Volume 6, Number 1 , A p r i l , 2003
가토 연골막 세포의 연골화 분화에 있어서 Alginate-Fibrin Bead 배양법의 유용성
서울대학교 의과대학 정형외과학교실 유원준・최인호・정진엽・조태준・이차희
= Abstract =
Effect of Three Dimensional Culture Using Alginate-Fibrin Beads on the Chondrogenic Differentiation of Rabbit’s Perichondrial Cells
Won Joon Yoo, M.D., In Ho Choi, M.D.,
Chin Youb Chung, M.D., Tae-Joon Cho, M.D., Cha-Hui Lee, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
Purpose: To evaluate the usefulness of three dimensional culture using alginate-fibrin beads on the chondro- genic differentiation of rabbit’s perichondrial cells.
Materials and Methods: Rib perichondrial cells from rabbit expanded by monolayer culture were cultured in monolayer, in alginate bead, and in alginate-fibrin beads. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for type I, II, X collagen, and aggrecan was performed at 3 weeks after culture. At that time, we removed the alginate component from the alginate-fibrin bead. Then, the cell-fibrin beads were transplanted into the partial physeal defect of proximal tibia, and some beads were cultured on for additional 3 weeks for RT-PCR. Histologic examination was performed at 2, 4, 8, 12, and 16 weeks after operation.
Results: At 3 weeks, type II collagen gene expression was maintained regardless of the culture system used.
However, at 6 weeks it was maintained only in three-dimensional culture system using alginate beads and fib- rin beads. Histologic examination showed that the implanted perichondrial cell-fibrin beads formed small nest composed of chondrocyte-like cells and matrix.
Conclusion: These results suggest that alginate-fibrin beads may be used as a biodegradable scaffold for car- tilage engineering using perichondrial cells.
Key Words: Alginate-fibrin bead, Perichondrial cell, Chondrogenic differentiation
※ 통신저자: 최 인 호
서울시 종로구 연건동 2 8
서울대학교병원 어린이병원 정형외과
TEL: 02) 760-3640 FAX: 02) 764-2718 E-mail: [email protected]
서 론
연골막에는 섬유모세포와 비슷한 세포( f i b r o b- last-like cell)와 함께 소량의 연골 전구 세포 ( p r e c h o n d r o c y t e )가 있음이 알려져 있다1 ). 이 연골 전구 세포는 특정한 조건하에서 연골 세포로 분화할 수 있는 것으로 알려져 있다3 , 7 , 8 , 1 3 )
. 연골 세포의 표현형을 유지하는 데에는 아마도 연골 세 포의 모양을 구형으로 유지하는 조건이 중요한 요 인으로 생각되고 있는데2 )그 동안 삼차원 배양 방 법 중 alginate bead를 이용한 배양법이 많이 사 용되어왔다. alginate는 음전하를 가진 L - g u l u r o n a n과 D - m a n n u r o n a n의 선형 비황화 중합체(linear non-sulfated polymer)로 칼슘 이온이나 다른 다가 이온(multivalent counte- r i o n s )이 있으면 중합하여 젤 형태를 유지한다.
alginate bead로 배양한 포유류나 조류의 연골 세포들은 연골 성상(chondrocytic phenotype) 을 유지할 수가 있으며 그 기질은 단백 다당과 제 I I형, 제 X I형 콜라겐을 가진다고 한다4 ). 또 a l g i n a t e는 칼슘 킬레이트 화합물을 첨가하면 쉽 게 중합이 해리되므로 기질 성분을 연구하는데에 특히 유리한 장점이 있다. 그러나 alginate bead 는 생체내에서 분해되지 않아 세포를 생체 내로 전달하는 세포 매개체( s c a f f o l d )로의 역할을 하기 에는 어려운 단점이 있다.
F i b r i n은 생체 접착제 역할을 하며 생체내 분해 가 가능하므로 시험관내에서는 물론 임상적으로도 다양하게 사용되고 있다6 , 1 0 - 1 2 ). 그러나, fibrin을 단독으로 연골 세포의 매개체로 사용하게 되면 생 체 내에서 f i b r i n이 점차 분해됨에 따라 연골 세 포의 성상을 잃어버리게 된다5 ). Perka 등1 0 - 1 2 )은 관절 연골 세포를 a l g i n a t e와 f i b r i n o g e n의 혼합 용액에 부유시키고 이를 염화칼슘 및 트롬빈 (thrombin) 혼합 용액에 떨어뜨려 a l g i n a t e - fibrin bead를 만들어 배양하게되면 alginate 성 분에 의해 연골 세포의 표현형이 유지되면서 동시 에 생체 내로 이식할 때에는 alginate 성분만 녹 여낸 후 fibrin bead 형태로 사용할 수가 있어 생 체 내에서 분해가 가능한 장점이 있다고 하였다.
본 연구에서는 연골막 세포의 연골화 분화 유지
와 생체내 이식에 있어 alginate-fibrin bead 배 양법의 유용성을 규명하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 연골막 세포의 추출과 a l g i n a t e - f i b r i n bead 및 alginate bead를 이용한 삼차원 배양
ketamine(50 mg/kg)과 x y l a z i n e ( 2 0 m g / k g )을 가토의 복강 내로 주사하여 전신 마취 한 다음 흉부의 털을 깍았다. 베타딘 용액으로 소 독 후 늑골을 촉지하여 우측 흉부 최하단의 늑골 에서 2 ~ 3개 위쪽에 늑골의 방향을 따라 비스듬 하게 피부 절개를 하였다. 같은 방향으로 근육을 절개 후 흉막이 열리지 않도록 조심하면서 2개 내 지 3개의 늑골 연골을 연골막이 붙은 상태로 절제 하였다. 무균적 조작으로 연골막을 늑골에서 벗겨 내고 2 mm2 정도의 크기로 잘게 썰었다. 0.2%
protease 용액으로 4 0분 동안 항온기(섭씨 3 7도, 5% CO2) 속에서 처리한 후, 다시 0.2% colla- genase 용액으로 2 시간 동안 같은 방법으로 처 리하였다. cell strainer(70 μm )를 이용하여 여 과한 용액을 원심 분리(1500 rpm, 5분, 섭씨 4 도)하여 cell pellet을 얻었다. 이를 배양액 (DMEM, 10% fetal bovine serum, 50 μ g/ml ascorbic acid, 100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin)에 풀어 단층 배양하 였다. 7~10일간 배양 후 c o n f l u e n c e에 도달한 세포 일부에 대해 배양액을 버리고 D P B S로 2회 세척한 후 0.25% trypsin 2 ml를 넣고 5분 간 항온기에 넣어 세포를 바닥에서 뗀 후 동량의 배 양액을 넣어 t r y p s i n의 작용을 중지시키고 이를 원심 분리(1500 rpm, 5 분, 섭씨 4도)하여 p e l- l e t을 얻었다. pellet을 2×1 06 c e l l s / m l의 세포 밀도가 되도록 세포 부유액(140 mM NaCl + 5 mM KCl + 10 mM HEPES + 10 mM glu- cose) 100 μl에 부유시키고 4.8% alginate solution 200 μl와 fibrinogen(Greenplast, 녹 십자, 대한민국) 500 μl를 섞었다. 이 세포 혼합 용액을 102 mM CaCl2 10 ml와 thrombin 1 ml 혼합 용액에 21 G 주사기 바늘을 이용하여
방울방울 떨어뜨려 b e a d를 만들고 실온에서 약 10 분간 방치하여 안정시켰다. 6 well plate 배 양 용기에서 배양하였고 배양액은 단층 배양 시와 같은 배양액에 T G F -β1 5.0 ng/ml를 첨가하였 다. alginate bead의 제작은 상기한 방법대로 cell pellet을 얻은 후 이를 1.2% alginate s o l u t i o n에 2×1 06 c e l l s / m l의 밀도로 부유시키 고 102 mM CaCl2에 21 G 주사기 바늘을 이용 하여 방울방울 떨어뜨려 b e a d를 만들었다. 실온 에서 1 0분간 방치하여 안정시켰다. alginate- fibrin bead와 같은 배양액에서 배양하였다.
2. 시험관내 분석
단층 배양, alginate bead 배양, 그리고 a l g i- nate-fibrin bead 배양 3주 후에 제 1형, 2형, 1 0형 콜라겐과 a g g r e c a n에 대한 R T - P C R을 시 행하였다. aginate-fibrin bead에서 a l g i n a t e 성분을 제거하기 위해서 b e a d를 D P B S로 2회 세 척하고 이를 칼슘 킬레이트 용액(55 mM sodi- um citrate, 150 mM NaCl, 30 mM EDTA) 에 넣어 15 분간 두었다.1 0 ) alginate 성분이 빠져 나간 fibrin bead를 세척하고 일부는 다시 배양 을 재개하여 3주 후, 처음 배양으로부터는 6 주 후에 다시 단층 배양, alginate bead 배양, 및 fibrin bead 배양 세포에 대해 상기한 바와 같은 R T - P C R을 시행하였다.
3. 동물 수술 및 조직학적 검사
alginate-fibrin bead로부터 alginate 성분을 제거한 fibrin bead를 경골 근위부의 성장판을 포함한 골 결손 부위에 삽입하였다. 약술하면 전 신 마취 후 소독된 가토( n = 1 0 )의 양측 후지 근위 경골 전내측에 종형의 피부 절개를 넣고 골막을 벌려 성장판을 노출시켰다. 근위 경골에 대한 전 후 및 측면 방사선 사진들을 계측하여 제작한 o s t e o t o m e을 이용하여 성장판을 포함하여 골단 과 골간단의 골을 절제하였다. 절제된 면적은 전 체 면적의 4 0 %이었다. 생리 식염수로 관주하고 gel foam을 이용하여 지혈시켰다. 연골막 세포- fibrin bead를 삽입한 후, 골막과 피부를 봉합하
였고 압박 드레싱을 시행하였다. 가토는 수술 직 후부터 사육장 내에서 자유롭게 걸어다니도록 허 용하였다. 수술 후 2, 4, 8, 12, 16주에 각각 2 마리 씩 희생하여 조직학적 검사를 위해 Safranin-O 염색을 시행하였다.
결 과 1. 시험관내 실험 결과
RT-PCR 결과 단층 배양한 연골막 세포에서는 3주 까지 제 1형, 2형 콜라겐에 대한 m R N A가 발현되었으나 6주에는 제 2형 콜라겐의 발현이 거의 소실되었다. alginate bead 배양한 연골막 세포에서는 3주와 6주 모두에서 제 1형 및 2형 콜라겐이 발현되었는데 제 2형 콜라겐이 상대적으 로 강하게 발현되었다. alginate-fibrin bead에 서 3주간 배양한 연골막 세포에서는 제 1형 및 2 형 콜라겐이 발현되었으며 alginate 성분을 제거 하고 fibrin bead 상태로 3주간 더 배양된 연골 막 세포에서도 제 1형 및 2 형 콜라겐이 발현되었 으나 제 2형 콜라겐이 상대적으로 강하게 발현되 었다(Fig. 1).
2. 조직학적 소견
연골막세포-fibrin bead를 삽입하지 않은 우측 경골의 이식 부위는 일관되게 골이 형성되어 골단 과 골간단 사이의 공간을 채우고 있었다. 연골막 세포-fibrin bead를 삽입한 좌측 경골의 이식 부 위에서는 Safranin-O 염색 결과 불규칙한 배열 을 보이는 연골세포양 세포( c h o n d r o c y t e - l i k e c e l l )와 기질이 관찰되었다. 이들은 수술 후 1 6주 까지도 관찰되었으나 염색 정도가 정상 성장판 및 관절 연골에 비해 현저하게 떨어졌고 연골 덩어리 의 크기는 대개 작았으며 주위로 골 조직 및 섬유 조직이 둘러싸고 있었다(Fig. 2). 삽입된 f i b r i n 성분은 4주 이후 모두 소실되어 관찰되지 않았다.
고 찰
Chu 등2 )은 가토 늑골 연골막에서 추출 및 단층
배양한 연골막 세포를 polylactic acid core에 함 입하고 이를 관절 연골의 골연골 결손 부위에 이 식한 결과 약 8 5 %에서 골연골 결손의 치유를 얻 었다고 보고하였고, Dounchis 등3 )도 같은 세포 와 매개체를 이용한 실험에서 연골 조직의 형성을 조직학적으로 확인하였다고 하였으나 p o l y l a c t i c a c i d가 아닌 다른 매개체를 이용한 연골막 세포의 생체 내 이식 실험은 드물다.
세포의 생체내 전달 매개체로서 많은 생물질 및 합성 물질들이 사용되고 있으나 가장 중요한 매개 체의 요건 중 하나는 생체 내에서의 생분해성과 염증 반응을 포함한 유해 반응을 일으키지 않는 것이라 할 수 있는데 f i b r i n은 이러한 점에서 장 점을 가지고 있다고 할 수 있다. Perka 등1 0 - 1 2 )
은 alginate-fibrin bead를 이용한 이단계 연골 세 포 이식술을 도입하였는데, 연골 세포를 처음부터
fibrin bead에 넣어 배양하면 점차 섬유모세포 비슷한 모양으로 탈분화되지만 alginate 성분을 추가하여 배양하면 이를 막을 수 있다고 하였다.
게다가 향후 alginate 성분을 제거하게 되면 alginate 성분이 빠져나간 구멍( p o r e )으로 인해 연골 세포의 기질이 형성될 수 있는 여분의 공간 까지 제공된다고 하였다. 즉, 연골 세포를 a l g i- nate-fibrin bead를 이용하여 이단계로 배양함 으로써 연골 세포를 충분히 증식시키고 기질 생산 이 충분히 일어나게 한 후 생체내 이식에 적절한 매개체로 바꾸어 줄 수 있다는 것이다. 그러나, 이 경우 생체 내로 이식이 된 후라도 세포는 일정 기간 동안 fibrin 환경 속에 놓여있어야 하므로 이 기간 동안 다시 탈분화된다면 이 생물질의 매 개체로서의 효용 가치는 감소하고 말 것이다. 본 연구자들은 alginate 성분이 빠져나간 후의 f i b- Fig. 1. Results of RT-PCR: A; Three weeks after monolayer culture and three-dimensional culture using alginate beads or alginate-fibrin beads. B; Additional three weeks after removal of alginate component from alginate- fibrin beads. COL, collagen.
A B
Fig. 2. Histologic findings of implanted perichondrial cell-fibrin beads: A; Cartialge nest is surrounded by bone and fibrous tissues (× 12.5 Safranin-O). B; Chondrocyte-like cells are arranged irregularly in the cartilage nest (× 40. Safranin-O).
A B
rin bead 속의 연골막 세포가 배양을 계속할 경 우에도 연골 세포 성상을 유지할 수 있어야만 이 매개체가 생체 내 실험에 유용하게 사용될 수 있 을 것으로 생각하였다. 본 실험 결과, 연골막 세 포에서 유래된 세포는 alginate 성분이 제거된 후에도 fibrin bead 속에서 제 2형 콜라겐 유전 자 발현을 지속적으로 유지하였고, fibrin bead 와 함께 생체 내에 이식되었을 때 비록 적은 양이 지만 연골양세포의 조직학적 소견을 보여, 이러한 이단계 배양 방법이 연골막세포에서 유래된 세포 의 연골 성상을 유지시키는 데에 유용하였다고 판 단된다. 특히 fibrin 성분은 임상에서 지혈제로 사용되고 있는 물질이므로 지혈이 중요한 상황, 그리고 매개체가 물리적 지지 역할을 하지 않아도 되는 조건에서 더욱 유용할 것으로 생각되는 바, 저자들은 그동안 많이 연구되어온 관절 연골이 아 닌 예컨대 성장판 연골 부분 결손에 대한 조직 공 학적 연구에도 fibrin 매개체의 적용 범위가 확대 될 수 있을 것으로 생각한다.
본 실험에서 연골막 세포에 대한 배양 방법과 무관하게 제 1형 콜라겐이 현저하게 양성으로 나 타났다. 연골막 세포를 얻기 위해서 효소를 이용 하여 연골막을 녹이게 되면 일부의 이른바 연골 전구 세포(prechondrocyte) 이외에 많은 수의 섬유모세포, 섬유세포가 나오게 되므로 이들의 성 상을 나타내는 제 1형 콜라겐이 지속적으로 발현 되었을 가능성이 있다. 따라서, 연골막에서 얻은 총 세포 중에서 얼마나 많은 세포가 연골화 분화 에 들어갈 수 있는지를 밝히는 것도 향후 조직 공 학적 방법을 이용한 세포 치료를 계획하는데 있어 서 중요한 문제라고 생각된다.
골결손 부위에서 형성된 연골 세포양 세포는 크 기가 작았고 조직학적으로 불규칙한 배열을 하고 있었으며 safranin-O 염색에 양성인 부분도 다 른 정상 연골 부위에 비해 현저하게 떨어지는 염 색 소견을 보였다. 이는 이들 세포가 연골 세포의 기질을 충분히 생산하지 못하는 미분화된 미성숙 세포이기 때문일 것으로 생각되었으며 이 결과는 시험관내 실험에서 삼차원 배양된 연골막 세포에 서 비록 제 2 형 콜라겐은 발현되었으나 a g g r e- c a n은 거의 발현되지 않은 사실과도 부합하는 것 으로 보인다. 그러므로 이들 세포와 매개체를 골
연골 결손 치료에 응용하기 위해서는 세포의 증식 과 분화를 촉진시킬 다른 방법 - 예컨대 다른 성 장 인자의 투여 -에 대한 추가 연구가 필요할 것 으로 생각된다. 또한 형성된 연골양 세포 주위에 는 골 및 섬유 조직이 증식되어 있었는데, 이는 연골막 세포의 증식이 충분하지 못하여 결손 부위 를 채우지 못하였고, 또 bead 형태의 매개체가 가진 한계로 인해 b e a d와 bead 사이의 공간에 혈종( h e m a t o m a )이 형성되면서 골형성에 이르게 된 것으로 추측되는 바, 세포 증식 촉진 방법과 함께 bead 형태가 아닌 다른 형태의 매개체를 이 용한 연구도 필요하리라 생각된다.
결 론
가토 연골막 세포의 alginate-fibrin bead를 이용한 이단계 배양은 연골막에서 유래된 세포의 연골 성상 유지 및 생체내 이식에 있어 유용하였 으나 향후 이를 골연골 결손의 치료에 응용하기 위해서는 연골막 세포의 증식과 분화를 촉진할 방 법과 매개체 형태에 대한 추가 연구가 필요할 것 으로 생각되었다.
R E F E R E N C E S
01) Bulstra SK, Homminga GN, Buurman WA, Terwindt-Rouwenhorst E, and van der Linde- nAJ: The potential of adult human perichondri- um to form hyalin cartilage in vitro. J Orthop Res, 8(3):328-335, 1990.
02) Chu CR, Dounchis JS, Yoshioka M, Sah RL, Coutts RD, and Amiel D: Osteochondral repair using perichondrial cells. A 1-year study in rab- bits. Clin Orthop, 340:220-229, 1997.
03) Dounchis JS, Bae WC, Chen AC, Sah RL, Coutts RD, Amiel D: Cartilage repair with auto- genic perichondrium cell/polylactic acid grafts: a two-year study in rabbits: J Orthop Res. 18:512- 515, 2000.
04) Hauselmann HJ, Aydelotte MB, Schumacher BL, Kuettner KE, Gitelis SH, and ThonarEJ:
Synthesis and turnover of proteoglycans by
human and bovine adult articular chondrocytes cultured in alginate beads. M a t r i x, 12(2):116- 129, 1992.
05) Homminga GN, Buma P, Koot HW, van der Kraan PM, and van den Berg WB: Chondro- cyte behavior in fibrin glue in vitro. Acta Orthop Scand, 64(4):441-445, 1993.
06) Keller J, Andreassen TT, Joyce F, Knudsen VE, Jorgensen PH, and Lucht U: Fixation of osteochondral fractures. Fibrin sealant tested in dogs. Acta Orthop Scand, 56(4):323-326, 1985.
07) Lee MC, Goomer RS, Takahashi K, Harwood FL, Amiel M, and Amiel D : Transforming growth factor beta one (TGF-beta 1) enhance- ment of the chondrocytic phenotype in aged peri - chondrial cells: an in vitro study. Iowa Orthop J.
20:11-16, 2000.
08) Mishima H, Goomer RS, Harwood FL, Ochiai N, Coutts RD, and Amiel D: Do three-dimen- sional alginate culture conditions enhance the chondrocytic phenotype of perichondrium- derived cells? Trans Orthop Res Soc, 25:934, 2000.
09) Park SR: Mesenchymal stem cell. Experimental
& Molecular Medicine, 34 Suppl:103-118, 2002.
10) Perka C, Arnold U, Spitzer RS, and Linden- hayn K: The use of fibrin beads for tissue engi- neering and subsequential transplantation. Tissue Eng, 7(3):359-361, 2001.
11) Perka C, Schultz O, Spitzer RS, Lindenhayn K, Burmester GR, and Sittinger M: Segmental bone repair by tissue-engineered periosteal cell transplants with bioresorbable fleece and fibrin scaffolds in rabbits. B i o m a t e r i a l s, 21(11):1145- 1153, 2000.
12) Perka C, Spitzer RS, Lindenhayn K, Sittinger M, and Schultz O: Matrix-mixed culture. New methodology for chondrocyte culture and prepa- ration of cartilage transplants. J Biomed Mater Res, 49(3):305-311, 2000.
13) Van Osch GJ, Van Der Veen SW, Burger EH, and Verwoerd-Verhoef HL : Chondrogenic potential of in vitro multiplied rabbit perichon- drium cells cultured in alginate beads in defined medium. Tissue Eng, 6(4):321-330, 2000.
