혈정도에비례한다^. 모든실험은 ^20oC 항온을유지하 며진행하였다^. 데이터는적혈구의 ^50%가용혈되는데걸리 는시간인 τ50으로나타내었다^.

대조군^(control)은τ50이 ^{31 min}으로오차범위 ±^{1 min} 이 내로모든 경우의실험에서재현성이양호하게나타났다^. Rose-bengal을첨가하고광조사를하지않았을경우와 ^rose-

bengal을첨가하지않고광조사만했을경우는모두암반응

120 min까지는용혈이거의일어나지않았다^. 모든실험은

3회반복하여평균하였다^.

결 과

삼지구엽초 추출물의 수득률

50% 에탄올용액 ^{4 L}에 ^{100 g}의건조한삼지구엽초를잘

게잘라 ^{24 h}동안침적시킨후여과감압하여 ^50% 에탄올

Inhibition %( ) 1 − A( ^Experiment− BBlank) Acontrol

--- 100×

=

inhibition %( ) Control의 cpm − Sample의 cpm( ) Control의 cpm − Blank의 cpm

( )

--- 100×

=

추출물분말을얻었다^{. 50%} 에탄올추출물의수득률은 ^4.11%

이었다^. 에틸아세테이트분획은 ^50% 에탄올로추출물에서 n-헥산으로비극성물질을제거한뒤에틸아세테이트분획 을추출하여감압농축하였고수득률이 ^1.71%로확인되었다^. 에틸아세테이트분획분말 ^{0.2 g}을이용해산가수분해시켜 당을제거한아글리콘분획을얻었다^. 에틸아세테이트분획

으로부터얻어진아글리콘분획의수득률은 ^13.40%였다^. 이

렇게얻어진 ^50% 에탄올추출물^, 에틸아세테이트분획^, 아

글리콘분획을이용해실험을진행하였다^. 피부상재균의 항균활성

Disc diffusion assay에 의한 항균활성: ²종의 ^Gram (+) 세균(S. aureus, B. subtilis), 2종의 ^{Gram (}−⁾ 세균^(E.

coli, P. aeruginosa), 2종의 대표적인피부상재균^{(P. ovale,} P. acnes), 총 ⁶종의세균에대하여삼지구엽초추출물의 ^disc 확산실험결과를 ^{Table 2}에나타내었다^. 삼지구엽초의 ^50%

에탄올추출물과에틸아세테이트분획모두 ^{Gram (+)} 균^(S.

aureus, B. subtilis)에서비교군으로사용한 methyl paraben 보 다높은항균활성을나타내었다^. 반면에삼지구엽초의두분 획모두 ^{Gram (}−⁾ 균(E. coli, P. aeruginosa)에대해서는항 균활성이없는것으로나타났다^. 피부상재균에대해서는두 분획모두비듬균인 ^{P. ovale}에대한항균활성이없고^, 여드

름균인 ^{P. acnes}에대해서는항균활성이있는것으로나타

났다^. 이 중 에틸아세테이트 분획은 ^{P. acnes}에 대해서

methyl paraben보다더높은항균활성을나타낸것으로보

아여드름개선용화장품원료로서응용가능성이있음을확 인하였다^. 또한 ^{P. acnes}는 ^{Gram (+)} 균이기때문에삼지구

엽초추출물은 ^{Gram (+)} 균에대해선택적항균효과를나타

내는것으로예측된다^.

최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정: Disc diffusion assay에서실험한농도중낮은농도였

던 0.5 mg/disc에서도우수한항균효과를나타낸삼지구엽

초분획^-균에대해서추가적으로 ^MIC 실험을진행하였다^.

실험을진행한삼지구엽초분획^-균조건은 ^50% 에탄올추출 물-S. aureus, 에틸아세테이트분획-S. aureus, 에틸아세테 이트분획-B. subtilis, 에틸아세테이트분획-P. acnes, 총 ⁴가 지에 조건이다^. 각각의 ^MIC는 ^{Table 3}에나타내었다^{. S.}

aureus, B. subtilis, P. acnes 세가지균에대한에틸아세테 이트 분획의 ^MIC 값은 각각 ⁶²⁵ μ^{g/ml, 625} μ^{g/ml, 1250} μ^g/ml으로모두비교군으로사용한 methyl paraben보다높 은항균활성을보여주었다^{. 50%} 에탄올추출물의 S. aureus 에대한 ^MIC는 ¹²⁵⁰ μ^g/ml으로 methyl paraben과같은최 소저해농도를나타내었다^.

삼지구엽초 추출물의 항산화 활성

DPPH법을 이용한 Free Radical 소거 활성:피부에자 외선이노출되었을때생성되는 ^ROS에는·^{OH, ROO}·와같 은라디칼종이포함되어있다^. 이러한라디칼종은짝을짓 지않은홀전자를가지고있기때문에매우큰반응성을나 타낸다^. 라디칼의불안정성은피부탄력을유지시켜주는주 요조직인콜라겐^, 엘라스틴섬유를산화시켜손상을가하게 되고물리적인탄력구조를유지하지못하게한다^. 이러한 결과로피부의노화가가속되기때문에^, 라디칼소거능은피 부손상을막는중요한요인이다^. 라디칼종외에도^{, 1O}2과 같은 ^ROS는세포를공격해세포막에서지질라디칼을형성 시킨다^. 이렇게형성된지질라디칼은지질과산화연쇄반응

Table 2. Antibacterial activities of E. koreanum Nakai fractions against bacteria.

Bacterial strains

Size of clear zone (diameter, mm)

Control conc. (mg/disc) Fraction conc. (mg/disc)

DMSO Methly paraben Extract Ethyl acetate

0.5 2.5 0.5 2.5 0.5 2.5

S. aureus - - 12 10 16 15 19

B. subtilis - - 11 - 12 10 13

E. coli - 10 18 - - - -

P. aeruginosa - 10 18 - - - -

P. ovale - 18 24 - - - -

P. acnes - - 14 - 13 11 18

Table 3. Minimum inhibitory concentration (MIC, μg/ml) of E.

koreanum Nakai against various bacteria.

Strain

MIC (mg/ml)

Control Fraction

DMSO Methly

paraben Extract Ethyl acetate

S. aureus - 1250 1250 625

B. subtilis - 2500 625

P. acnes - 2500 1250

을개시시켜결과적으로세포를손상시킨다^. 이러한손상을

막기위해생체내에서는 ^(+)-α^-토코페롤등의항산화제가

라디칼에수소주개로작용하여연쇄반응을종결시킨다^. 이 와같이라디칼소거능력을알아보기위해삼지구엽초추

출물을 ^DPPH와반응시켜보았다^. 이때비교물질로는 ^(+)-

α^-토코페롤을사용하였다^.

3가지분획의삼지구엽초추출물과 ^(+)-α^-토코페롤의 ^free radical 소거활성^(FSC50)을 ^{Fig. 1}에나타내었다^{. 50%} 에탄 올추출물의 ^FSC50은 ^75.25±^3.75 μ^g/ml, 에틸아세테이트 분획은 ^49.40±^1.80 μ^g/ml, 아글리콘분획은 ^44.95±^0.45 μ^g/ml로확인되었다^. 반면에세포막을보호하는강력한지 용성항산화제인 ^(+)-α^-토코페롤의 ^FSC50은 ^8.98±^2.93 μ^g/

ml으로삼지구엽초추출물에비해상당히높은라디칼소거 능력이있는것으로확인하였다^. 따라서삼지구엽초의 ^50%

에탄올추출물^, 에틸아세테이트분획^, 아글리콘분획모두라

디칼소거능력은있지만 ^(+)-α^-토코페롤보다는활성이떨어

지는것으로확인되었다^.

Luminol 발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H2O2계에 있어 서 활성산소 소거 활성(총항산화능): 피부가자외선에노 출되면체내에서는다양한 ^ROS들이생성되기때문에여러

ROS에대한총체적인소거활성을확인하는것은중요한의

의를갖는다^. 이번실험에서는다양한 ^ROS를생성시키기위 해서 ^Fenton 반응을이용하였다^{. Fe3+-EDTA/H}2O₂계를이 용하면 ^Fenton 반응에 의해 각종 ^{ROS (O}2·⁻ ·^OH 그리고 H₂O₂)가생성되는조건을만들수있다^. 이렇게생성된 ^ROS 는 ^luminol을산화시키고형광을일으킨다^. 따라서 ^luminol 의화학발광정도를측정함으로써삼지구엽초추출물의 ^ROS 소거능력을확인할수있다^. 또한 ^Fenton 반응을촉진시키

기위해서 ^EDTA를사용하기때문에킬레이트작용도총항

산화능에영향을미치게된다^. 이러한요소는생체내에서

일어나는 ^Fenton 반응과유사하기때문에좀더유용한항

산화능력을측정할수있게된다^. 비교물질로는체내의강 력한항산화제로알려진 L-ascorbic acid를사용하였다^.

삼지구엽초추출물의 ^ROS 소거활성⁽총항산화능^{, OSC}50) 은 ^{Fig. 2}에 나타내었다^{. 50%} 에탄올 추출물의 ^OSC50은 2.46±^0.06 μ^g/ml, 에틸아세테이트분획은 ^3.11±^0.12 μ^g/

ml, 아글리콘 분획은 ^1.45±^0.02 μ^g/ml로 나타났다^{. L-} Ascorbic acid의 ^OSC50은 ^1.50±^0.85 μ^g/ml으로확인하였다^.

따라서총항산화능력은아글리콘분획 ^{> 50%} 에탄올추

출물 ^> 에틸아세테이트분획순서로나타났다^. 에틸아세테

이트분획은 L-ascorbic acid보다낮은총항산화활성을나 타냈으나^{, 50%} 에탄올추출물과아글리콘분획은 L-ascorbic

acid의총항산화능력과유사한것으로보아상당한 ^ROS

소거능력이있음을확인하였다^.

1O₂으로 유도된 사람 적혈구의 파괴에 대한 세포 보호 효과

Photohemolysis법을이용한실험은사람의적혈구를이용

하기때문에좀더실질적인효능을확인할수있다^. 광증감 제에빛을조사하면^1O2이주로생성되고부가적으로다양 한 ^ROS가생성된다^. 이러한 ^ROS들은세포를손상시키고파 괴시키는데^, 세포가용혈되는데걸리는시간을측정함으로 써삼지구엽초추출물의세포보호효과를측정할수있다^. 체내에는다양한광증감제들이존재하는데^, 이로인해발생

하는광증감반응은자외선이유도하는일반적인 ^ROS 생성

에비해더쉽고빠르게 ^ROS를생성한다^. 따라서삼지구엽 초추출물의세포보호효과를측정하는것은항산화제로써 의응용가능성을판단하는데유용한척도가될수있을것 이다^.

광증감제인 rose-bengal을함유한적혈구현탁액에 ^{15 min} 광조사하여^1O2으로유도된적혈구의용혈에걸리는시간 을측정하였다^. 시료를넣지않은대조군의경우적혈구세 Fig. 1. Free radical scavenging activities of extracts of E.

koreanum Nakai and (+)-α-Tocopherol.

Fig. 2. ROS scavenging activities of E. koreanum Nakai extracts and L-Ascorbic acid by luminol-dependent chemilu- minescence assay.

포가 ^50% 파괴되는데걸리는시간⁽τ50)은약 ³¹±^{1 min}으로 나타났다^. 시료의세포보호효과가클수록τ50은크게나타 난다^. 비교물질로는세포보호효과가있다고알려져있는 지용성항산화제인 ^(+)-α^-토코페롤을사용하였다^. 삼지구엽

초 ^50% 에탄올추출물^, 에틸아세테이트분획^, 아글리콘분

획은 ⁵ μ^{g/ml, 10} μ^{g/ml, 25} μ^{g/ml, 50} μ^g/ml의농도범위에 서농도의존적인τ50값을보여주었다⁽자료미제시^{). 10} μ^g/

ml 농도를기준으로하여삼지구엽초의세가지분획과 ^(+)- α^-토코페롤의τ50값을비교하였다^{(Fig. 3).}

삼지구엽초 추출물 중 에틸아세테이트 분획의 τ50은

31.6±^{0.5 min}으로대조군과비교해유의할만한세포보호

효과를나타내지않았다^. 반면에 ^50% 에탄올추출물과아글

리콘분획은세포보호효과가있는것으로확인되었다^{. 50%}

에탄올추출물의τ50은 ^37.0±^{0.3 min}으로비교물질로사용 한 ^(+)-α^-토코페롤과⁽τ50 = 38.0±^{1.8 min)} 비슷한활성을나 타냈다^. 아글리콘분획의τ50은 ^165.9±^{7.2 min}으로다른분

획및 ^(+)-α^-토코페롤과비교하였을때월등한세포보호효

과를확인하였다^. 일반적으로당이제거된아글리콘분획의 성분들이당이포함된에틸아세테이트및 ^50% 에탄올추출 물성분에비해비극성을띄기때문에^, 비극성인세포와좀 더상호작용이원활할것으로예상된다^. 따라서아글리콘분 획이월등한세포보호효과를나타낸것은이러한비극성 에의한결과일것으로추측해볼수있다^.

고 찰

이번연구에서우리는삼지구엽초추출물의항균효과및 항산화활성을측정함으로써화장품원료로서의응용가능성 을확인해보았다^. 삼지구엽초의 ^50% 에탄올추출물^, 에틸아 세테이트분획^, 아글리콘분획^, 총세가지로분획조건을다

양화해서실험을진행하였다^.

우선적으로삼지구엽초추출물이항균활성을갖는지여 부를 알아내기 위해 S. aureus, B. subtilis, E. coli, P.

aeruginosa, P. ovale, P. acnes, 총 ⁶가지피부상재균에대해 disc diffusion assay를진행하였다^. 에틸아세테이트분획이 세가지 ^{Gram (+)}균(S. aureus, B. subtilis, P. acnes), 50%

에탄올추출물이 ^{S. aureus}에대하여높은항균효과를갖

는것을확인하였다^. 특히에틸아세테이트분획이여드름균 (P. acnes)과아토피를일으키는포도상구균(S. aureus)에대 해높은항균효과를나타내었는데이를통해삼지구엽초 가천연방부제뿐만아니라여드름^, 아토피개선용화장품 소재로써응용될수있을것이라예상된다^.

다음으로는피부에서발생하는다양한 ^ROS에대한항산

화효과를측정해보았다^. 비교적안정한라디칼인 ^DPPH을

이용하여라디칼소거활성을살펴보았다^. 아글리콘분획의 라디칼소거활성은비교물질로사용된 (+)-α-토코페롤보다 는낮지만실험에사용된세분획중가장높은효과를보여 주었다^. 에탄올^, 에틸아세테이트^{, n-}부탄올^, 물등을이용한 다양한용매분획에따른삼지구엽초의 ^DPPH 소거활성을 연구한 Zhang et al. [23]에따르면 ^n-부탄올분획이가장우 수한활성을나타내었는데^, 추후연구에서 ^n-부탄올분획과 본연구에서사용된아글리콘분획을이용^, 동일한조건에서

DPPH 소거활성을비교평가하여가장우수한활성을나타

내는분획을탐색하는것또한의의가있을것으로여겨진 다^. 또한 ^Fe3+-EDTA/H2O₂계에서발생하는 ^Fenton 반응을 이용하여다양한 ^ROS에대한총항산화능평가에대해서아 글리콘분획은비교물질인 L-ascorhbic acid과유사한높은 활성을보여주었다^. 마지막으로광증감반응이생성하는^1O2

으로유도된적혈구의용혈로부터세포보호효과를확인해 보았다^. 세분획중아글리콘분획은비교물질로사용한 ^(+)- α^-토코페롤보다약 ⁴배더우수한세포보호효과를보여주 었다^. 자외선조사로생성된^1O2은반응성이매우큰 ^ROS 로서생체막을통과하여자동산화반응을개시시킨다^. 때문 에이실험법을통한활성산소에의한세포보호효과측정 은자외선에의한피부노화를방어할수있는물질을탐색 하는데유용하다고여겨진다^[24]. 결과적으로삼지구엽초추 출물중아글리콘분획은다양한 ^ROS에대해높은소거활 성을보여주었고^, 반응성이매우큰^1O2으로부터세포를효 과적으로보호하였기때문에유용한항산화제로서화장품에 응용할수있을것으로보인다^.

종합해보면삼지구엽초추출물의에틸아세테이트분획은

Gram (+)균에대해높은항균효과를나타내었기때문에방

부제로서작용할수있을것이라예상된다^. 특히여드름균에 대한항균활성으로보아여드름개선용화장품에응용할수 있는가능성이있다^. 항산화활성에서는아글리콘분획이높 Fig. 3. Cell protective effects of extracts from E. koreanum

Nakai and (+)-α-Tocopherol at 10 μg/ml on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes.