국내 의료기관 헌혈자에서 Xenotropic Murine Leukemia Virus-Related Virus (XMRV)의 분석

(1)

Received on July 23, 2013. Revised on August 5, 2013. Accepted on August 6, 2013 Correspondence to: Kyoung Un Park

Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, 173-82 Gumiro, Bundang-gu, Seongnam 463-707, Korea Tel: 82-31-787-7692, Fax: 82-31-787-4015, E-mail: [email protected]

Vol. 24, No. 2, 155-160, August 2013 Original Article

국내 의료기관 헌혈자에서 Xenotropic Murine Leukemia Virus-Related Virus (XMRV)의 분석

장호은¹ㆍ홍윤지^1,2ㆍ황상미^1,2ㆍ김택수^1,2ㆍ배우경³ㆍ박경운^1,2ㆍ송정한^1,2ㆍ한규섭²

분당서울대학교병원 진단검사의학과¹, 서울대학교 의과대학 검사의학교실², 분당서울대학교병원 가정의학과³

Analysis of Xenotropic Murine Leukemia Virus-Related Virus (XMRV) in Korean Blood Donors in a Medical Center

Ho Eun Chang¹, Yun Ji Hong^1,2, Sang Mee Hwang^1,2, Taek Soo Kim^1,2, Woo Kyung Bae³, Kyoung Un Park^1,2, Junghan Song^1,2, Kyou Sup Han²

Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Bundang Hospital¹, Seongnam, Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine², Seoul, Department of Family Medicine, Seoul National University Bundang Hospital³, Seongnam, Korea

Background: Xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) has been detected in peripheral blood mononuclear cells (PBMNs), therefore, it has been regarded as being infectious and transmittable by transfusion.

Thus, we attempted to detect XMRV in blood samples in order to confirm the absence of XMRV from blood donors.

Methods: We achieved 165 blood donors and four chronic fatigue syndrome (CFS) patients. We performed real-time polymerase chain reaction using the LightCycler 480 (Roche, Penzberg, Germany) for the gag and env genes of the XMRV genome. DNA was extracted from peripheral blood samples. We used Uracil-N-Glycosylase in order to prevent contamination and DNA extracted from mouse embryonic fibroblasts (MEF) for amplification control.

Results: No XMRV was detected in any of the blood donors in both the gag and env genes. In four CFS patients, amplification was not detected in the gag gene. In two of four CFS patients, amplifications were detected and the melting temperature was in agreement with that of MEF control in the env gene.

Conclusion: Although XMRV was not present in blood samples from blood donors, this is the first report on XMRV in Korean blood donors. We confirmed the absence of XMRV in Korean blood donors, the same as studies reported in other countries. (Korean J Blood Transfus 2013;24:155-160)

Key words: Blood donors, XMRV, Real-time polymerase chain reaction

(2)

Fig. 1. Gene structure of xenotropic murine leukemia virus-related virus (Genbank accession number:

NC_007815.2). XMRV is a single stranded, linear RNA virus. Two target genes (gag and env) were used for real-time polymerase chain reaction in this study.

서 론

Xenotropic murine leukemia virus-related virus에 대한 첫 보고는 2006년, 전립선암 세포에서 xeno- tropic murine leukemia viruses (MuLV)와 90% 이 상의 일치도를 보이는 바이러스를 발견한 것이었 다. 이 보고에서 이러한 신종 바이러스를 xeno- tropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) 라 명명하였고 전립선암과의 질환 연관성이 제시 되었다.

^1,2)

이후 2009년에는 만성피로증후군(chronic fa- tigue syndrome) 환자의 혈액에서 약 67%, 건강인 의 약 4%에서 XMRV가 검출되어, XMRV가 전립 선암뿐 아니라 만성피로증후군과 연관성이 있다 는 가능성이 제기되면서, 수혈전파성 감염원으로 서의 우려도 제기되기 시작하였다. 하지만 2010 년, 미국 질병관리본부의 보고에서 XMRV는 만 성피로증후군과의 질환연관성의 증거가 없다는 발표가 있었고, 이어 XMRV의 검출은 실험실의 세포배양과정에서 레트로바이러스의 오염과 재 조합과정에 의한 결과라는 보고가 이어지는 등, XMRV는 여러 가지 논란의 대상이 되고 있는 바

이러스이다.

^3-7)

인체면역결핍바이러스와 인체티림프영양성바 이러스가 인간의 면역체계 질서와 각종 싸이토카 인 분비에 혼란을 주어 질환 연관성이 있는 것으 로 알려져

^8,9)

국내 혈액관리법에서 수혈전파성 감 염원으로 관리되고 있다. 수혈전파성 감염원으로 서 바이러스에 대한 관심이 계속되고 있는 가운 데, XMRV가 검출된 만성피로증후군 환자군과 건강인의 싸이토카인 분비에 차이가 있다는 보고 가 있는 바,

¹⁰⁾

저자들은 헌혈자와 만성피로증후 군 환자를 대상으로 XMRV의 검출 가능성을 확 인해 보고자 하였다.

대상 및 방법

1. 대상

분당서울대학교병원의 2007년 1월부터 2009년

4월까지 헌혈자 중 165명과 만성피로증후군 환자

4명을 대상으로 하였다. 헌혈 대상자는 전혈 헌

혈 82명, 성분채집백혈구 헌혈 36명, 성분채집혈

소판 헌혈 20명, 자가헌혈 27명이었다. 추가로 분

(3)

당서울대학교병원 가정의학과에서 만성피로증 후군으로 진단받은 외래환자 4명을 포함하였다.

2. XMRV 검출을 위한 실시간-중합효소연 쇄반응

헌혈자 검사용으로 채혈된 말초혈액 전혈을 이용하여 핵산을 추출하고 실시간-중합효소연쇄 반응을 시행하였다. 핵산추출에는 QIAamp blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하였고, 실시간-중합효소연쇄반응의 대상유전자는 XMRV 유전체의 gag 유전자와 env 유전자이었다(Fig. 1).

시발체의 염기서열은 gag 유전자의 경우 GAG- 419F (5’-ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3’) 및 GAG-1154R (5’-GCCGCCTCTTCTTCATTGTT CTC-3’) (Bioneer, Daejeon, Korea)이었고, env 유 전자의 경우 ENV-5922F (5’-GCTAATGCTACCT CCCTCCTGG-3’) 및 ENV-6273R (5’-GGAGCCCA CTGAGGAATCAAAACAGG-3’) (Bioneer)이었다.

실시간-중합효소연쇄반응에는 LightCycler 480 (Ro- che, Penzberg, Germany)을 이용하였다. gag 유전 자 증폭을 위한 반응액의 조성은 LC480 SYBR green master (Roche) 10.0 μL, Uracil-N-Glycosy- lase (Roche) 0.5 μL, 시발체 0.25 μM, 추출된 핵 산 3.0 μL이었고, 증폭반응을 위하여 25

^o

C에서 10분, 95

^o

C에서 10분 동안 초기 변성을 시행하였 고, 95

^o

C에서 15초, 60

^o

C에서 30초, 72

^o

C에서 30초 의 순서로 45회 반복하고 95

^o

C에서 30초, 60

^o

C에 서 2분, 99

^o

C에서 0초의 순서로 0.1

^o

C/sec로 설정 하고 융해곡선분석을 시행하였다. env 유전자 증 폭을 위한 반응액의 조성은 LC480 SYBR green master 10.0 μL, Uracil-N-Glycosylase 0.5 μL, 시 발체 0.15 μM, 추출된 핵산 3.0 μL이었고, 증폭 반응을 위하여 25

^o

C에서 10분, 95

^o

C에서 10분 동 안 초기 변성을 시행하였고, 95

^o

C에서 10초, 62

^o

C 에서 15초, 72

^o

C에서 15초의 순서로 45회 반복하

고 95

^o

C에서 30초, 60

^o

C에서 2분, 99

^o

C에서 0초의 순서로 0.1

^o

C/sec로 설정하고 융해곡선분석을 시 행하였다.

3. 실시간-중합효소연쇄반응의 대조물질

실시간-중합효소연쇄반응의 양성대조로는 CF1 Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) (MCTT, Seoul, Korea)에서 추출한 핵산을, 음성대조로는 멸균증 류수를 사용하였다. CF1 Mouse Embryonic Fibro- blast 107개의 세포에서 QIAamp blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 핵산을 추 출하고, 추출된 핵산을 1,000배 희석하여 양성대 조로 사용하였다.

결 과

1. gag 유전자를 대상으로 한 실시간-중합 효소연쇄반응

양성대조인 CF1 Mouse Embryonic Fibroblast의 평균 교차점(crossing point, Cp) 값은 36.97이었고, 평균 융해온도는 87.50이었다. 양성대조와 동일 하게 증폭곡선을 형성하고 융해온도가 87.5±1.0 인 경우 양성으로 판정하였는데, 헌혈자 검체 165개 중 양성 반응을 보이는 검체는 없었다. 만 성피로증후군 환자의 검체 4개도 모두 음성 결과 를 보였다(Fig. 2).

2. env 유전자를 대상으로 한 실시간-중합 효소연쇄반응

양성대조인 CF1 Mouse Embryonic Fibroblast의

평균 교차점 값은 38.33이었고, 평균 융해온도는

86.50이었다. 양성대조와 동일하게 증폭곡선을

형성하고 융해온도가 86.5±1.0인 경우 양성으로

판정하였는데, 헌혈자 검체 165개 중에 양성 반

(4)

Fig. 2. Results of real-time polymerase chain reaction for gag gene. (A) Absolute quantification result and (B) melting curve analysis result. Samples a-d are not amplified and MEF-1000 (1000-fold diluted DNA of mouse embryonic fibroblast 10

⁷

cells DNA) is amplified and shows the unique melting temperature.

Fig. 3. Results of real-time polymerase chain reaction for env gene. (A) Absolute quantification result and (B) melting curve analysis result. Samples a and b are amplified and show the same melting temperatures as melting temperature of MEF-1000 (1000-fold diluted DNA of mouse embryonic fibroblast 10

⁷

cells DNA).

Samples c and d are amplified but show the different melting temperatures with melting temperature of MEF-1000.

응을 보이는 검체는 없었으나, 만성피로증후군 환자의 검체 4개 중 2개에서 양성 결과를 보였다.

양성결과를 보인 검체의 교차점 값은 각각 39.12

와 39.33이었고, 융해온도는 각각 85.78과 85.99이

었다(Fig. 3). 이 두 개의 검체는 gag 유전자의 결

과를 종합하여 최종 음성으로 판독되었다.

(5)

고 찰

전립선암 세포에서 처음 발견된 후 만성피로 증후군 환자의 혈액에서 검출되어 수혈전파성 감 염원으로서의 우려가 제기된 XMRV는 이후 일부 실험실에서 전혀 검출되지 않았고, XMRV가 검 출된 실험실에서의 바이러스 재조합과정에 의한 산물이라는 보고가 이어져,

⁴⁾

질환 연관성에 대해 회의적인 분위기가 조성되고 있다. 하지만 XMRV 가 혈액에서 검출되었다는 해외보고가 있었고, XMRV가 검출된 환자군에서 유의한 싸이토카인 분비량의 변화를 확인했다는 보고가 있는 바,

¹⁰⁾

국내 헌혈자의 말초혈액을 대상으로 XMRV 검출 가능성은 없는지 확인해 보고자 하였다.

여러 보고에서 논란이 되었던 오염의 가능성을 배제하고자 실험의 조건 세 가지를 선정하였다.

첫째, 실험이 이루어진 실험실은 쥐를 이용한 실 험을 시행한 기록이 없는 실험실임을 확인하였 다. 둘째, 실험과 실험간의 오염 가능성을 배제하 고자 실험방법으로 실시간-중합효소연쇄반응을 선택하였고, 셋째, 중합효소연쇄반응의 오염방지 방법으로 알려진 Uracil-N-Glycosylase를 반응액에 넣고 실시간-중합효소연쇄반응의 첫 번째 단계에 서 오염가능성이 있는 주형을 모두 파괴하였다.

저자들의 실험 결과, 165명의 헌혈자군에서는

gag 유전자와 env 유전자 모두에서 양성반응을

보이지 않았다. 양성대조로 사용한 MEF에서 추 출한 핵산은 gag 유전자와 env 유전자를 대상으 로 한 반응에서 모두 양성반응을 보여 대상유전 자에 대한 실시간-중합효소연쇄반응의 유효성을 확인할 수 있었다. 만성피로증후군의 진단을 받 은 환자 4명 중 2명은 gag 유전자에서는 증폭을 보이지 않았으나, env 유전자를 대상으로 한 경우 증폭곡선을 나타내었고, 융해온도도 양성대조의 융해온도와 오차범위 내에서 일치하였다. 하지만

gag 유전자의 결과를 종합하여 판단할 때, 이 두

검체의 경우도 최종적으로 음성으로 판독하였다.

해외의 여러 보고에서 XMRV의 만성피로증후 군과의 질환 연관성에 대하여 논란이 있었지

만,

^2,4,11,12)

국내에서는 XMRV 검출에 관한 시도와

보고는 없었다. 이에 저자들은 국내 헌혈자를 대 상으로 XMRV 검출 가능성에 대해 확인해 보고 자, 헌혈자의 말초혈액 검체에서 XMRV 검출을 시행하였는데, 165명의 헌혈자에서 XMRV가 검 출되지 않았다. 이는 미국, 중국, 네덜란드 등의 해 외 보고와 같이

^4,11,12)

한국인 헌혈자에서도 XMRV 가 검출되지 않음을 확인할 수 있는 것으로 생각되 었다.

요 약

배경: 말초혈액에서 XMRV가 검출됨에 따라 새로운 수혈전파성 감염원으로서 XMRV에 대한 논란이 있었다. 이에, 국내 헌혈자를 대상으로 XMRV 검출 가능성에 대해 확인해 보고자, 말초 혈액에서의 XMRV 검출을 시도해 보았다.

방법: 헌혈자 165명과 만성피로증후군으로 진 단받은 환자 4명을 대상으로 하였다. 헌혈자 검 체의 전혈을 이용하여 핵산을 추출하고 XMRV의 검출을 위해 LC480 (Roche, Penzberg, Germany)을 이용하여 gag 유전자와 env 유전자 각각에 대한 실시간-중합효소연쇄반응을 시행하였다. 모든 실 시간-중합효소연쇄반응에는 오염에 의한 위양성 을 방지하기 위해 Uracil-N-Glycosylase를 사용하 였고, 양성대조물질은 mouse embryonic fibroblast 에서 추출한 핵산을 이용하였다.

결과: 165명의 헌혈자군에서는 gag 유전자와

env 유전자 모두에서 양성반응을 보이지 않았다.

만성피로증후군의 진단을 받은 환자 4명 중 2명

은 gag 유전자에서는 증폭을 보이지 않았으나,

(6)

env 유전자를 대상으로 한 반응에서 증폭곡선을

나타내었고, 융해온도도 양성대조의 융해온도와 오차범위 내에서 일치하였다. 이 두 개의 검체는

gag 유전자의 결과를 종합하여 최종 음성으로 판

독되었다.

결론: 말초혈액에서 검출되는 만성피로증후군 의 병원체 XMRV가 저자들이 대상으로 한 165명 의 헌혈자 검체에서는 검출되지 않았다. 이는 국 내에서 헌혈자를 대상으로 한 XMRV 검출의 첫 시도로, 해외 보고와 같이 한국인 헌혈자에서도 XMRV가 검출되지 않음을 확인할 수 있는 것으 로 생각되었다.

References

1. Urisman A, Molinaro RJ, Fischer N, Plummer SJ, Casey G, Klein EA, et al. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog 2006;2:e25

2. Coffin JM, Stoye JP. Virology. A new virus for old diseases? Science 2009;326:530-1

3. Kakisi OK, Robinson MJ, Tettmar KI, Tedder RS. The rise and fall of XMRV. Transfus Med 2013;23:142-51

4. Switzer WM, Jia H, Hohn O, Zheng H, Tang S, Shankar A, et al. Absence of evidence of xenotropic murine leukemia virus-related vi- rus infection in persons with chronic fatigue syndrome and healthy controls in the United States. Retrovirology 2010;7:57

5. Paprotka T, Delviks-Frankenberry KA, Cingöz O, Martinez A, Kung HJ, Tepper CG, et al.

Recombinant origin of the retrovirus XMRV.

Science 2011;333:97-101

6. Delviks-Frankenberry K, Cingöz O, Coffin JM, Pathak VK. Recombinant origin, contamina- tion, and de-discovery of XMRV. Curr Opin Virol 2012;2:499-507

7. Williams DK, Galvin TA, Gao Y, O'Neill C, Glasner D, Khan AS. No evidence of xeno- tropic murine leukemia virus-related virus transmission by blood transfusion from infec- ted rhesus macaques. J Virol 2013;87:2278-86 8. Nowroozalizadeh S, Månsson F, da Silva Z,

Repits J, Dabo B, Pereira C, et al. Studies on toll-like receptor stimuli responsiveness in HIV-1 and HIV-2 infections. Cytokine 2009;46:

325-31

9. Dhib-Jalbut S, Hoffman PM, Yamabe T, Sun D, Xia J, Eisenberg H, et al. Extracellular human T-cell lymphotropic virus type I Tax protein induces cytokine production in adult human microglial cells. Ann Neurol 1994;36:787-90 10. Lombardi VC, Hagen KS, Hunter KW, Diamond

JW, Smith-Gagen J, Yang W, et al. Xenotropic murine leukemia virus-related virus-associated chronic fatigue syndrome reveals a distinct inflammatory signature. In Vivo 2011;25:307-14 11. Mi Z, Lu Y, Zhang S, An X, Wang X, Chen