백서 골 연장술시 근육 재생에 미치는 성장호르몬의 효과

(1)

서 론

Ilizarov¹²⁾가 개발한 신연 골형성술(distraction osteogenesis)은 장골(long bone)의 골막하 절골술 후 하루 1 mm (0.5-1.5 mm)

를 4번 이상에 나누어 점진적으로 늘려 신연 간격에 골이식 없 이 자생적으로 신생골이 생기도록 도모하는 방법이다. 현재 이 수술법은 하지 부동으로 인한 파행(limping) 시의 하지 연장술 뿐 아니라 왜소증 환자, 상지, 수족지, 악안면부, 선천성 하지

662

목 적 :골 연장술시 성장호르몬의 투여가 신연된 근육에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법 : 백서(n=60)의 경골에 30%의 골연장술을 시행하고 이 중 30마리에는 수술부터 희생 시점까지 재조합 인형 성장호르몬을 100 g/kg/day 씩 투여하였고 나머지에는 생리식염수를 투여하였다. 골연장에 도달한 시점(수술 후 평균 34일)과 근육 기능 회복을 위한 안정 기간이 경과한 시점(수술 후 평균 61일)에 전경골근에 대해 조직병리학, 면역조직화학 및 전기생리학적 검사를 시행하고 성장호르몬 투여 및 골 연장군(GL군)과 대조군들-성장호르 몬 투여 및 골 연장 비시행군(GN군), 생리식염수 투여 및 골 연장군(CL군), 생리식염수 투여 및 골 연장 비시행군(CN군)-의 결과를 비교하였다.

결 과 : CL군은 GL 및 다른 비연장군에 비해 조직 손상이 현저하였으며 이러한 결과는 vimentin염색 소견과도 부합되었다. proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 및 desmin 면역 염색 결과 GL군은 CL군에 비해 수술 후 34일에 유의하게 높은 염색 양성 소견을 보였다. GL군은 CL군에 비해 최대 강축 력 및 단연축력이 유의하게 높았다.

결 론 :성장호르몬은 근 섬유화를 감소시키고 재생을 증가시킴으로써 골 연장을 보다 안전하게 이루는데에 도움이 된다고 생각된다.

색인 단어 : 성장호르몬, 골 연장술, 근섬유

Effect of Growth Hormone on Muscle Regeneration During rat’ s Tibial Lengthening

Sang Eun Park, M.D., In Ho Choi, M.D., Chin Youb Chung, M.D., Tae-Joon Cho, M.D., Won Joon Yoo, M.D., Chong Jai Kim, M.D.*, and Kuhn Sung Whang, M.D.**

Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University College of Medicine; *Department of Pathology, Seoul National University College of Medicine; **Department of Orthopaedic Surgery, Hanyang University College of Medicine, Seoul, Korea

Purpose :The purpose of this study was to investigate the effects of growth hormone (GH) on muscle during limb lengthening.

Materials and Methods :Sixty rats underwent tibial lengthening of approximately 30% using a protocol consisting of a latency period of 4 days, a distraction period of 30 days with a rate of 0.25 mm twice per day, and a consolidation period of 27 days. Recombinant GH was administered to 30 of the rats (100 g/kg/day) and the same dose of normal saline to the remaining 30 rats, during the period from operation to sacrifice. Histopathologic, immunohistochemical, and electrophysiologic studies were performed on the tibialis anterior to compare the muscle responses of GH treated lengthened limbs (GL), GH treated non-lengthened limbs (GN), saline treated lengthened limbs (CL), and saline treated non-lengthened limbs (CN) at postoperative days 34 and 61.

Results : Histologic injury scores were worst in the CL, in which vimentin expression was also greatest. Cell proliferation, determined by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) staining, was greatest in the GL, in which desmin expression was also greatest. Electrophysiologi- cal methods showed better muscle function was retained in the GL than the CL.

Conclusion :These results suggest that GH can reduce muscle damage during limb lengthening by enhancing myogenesis and decreasing fibrogenesis.

Key Words : Growth hormone, Bone lengthening, Muscle

662

백서 골 연장술시 근육 재생에 미치는 성장호르몬의 효과

박상은∙최인호∙정진엽∙조태준∙유원준∙김종재*∙황건성**

서울대학교 의과대학 정형외과학교실, 병리학교실*, 한양대학교 의과대학 정형외과학교실**

662 662 통신저자 : 최 인 호

서울시 종로구 연건동 28

서울대학교병원 어린이병원 정형외과 TEL: 02-760-3640∙FAX: 02-764-2718 E-mail: inhoc@snu.ac.kr

*본 논문은 서울대학교병원 일반연구비(04-99-027)의 지원을 받아 이루어졌음.

Address reprint requests to In Ho Choi, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, Seoul National University Children’s Hospital 28 Yongon-dong, Chongno-gu, Seoul 100-744, Korea

Tel : +82.2-760-3640, Fax : +82.2-764-2718 E-mail: inhoc@snu.ac.kr

(2)

결손 및 골 결손의 치료에도 널리 응용되고 있다^4,16).

그러나 골 연장의 정도가 어느 일정한 한도를 넘는 경우, 신 생 골조직은 신연에 따라 신연 간격 내에 비교적 용이하게 형성 되는 반면 주변의 연부 조직, 특히 근육의 신연은 충분히 이루 어지지 않아 인접 관절의 구축이나 아탈구, 퇴행성 변화 등이 초래될 수 있다. 골 연장이 25%인 경우에는 근육의 생리적 활 성도가 소실되어 영구적인 대사 손상(metabolic damage)이 일 어나며¹³⁾, 30%인 경우에는 근육의 조직병리학적, 생리학적 기 능이 소실되는 소견이 관찰되었다¹⁵⁾. 이와 같이 골에 대한 근육 의 제한적인 신연 적응력은 신연 골형성술의 중요한 한계 요인 의 하나로 생각되고 있다¹⁹⁾.

본 연구의 목적은 근육 손상이 필연적으로 뒤따를 정도로 큰 골 연장이 필요할 때 과연 성장 호르몬의 투여가 근육 손상을 최소화하거나 방지할 수 있는지를 검증하는 것이다. 즉, 안전한 골 신연의 범위를 더욱 넓히는 데 성장 호르몬이 도움이 되는 지 그 유용성을 규명하고자 하는 것이다. 본 실험에서는 골 연 장술 시 근 손상이 뒤따른다고 알려져 있는 30% 골 연장 백서 모델에서 재조합 성장 호르몬(recombinant growth hormone) 을 투여할 때의 근육의 반응을 조직병리학적(histopathologic), 면역조직화학적(immunohistochemical) 및 전기생리학적(electrophysiologic) 방법으로 분석하였다.

연구 대상 및 방법

1.

신연골형성술 및 성장호르몬 투여 모델

수컷 성숙 Sprague Dawley 백서(n=60, 체중 254±12.4 g)를 이용하였다. 좌측 경골에 1 mm 직경의 K-강선(Kirschner wire) 네 개를 삽입하고 외고정기를 좌우에 장착하였다. 하퇴 경골 골 간단-간부 경계의 전면에 경골능을 따라 5 mm의 피부 종 절개 를 가하여 근육과 골막을 박리하고 골막하로 경골에 도달한 다음 노출된 경골의 중간 부위에 1.2 mm 직경의 K-강선으로 여러 번 골에 구멍을 낸 뒤 손으로 절골(drill osteotomy and manual osteoclasis)하였다. 실험 전반에 걸쳐 가급적 주변 근육에 손상이 가지 않도록 세심한 주의를 기울였다. 5일 간의 휴지기 후 하루 에 두 번 0.25 mm씩 늘렸다. 수술 후 매일 족관절의 수동적 운동 을 3회 이상 실시하여 족저 굴곡 구축을 최소화하고자 하였다.

수술 후 2주일 간격으로 방사선 촬영을 시행하여 목표 골 연장인

30% 골 연장이 이루어질 때까지 연장을 계속하였다. 경골의 길 이는 방사선 사진 상 근위 경골의 외과로부터 원위 경골 관절면 의 외측 부위까지의 길이로 정하였다. 30마리에는 Raschke 등¹⁷⁾ 의 방법에 따라 재조합 인형 성장호르몬(Eutropin, LG Chemi- cal, Seoul, Korea)을 연장 기간 동안 체중 당 100 g의 용량 으로 매일 1회, 피하로 주사하였고, 나머지 30마리에는 동량의 생리식염수를 같은 방법으로 주사하였다.

동물들은 다음과 같이 실험군을 나누었다.

CL군: 성장호르몬 투여를 받지 않은 좌측 경골 연장 대조군 CN군: 성장호르몬 투여를 받지 않은 우측 경골 비 연장 대조군 GL군: 성장호르몬 투여를 받은 좌측 경골 연장 실험군 GN군: 성장호르몬 투여를 받은 우측 경골 비 연장 대조군 30% 연장 목표치에 도달한 시점(수술 후 평균 34일)에 성장 호르몬을 투여한 동물(GL 및 GN)과 생리식염수를 투여한 동 물(CL 및 CN) 각각 15마리를 희생시켜 네 군에 각각 15개의 전경골근이 할당되도록 하였다. 이 중 10개의 전경골근에 대해 서는 조직병리 검사 및 면역조직화학 염색을 시행하였고 5개의 전경골근에 대해서는 전기생리학적 검사를 시행하였다. 근육의 근위부, 중간부, 원위부에 각각의 검사를 시행하였으며 근육 기 능의 회복을 위한 안정 기간(28일)이 경과한 시점(수술 후 평균 61일)에서 다시 같은 실험을 반복하였다.

2.

조직병리학적 검사

hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 시행하고, 조직병리 학적 변화의 정량적인 분석에 있어서 중요한 요소이며 판별이 용이한 다섯 가지 항목에 대해 각각 0점에서 3점까지의 점수로 판정한 후 그 점수들의 평균을 조직 손상 점수(histologic injury score)로 정하여 각 군을 비교하였다(Table 1). 근세포의 변성 은 Lee 등¹⁵⁾의 방법에 따라 근섬유의 횡문이 소실되고 균일하 게 초자화된 호산성의 세포질을 가지는 경우를 기준으로 하고 근세포의 재생은 근섬유가 큰 핵인과 호염기성의 세포질을 가지 는 소견을 기준으로 하였다.

*When the size of muscle fiber is less than 2/3 the size of the normal contralateral side, it is defined as “atrophied”.

Parameters Score

Atrophied* muscle fibers (200×) 0: Normal 1: Less than 20%

2: 20-40%

3: More than 40%

Internalization of the nuclei (400×) 0: Normal 1: 4-5 in 10 fields 2: Between score 1 and 3 3: More than 5 in 1 field Degeneration of muscle fibers (400×) 0: Normal

1: 1-2 in 10 fields 2: Between score 1 and 3 3: More than 10 in 10 fields Regeneration of muscle fibers (400×) 0: Normal

1: 1-2 in 10 fields 2: Between score 1 and 3 3: More than 10 in 10 fields Endomysial/Perimysial fibrosis (400×) 0: Normal

1: Mild focal fibrosis 2: Between score 1 and 3 3: Severe multifocal fibrosis Table 1.Scoring system for assessing histologic injury

(3)

3.

면역조직화학 염색

PCNA, desmin, vimentin에 대한 면역조직화학 염색은 기존 에 기술된 방법들^14,20)을 따랐다. 약술하면 염색을 위해 포르말 린 고정 후 파라핀에 포매된 조직을 5 m 두께로 잘라 silanized slide (DAKO, Carpinteria, USA)에 부착시키고 4단계의 xylene 용액으로 처리하여 탈파라핀화하고 에탄올 용액으로 순차적으로 처리하여 재수화(rehydration)하였다. 조직의 염색 예민도를 높 이기 위해서 항원 복원 방법(antigen retrieval technique)을 이 용하였다²⁰⁾. 1:100으로 희석된 항-PCNA 일차 항체(anti- PCNA primary antibody; Zymed, South San Francisco, CA, USA)를 조직 절편에 점적하여 반응시켰다. 이차 항체와의 반 응을 위해 1:100으로 희석된 streptavidin (Zymed, South San

Francisco, CA, USA)으로 실온에서 30분간 처리하였다. 발색 제는 DAB kit (Zymed, South San Francisco, CA, USA)를 사용하였고 대조 염색은 Harris’hematoxylin (Zymed, South San Francisco, CA, USA)을 사용하였다.

Desmin 염색에는 1:40으로 희석된 가토 항-desmin 항체 (rabbit anti-desmin antibody; Neomarkers, Fremont, CA, USA)를, 그리고 vimentin 염색에는 1:200으로 희석된 항- vimentin 항체(anti-vimentin antibody; Neomarkers, Fre- mont, CA, USA)를 각각 사용하였다¹⁴⁾.

4.

전기생리학적 검사

네 군에서 각각 5개의 전경골근(tibialis anterior)을 신경과

Group p value^�

Parameter

CL (n=10) CN (n=10) GL (n=10) GN (n=10)

p value*

CL-CN CL-GL CL-GN CN-GL CN-GN GL-GN

A. Day 34

Sum of histopathologic score

P 8.6±2.2 0.3±0.8 5.1±1.1 0.1±0.4 <0.001 <0.001 0.0019 <0.001 <0.001 0.95 <0.001 M 9.9±2.6 0.1±0.4 5.5±2.1 0±0 <0.001 <0.001 0.0031 <0.001 <0.001 0.69 <0.001 D 9.2±2.4 0.1±0.4 4.2±1.6 0±0 <0.001 0.0025 <0.001 0.0025 <0.001 0.95 <0.001 PCNA stainging (%)

P 0.69±0.4 0.11±0.0 3.75±0.7 0.12±0.1 <0.001 0.0043 0.0035 0.0039 0.0079 0.55 0.0070 M 0.81±0.4 0.12±0.0 3.15±0.6 0.13±0.0 0.0011 0.0079 0.0068 0.0079 0.0059 0.69 0.0063 D 0.66±0.1 0.11±0.0 2.61±0.4 0.13±0.0 <0.001 0.0079 0.0059 0.0071 0.0071 0.22 0.0069 Desmin staining (%)

P 8.83±4.3 1.23±0.3 20.3±8.5 2.87±1.5 <0.001 0.0043 0.048 0.0040 0.0079 0.15 0.0079 M 6.42±2.6 1.16±0.4 21.4±5.5 3.42±0.7 <0.001 0.0043 0.0035 0.016 0.0070 0.15 0.0069 D 11.3±4.5 1.04±0.6 20.3±2.4 3.73±1.5 <0.001 0.0079 0.0070 0.016 0.0069 0.15 0.0079 Vimentin staining (%)

P 22.2±3.4 5.77±2.1 13.7±3.5 4.77±1.9 0.0014 0.0070 0.016 0.0079 0.016 0.55 0.0048 M 19.2±6.3 5.10±1.8 11.9±3.1 4.40±1.4 0.0024 0.0079 0.022 0.0070 0.016 0.69 0.0065 D 26.9±7.3 7.18±2.9 11.2±2.3 4.58±1.3 0.0011 0.0070 0.0079 0.0070 0.095 0.056 0.0079 B. Day 61

Sum of histopathologic score

P 9.4±2.7 0.2±0.4 4.2±2.7 0±0 <0.001 <0.001 <0.001 0.0010 <0.001 0.66 <0.001 M 9.6±2.6 0±0 3.7±2.3 0.1±0.3 <0.001 <0.001 0.0016 <0.001 <0.001 0.69 <0.001 D 9.0±2.4 0±0 5.0±1.9 0.1±0.4 <0.001 0.0061 0.0026 <0.001 0.0011 0.81 <0.001 PCNA staining (%)

P 0.90±0.3 0.13±0.0 0.99±0.3 0.14±0.1 0.0022 0.0079 0.98 0.0079 0.0075 0.31 0.0080 M 0.89±0.2 0.09±0.0 0.97±0.2 0.10±0.0 0.0023 0.0079 0.55 0.0080 0.0064 0.69 0.0079 D 0.97±0.3 0.08±0.0 0.91±0.3 0.10±0.0 0.0025 0.0075 0.98 0.0079 0.0079 0.69 0.0075 Desmin staining (%)

P 8.55±5.2 1.44±0.8 8.16±5.5 3.12±1.3 0.014 0.032 0.84 0.045 0.0075 0.095 0.095 M 7.89±2.1 1.23±0.2 12.0±8.0 2.50±1.8 0.0050 0.0079 0.69 0.0079 0.0079 0.69 0.056 D 4.66±1.9 1.77±1.9 4.95±3.5 2.97±1.2 0.12 0.056 0.84 0.045 0.095 0.31 0.42 Vimentin staining (%)

P 19.8±2.2 5.72±1.5 7.35±3.0 4.87±0.7 0.0058 0.0079 0.0079 0.0075 0.42 0.31 0.15 M 16.2±3.0 5.27±1.0 8.30±3.8 4.57±2.2 0.0065 0.0079 0.016 0.0079 0.31 0.55 0.095 D 16.6±2.9 4.03±1.6 8.14±3.9 4.59±2.0 0.0040 0.0075 0.016 0.0075 0.056 0.31 0.15

*Kruskal-Wallis test, ^�Mann-Whitney test. The values except for p value are expressed as average±standard deviation. CL, saline administered lengthened hindlimbs; CN, saline administered non-lengthened hindlimbs; GL, GH administered lengthened hindlimbs; GN, GH administered non-lengthened hindlimbs; P, proximal; M, middle; D, distal.

Table 2.Results of histopathologic analysis, PCNA, desmin, and vimentin staining

(4)

혈관이 유지된 상태로 조심스럽게 박리하였다. PowerLab/510 system (AD Instruments, New South Wales, Australia)과 force transducer model 1030 (UFI, CA, USA)을 설치한 뒤 전경골근의 원위단을 3-0 나일론사를 사용하여 장력 전달기에 연결하였다. 초기 장력은 20 mN을 유지한 뒤 Harvard 전기자 극기(Sam Chung Commercial, Seoul, Korea)에서 10 Hz, 5 ms 기간, 100 mV의 전기 자극으로 강축(tetanus)을 유발한 뒤 최대 강축력(maximum tetanic force)을 측정하였고 1 Hz, 100 mV로 비골 신경을 자극하여 단연축력(single twitch force), 극연축력까지 걸리는 시간(time to peak twitch tension) 및 극연축력에서 1/2의 연축력으로 떨어지는 시간(twitch one-half relaxation time)을 측정하였다.

5.

염색 표본의 분석

PCNA, desmin과 vimentin 염색에 대한 정량 분석은 CCD 비디오 카메라(TK-C1380, JVC, Tokyo, Japan)가 부착된 광 학 현미경을 갖춘 영상 분석 컴퓨터에서 시행하였으며 분석 소 프트웨어는 Image-Pro^� plus (version 3.0, Media Cybernet- ics, Silver spring, Maryland, USA)를 이용하였다. 각각의 근 육에서 다섯 곳의 340×340 m 면적을 무작위로 선정하여 분 석에 이용하였다.

6.

통계 처리

네 군의 비교에는 비모수적 방법으로 연속 변수일때 사용하는 Kruskal-Wallis 검정을 사용하였고 각 군끼리의 비교에는 Mann-

Whitney 검정을 이용하였다. SPSS statistical package (version 10.0, SPSS Institute, Chicago, USA)를 이용하여 분석하 였다. 신뢰 구간은 95%로 하였으며 p<0.05일 때 의미가 있는 것으로 판정하였다.

결 과

조직 손상 점수(histologic injury score), PCNA, desmin, 및 vimentin 염색에 대한 정량적 분석 결과를 Table 2에 정리 하였다. 조직병리학적 검사 결과 GL군은 CL군에 비해 근섬유 위축(p=0.0028, Mann-Whitney test), 핵의 내측 이동 (p=0.0015), 근섬유 변성(p=0.0013) 및 근내막/근주막 섬유 화(p=0.0002)에 있어 통계적으로 유의하게 낮은 조직 손상 점 수를 보였으나 근섬유 재생에 있어서는 유의한 차이가 없었다.

CL군은 GL 및 다른 비연장 군(CN, GN)에 비해 조직 손상 점 수가 유의하게 높았다. 근육의 부위(근위부, 중간부, 원위부)에 따른 차이는 없었으며 수술 후 34일과 61일 간에도 차이를 보이 지 않았다(Fig. 1).

PCNA 염색 결과, 수술 후 34일에는 PCNA 염색 양성 세포 들이 GL군에서 가장 많았으며, GL군과 CL군 간에는 통계적으 로 유의한 차이가 있었다. 신연군(CL 또는 GL군)들은 CN군 보다 유의하게 높은 PCNA 양성 소견을 보였다. 각 군에서 근 육 부위에 따른 차이는 없었다. 수술 후 61일에는 GL군과 CL 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았으나, 신연군(CL 또는 GL 군)들은 CN군에 비해 여전히 유의하게 높은 결과를 보였다 (Fig. 2). Desmin 염색 결과 PCNA 염색과 비슷한 결과를 보

Fig. 1.The sum of the scores of the five histopathologic parameters. Scores were greater in the saline treated, lengthened hindlimbs (CL) than the growth hormone treated, lengthened hindlimbs (GL). There was no statistical significance in the proximal (P), middle (M), and distal (D) regions. (Mann-Whitney test, 1:

p=0.0019, 2: p=0.0031, 3: p=0.00092, 4: p=0.00054, 5: p=0.0016, 6: p=0.0026 CL: saline administered, lengthened hindlimbs, CN:

saline administered, non-lengthened hindlimbs, GL: growth hormone administered, lengthened hindlimbs, GN: growth hormone administered, non-lengthened hindlimbs).

10 8 6 4 2 0

1 P

1 2

2 M D

10 8 6 4 2 0

P M D

3

4

4 5

5 6

CL CN GL GN CL CN GL GN

Day 34 Day 61

3 6

Fig. 2.PCNA immunohistochemistry. On day 34, PCNA positive cells were found more frequently in GL than any other group.

There was no significant difference in the scores of the proximal (P), middle (M), and distal (D) regions. On day 61, there was no significant difference in the proportion of PCNA positive cells in the groups. (Mann-Whitney test, 1: p=0.0035, 2: p=0.0068, 3:

p=0.0059 CL: saline administered, lengthened hindlimbs, CN:

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

P

1 (%) 1

(%) (%) (%)

2

2 M

D

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

P M D

Day 34 Day 61

3

(5)

였다(Fig. 3). Vimentin 염색 결과, CL군에서 가장 높은 염색 성이 관찰되었으며 CL군은 수술 후 34일과 61일 모두에서 GL 군보다 유의하게 높은 염색 소견을 보였다. Vimentin 염색에서 도 근육의 부위에 따른 차이를 보이지 않았다(Fig. 4, 5).

전기생리학적 검사 상 최대 강축력(maximum tetanic force)은 GN군에서 가장 높았으며 CN, GL, CL군의 순서였다.

최대 강축력 및 단연축력(single twitch force)은 수술 후 34일 과 61일 모두 GL군이 CL군보다 유의하게 높았다. 그러나, 극 연축력까지 걸리는 시간(time to peak twitch tension)과 극연

축력에서 1/2의 연축력으로 떨어지는 시간(twitch one-half relaxation time)의 차이는 없었다. 전경골근의 휴지기 길이 (resting length)는 신연 골형성 동안 증가하였다(Table 3).

고 찰

골 연장술에 따른 근육의 형태학적, 조직학적 및 생리학적 변 화에 대한 이전의 몇 가지 보고^10,13,15)처럼 이 연구 결과도 골 연 Fig. 3.Desmin immunohistochemistry. On day 34, desmin posi-

tive cells were found more frequently in GL than in any other group.

There was no significant difference in the scores of the proximal (P), middle (M), and distal (D) regions. On day 61, there was no significant difference in the proportion of desmin positive cells in the groups. (Mann-Whitney test, 1: p=0.048, 2: p=0.0035, 3:

p=0.0070 CL: saline administered, lengthened hindlimbs, CN:

25 20 15 10 5 0

P

1

1 2

M D

25 20 15 10 5 0

P M D 3

Day 34 Day 61

3

(%) (%)

2

Fig. 4.Vimentin immunohistochemistry. The proportion of vimentin positive cells, suggestive of degenerative fibrosis, was signifi- cantly higher in the CL than in any other group, including GL, GN, and CN on days 34 and 61. There was no significant difference in the scores of the proximal (P), middle (M), and distal (D) regions.

(Mann-Whitney test, 1: p=0.016, 2: p=0.0079, 3: p=0.0079, 4: p=

0.016, 5: p=0.016 CL: saline administered, lengthened hindlimbs, CN: saline administered, non-lengthened hindlimbs, GL: growth hormone administered, lengthened hindlimbs, GN: growth hormone administered, non-lengthened hindlimbs).

30 25 20 15 10 5 0

P 1

1 2

2 M D

30 25 20 15 10 5 0

P M D 4

4 3

3 5

Day 34 Day 61

5

(%) (%)

Group p value^�

Parameter

CL (n=5) CN (n=5) GL (n=5) GN (n=5)

p value*

CL-CN CL-GL CL-GN CN-GL CN-GN GL-GN

A. Day 34

MT (mN) 203±44.0 815±58.8 479±84.0 1323±631 0.0017 0.068 0.036 0.016 0.057 0.34 0.11 ST (mN) 92.6±75.0 483±35.6 171±26.2 439±156 0.0017 0.016 0.0079 0.016 0.014 0.32 0.068 TP (ms) 78.0±41.5 90.0±18.3 86.0±15.2 85.0±23.8 0.56 0.065 0.31 0.56 0.73 0.89 0.98 TR (ms) 38.0±18.9 50.0±8.2 32.0±4.5 41.3±11.8 0.17 0.066 0.84 0.56 0.016 0.34 0.27 RL (cm) 4.62±0.14 3.61±0.07 4.53±0.24 3.68±0.29 0.0052 0.016 0.69 0.016 0.016 0.69 0.016 B. Day 61

MT (mN) 245±25.6 974±218 698±275 1159±252 0.0044 0.0077 0.016 0.015 0.095 0.22 0.0051 ST (mN) 91.8±11.9 406±98.6 167±55.5 464±149 0.0019 0.012 0.016 0.015 0.0079 0.84 0.0051 TP (ms) 93.8±12.5 110±28.5 90.0±22.4 100±25.0 0.61 0.011 0.98 0.73 0.31 0.69 0.0049 TR (ms) 87.5±25.0 60.0±13.7 83.0±44.1 65.0±13.7 0.36 0.011 0.73 0.19 0.55 0.69 0.0049 RL (cm) 4.53±0.15 3.49±0.11 4.57±0.25 3.56±0.17 0.0034 0.016 0.56 0.016 0.0079 0.69 0.0079

*Kruskal-Wallis test, ^�Mann-Whitney test.

The values except for p value are expressed as average±standard deviation.

CL, saline administered lengthened hindlimbs; CN, saline administered non-lengthened hindlimbs; GL, GH administered lengthened hindlimbs; GN, GH administered non-lengthened hindlimbs; MT, maximum tetanic force; ST, single twitch force; TP, time to peak twitch tension: TR, twitch one-half relaxation time; RL, resting length.

Table 3.Results of histopathologic analysis, PCNA, desmin, and vimentin staining

(6)

장술 시 근 섬유화^7,9,15)와 동시에 근육의 재생3,5,6,8,11,12)이 유발됨 을 보여주었다. 골 연장이 천천히 진행되면서 근섬유는 탄력성 의 한계를 넘으면 끊어지게 되고 끊어진 근섬유의 수복을 위하 여 섬유아세포가 증식하여 근육의 재생이 일어나는 동시에 섬유 화에 의한 교원 조직 재생이 일어날 것이라고 가정하기도 하는 데, 이러한 신연 골형성술을 이용한 모델에서 10% 신연까지는 근섬유 사이의 치밀한 접착과 활강 효과로 늘어나지만 10%를 넘는 골 연장 시에는 근 및 섬유 조직의 신생이 일어나며, 20%

연장까지는 신생 조직이 근육의 전장에 걸쳐 있으나 20%를 넘 는 경우에는 근육 및 근막이 절골 부위에서 가장 많이 늘어난다 고 한다⁸⁾. 가토에서 20%까지 골 연장시에 근 연장이 근육 전장 에 걸쳐 일어났다는 보고²³⁾가 있었는데 본 실험에서는 30% 이 상 골 연장술을 하였을 때 근육의 손상은 어느 특정 부위에 일 어나지 않고 근육 전장에 걸쳐 일어났다.

이 연구에서는 근육 재생의 지표로서 PCNA와 desmin 면역 염색법을 사용하였다. PCNA는 호산성 폴리펩타이드로 세포주 기의 G1 후기, S기, G2 전기에 특이하며 desmin은 근 특이성 중간 섬유소 단백질(muscle specific intermediate filament pro-

tein)로서 재생되는 근 섬유가 성숙될 때 증가되어 근육의 재생 시 균일하게 반응이 증가한다²¹⁾. 섬유화의 지표로는 vimentin 면역 염색법을 이용하였는데, 제 3형 중간 섬유소 단백질(type III intermediate filament protein)인 vimentin은 섬유화(fibrosis)된 위치를 찾아낼 수 있는 지표로서 근육 손상 후 나타나는 섬유화 과정을 추적하는데 사용된다¹⁴⁾. Kanbe 등¹³⁾은 최근³¹P 자기 공명 분광분석기(magnetic resonance spectroscopy)를 이용한 신연 골형성 실험에서 20%의 골 연장 시 근육의 영구적 인 생리적 손상이 유발됨을 보고한 바 있다. 본 연구에서도 CL 군이 가장 높은 조직 손상 점수를 보였으며 조직 소견 상 근내막/

근주막의 섬유화를 나타내었고 vimentin 염색도 가장 현저하였 다. 이러한 소견은 신연 정도가 커질수록 신연에 대한 적응력 (adaptability)이 감소한다는 이전의 보고¹⁵⁾와 일치하는 결과이다.

성장호르몬은 세포에 아미노산을 유입시키고 이 아미노산이 단백질을 합성하게 하여 골격계 근육 합성을 증가시키는 작용을 한다¹⁸⁾. 이 기전에 대해서는 잘 알려져 있지는 않지만 아마도 근조직의 세포막 수용체에 결합하여 직접적인 동화 작용을 일으 키거나 혹은 IGF (insulin-like growth factor)-I을 통해서 근

C D

A B

Fig. 5. Vimentin immunostaining of the tibialis anterior on day 61. Intermysial fibrosis was minimal in the growth hormone administered lengthened group (C) when compared with the saline treated lengthened group (A), which showed intense staining. (A, saline administered, lengthened hindlimbs; B, saline administered, non-lengthened hindlimbs; C, growth hormone administered, lengthened hindlimbs; D, growth hormone administered, non-lengthened hindlimbs. Magnification, 200 ×).

(7)

세포에 작용하는 것으로 생각된다. IGF-I은 간, 근육 등에서 합 성되는 펩티드로 근모세포(myoblast)의 증식과 성숙의 자극제 로 알려져 있다^1,10). IGF-I은 국소(local) 또는 주변 분비 (paracrine) 방식으로 작용하며 특히 근육이 신장되어있는 경우 에 그러하다²²⁾. 성장호르몬의 종별간 아미노산 배열을 분석한 결과 사람과 쥐에서는 66%, 사람과 토끼에서는 64%, 쥐와 토 끼에서는 90%의 일치율을 보였다. 하지만 인형 성장호르몬을 가지고 토끼에 실험하였다는 보고가 많지 않고 성장호르몬에 관 한 연구는 거의 백서를 실험 동물로 삼았는데 이는 아마도 동물 관리와 실험이 용이하고 실험비가 저렴하다는 점에서 비롯되는 것으로 생각되었으며 따라서 저자들도 토끼와 같이 백서보다 큰 동물이 연장술 모델로는 더 적합하다고 생각했지만 위와 같은 이유로 백서를 상대로 실험을 하였다²⁾.

본 연구 결과는 과도한 신연 시 성장 호르몬의 투여가 근육의 재생을 촉진하면서 동시에 신연된 근육의 근내막/근주막 섬유화 를 감소시킴으로써, 근육의 신연에 대한 적응력을 높임을 시사 한다. 성장호르몬을 투여하면서 신연술을 시행한 GL군에서는 생리식염수를 투여하면서 신연술을 시행한 CL군에 비해 신연 기간 동안 PCNA 양성 세포가 약 4-5배 증가하였다. 그러나 경 화 기간에는 유의한 차이를 보이지 않았다. 비슷한 양상이 desmin 염색에서도 관찰되었다. 이러한 결과는 성장호르몬의 근육 재생 촉진 작용이 신연 기간에 국한된다는 점을 시사한다.

반면에 근 섬유화의 지표로 사용한 vimentin은 성장호르몬 투 여 군에서 현저하게 감소하였다. 전기생리학적 검사 상 근육의 수축력은 CL군보다 GL군에서 더 잘 보존되었다. CL군에서 현 저하게 증가된 근내막/근주막 섬유화는 실제 일상 생활에서의 주된 근육의 작용 방식인 강축력의 유의한 감소를 유발하였는데 이러한 소견들은 신연 기간 및 경화 기간 내내 관찰되었다.

본 실험에서는 성장호르몬의 직접적인 혈중 농도를 알 수가 없어 실제로 성장호르몬이 어느 정도 혈중 농도에서 근육에 어 떠한 작용을 하는지를 알 수는 없었다. 기술적인 문제점이 해결 되어 성장호르몬의 시간에 따른 변화를 측정하면 결과에 대한 해석이 좀더 용이할 수 있으리라 생각한다. 또한 30% 골 연장 도달 시기인 평균 34 (31-38)일과 30% 골 연장 목표치에 도달 한 뒤 근육의 기능 회복 안정기를 거친 후인 수술 후 평균 61 (57-67)일에 이루어지는 실험에 추가하여 유합 후 외고정 장치 를 제거하고 근육의 회복을 보았다면 성장호르몬의 효과가 더 잘 관찰될 수 있었을 것으로 생각된다. 왜냐하면 외고정 장치에 의해 근육의 운동이 제한되어 근육의 퇴화가 유발될 수도 있었 기 때문이다. 그럼에도 불구하고 본 연구는 저자들의 문헌 고찰 상 신연 골형성 시 신연된 근육에 미치는 성장호르몬의 영향에 대한 첫 보고라는 점에서 더욱 의의가 있다고 생각한다.

Raschke 등¹⁷⁾은 신연 골형성 시 동종 재조합 성장호르몬 (recombinant homologous growth hormone)의 전신 투여가 재생골의 골화를 유의하게 촉진시키는 효과가 있음을 보고하였 는데, 성장호르몬 투여군에서는 비투여 대조군에 비해 재생골의

비틀림 골절 강도(torsional stiffness)가 유의하게 높았다. 성장 호르몬이 신연 골형성 시 재생 골의 경화를 촉진시키며 근육의 손상을 최소화시킨다면 임상적으로 선천성 사지 결손 같은 심한 사지 단축 환자에서의 과도한 신연술 시에 도움이 될 수 있을 것이다. 그러나, 성장호르몬을 실제 임상에 적용하기 위해서는 부작용 없이 근육의 성장과 재생을 촉진시키는 최적 농도와 투 여 방법 등에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다.

결 론

과도한 골 연장술 시 성장호르몬의 투여는 신연된 근육의 섬 유화를 감소시켜 근육 손상을 최소화하고 근 섬유 재생을 촉진 함으로써 근육의 신연 적응력을 높여주며, 또한 근육의 기능을 보존시킬 수 있어 목표로 삼은 골 연장을 보다 안전하게 이루는 데 유익하다고 생각한다.

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