44(2) : 154∼ 160 (2013)
154
HaCaT 각질형성세포에서 홍조류인 단박(Ceramium boydenii)의 STAT1 활성 억제를 통한 MDC/CCL22 생성 억제 효과
강나진1·강경진2·한상철2·현은아2·구동환1·고영상1,2·고미희3·현진원1,2·강희경1,2·유은숙1,2*
1제주대학교 일반대학원 의생명·신약개발학과, 2제주대학교 의학전문대학원 의학과, 3제주 생물종다양성 연구소
Ceramium boydenii, a Red Alga, Inhibits MDC/CCL22 Production Via Suppression of STAT1 Activation in HaCaT Keratinocyte
Na-Jin Kang1, Gyeung-Jin Kang2, Sang-Chul Han2, Eun-A Hyun2, Dong-Hwan Koo1, Young-Sang Koh1,2, Mi-Hee Ko3, Jin Won Hyun1,2, Hee-Kyoung Kang1,2, and Eun-Sook Yoo1,2*
1Department of Biomedicine & Drug Development, Jeju National University, Jeju 690-756, Korea
2Department of Medicine, Jeju National University School of Medicine, Jeju 690-756, Korea
3Jeju Biodiversity Research Institute, Jeju Technopark, Jeju 699-943, Korea
Abstract − Ceramium boydenii belongs to euphorbia humitusa of red algae, and is distributed along the coast of Jeju island.
This study was conducted to examine the anti-inflammatory effect and action mechanism of C. boydenii in the human kera- tinocyte cell line HaCaT. The 80% EtOH extract of C. boydenii inhibits the production of MDC (macrophage derived chemok- ine), an inflammatory chemokine, induced by IFN-γ and TNF-α in a concentration dependent manner. It also suppressed the phosphorylation and nuclear translocation of STAT1, a key transcription factor in IFN-γ and TNF-α signaling pathway, at the effective concentrations. These results suggest that C. boydenii demonstrates the anti-inflammatory activity via the suppression of STAT1 activation and has the significant value as an anti-inflammatory source.
Key words − Ceramium boydenii, HaCaT, MDC, STAT1
Chemokine은 작은 분자의 단백질로서, 백혈구 상호 전달 조절에 의해 면역 반응과 염증 반응에서 주요한 역할을 한 다고 알려져 있다. 이러한 chemokine은 아미노산 서열에서 2가지 cystein 그룹의 상대적인 위치에 따라 4가지 하부 그 룹(CC-, CXC-, CX₃C-, C- chemokines)으로 나누어진다.1-3) Macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22)은 CC che- mokine receptor 4 (CCL4)에 결합하는 CC chemokine에 속 하며, T helper 2 cell (Th2 cell)에 선택적으로 발현한다.
MDC와 CCL4의 상호작용은 악화된 조직으로 Th2 세포의 이주에서 중요한 역할을 하며, 염증 부분으로 Th2 lymphocyte의 이주를 선택적으로 조절한다. 특히 염증성 피 부질환인 아토피 피부염 환자에서 MDC의 혈청 또는 혈장 농도가 상당히 높았고, 아토피 피부염의 심각성에 따라 MDC 의 농도가 증가된 것이 보고되었다. 이와 일치하게, 아토피 피부염 환자의 손상된 피부에서 각질형성세포에 의해 MDC
가 발현이 증가되었다고 보고되었다.3-5) 각질형성세포는 표 피장벽의 주된 요소로서, 세포에 자극이 들어왔을 때 선천 면역반응에서 패턴인식수용체, cytokine, chemokine과 같은 선천 면역 mediator로부터 외부의 이물질 또는 위험자극을 인식하는 필수적인 역할을 한다.6-8)
Interferon-γ (IFN-γ)는 항바이러스 면역, 세포 사멸, 세포 주기 퇴화를 포함한 다양한 세포 활성을 조절하는 cytokine 이다. 피부에서 IFN-γ는 염증과 면역 반응에서 중추적인 역 할을 한다. 특히, 많은 chemokine의 발현을 유도한다.9) Tumor necrosis factor (TNF)는 형질전환세포로부터 유도될 수 있는 세포독성반응과 동물에서 종양의 퇴행을 유도하는 기능을 기반으로 한 다기능적 cytokine이다. 이러한 TNF는 면역, 염증, 인슐린 저항성, 혈관형성 등을 촉진한다고 알려 져 있다.10) IFN-γ와 TNF-α는 각질형성세포에 노출되었을 때 많은 양의 cytokine과 chemokine의 발현을 유도하고, 피 부에서 염증 부위로 단핵구/T세포의 침투를 증가시킨다고 보고되었다.11)
*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-64-754-3847
Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (Jak/STAT) 신호전달 기전은 면역 기능, 세포 성장인자, 세포 분화 등을 포함하여 다수의 중요한 생물학 적인 반응을 조절한다. Jak/STAT 신호전달 기전은 자극에 의하여 cytokine이 corresponding 수용체와 결합했을 때 활 성화되고, 면역 반응과 관련된 타겟 유전자에 대해 세포 표 면에서 수용체로부터 신호전달이 일어난다. 활성화 된 STAT 단백질은 세포질에서 핵으로 이동되고, 그들의 프로모터와 결합하여 자가조절 메커니즘에 의해 그들 자신의 발현을 촉 진함으로써 다양한 염증과 관련된 유전자(Thymus and activation regulated chemokine; TARC/CCL17, intercellular adhesion molecule 1; ICAM-1, Suppressor of cytokine signaling proteins; SOCSs 등)의 발현을 직접적으로 유도한 다.11-13)
홍조식물문 비단풀과(Ceramiaceae)에 속하는 단박 (Ceramium boydenii)은 우리나라 서남 해안과 제주도에 분 포하고, 조간대의 모자반류나 다른 해조류에 착생하여 서식 한다(Fig. 1). 단박은 주로 한천원료로 사용한다고 알려져 있 다.14)단박의 약리활성이나 활성성분에 대해서는 거의 알려 진 바 없으며, 2008년 특허에서 peroxisome proliferator- activated receptor (PPAR)를 조절하여 비만과 당뇨를 예방 또는 치료 가능하다고 보고되었다.15)
본 연구팀은 제주도 연근해에서 채취 가능한 해조류의 80% 에탄올 추출물에 대하여 HaCaT 각질형성세포에서 염 증성 chemokine인 MDC 생성 억제효과를 지속적으로 검색 하고 있다. 그 결과, 단박 추출물의 효과가 우수하여 그 활 성기전을 밝히고자 본 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
시약 및 기기 − Human interferon-γ (hIFN-γ, recombinant E. coli), tumor necrosis factor-α, fetal bovine serum (FBS) 과 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)은
Invitrogen (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 또한, MDC 생성은 Human MDC ELISA duoset kit(R&D system, St.Louis, MO, USA)를 구입하여 사용하였다. Anti- STAT1 항체는 Becton Dickison (Sandiego, CA, USA)에서 구입하였고, Anti-phospho-STAT1 항체는 Cell signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 그리고 β- actin은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 또한 기타 시 약들은 모두 특급 시약을 사용하였다.
실험재료 − 본 연구에 사용한 해조류 80% 에탄올 추출물 시료는 제주 생물종다양성연구소에서 분양받았으며, 단박 추출물(JBRI 20349)은 처음 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹이고 세포배양 배지로 농도에 맞게 희석하여 사용하였다.
세포배양 – 사람 각질형성세포주인 HaCaT 세포는 제주 대학교 의학전문대학원 조문제 교수로부터 분양 받았고, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco BRL)과 1%의 Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Grand Island, NY) 를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, USA)을 세포배양액으로 사용하여 37oC, 5% CO2로 유지되 는 배양기에서 배양하였다. 세포의 계대 배양은 세포 배양 접시(culture dish) 면적의 약 80% 정도를 차지할 때까지 배 양한 후, 0.05%의 trypsin을 사용하여 세포를 배양플라스크 로부터 분리하였다. 그 다음 10% FBS와 1% Antibiotic- Antimycotic이 포함된 배양액으로 trypsin을 중화한 후, 원 심 분리하여 계대 배양하였다.
세포생존율 평가 − 단박 추출물에 의한 세포 독성 정도를 평가하기 위하여 HaCaT 각질형성세포(1.5×105 cells/mL)를 96 well plate에 동일하게 분주한 후 세포를 37oC, 5% CO2 항온기에서 18시간 동안 배양하였다. 그 다음 기존의 배지 를 제거하고, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)와 serial dilution 한 3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/mL 농도의 단박 추출물을 no serum DMEM 배지에 세포에 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각각의 배지에 MTT solution (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)을 10 µL씩 넣고 2시간 동안 37oC, 5% CO2 항온 기에서 배양하였다. 그 다음 각 well의 배지를 제거하고, 각 well당 DMSO를 50 µL씩 넣고, VersaMax ELISA microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)로 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)− HaCaT 각질형성세포(2.0×105 cells/mL)를 96 well plate에 접종하고, 세포를 18시간 동안 37oC, 5% CO2 배양기에서 전배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)와 단박 추출물(3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/mL)을 no serum DMEM 배지에 희석하여 동시 처리하였고, 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양액 내 MDC 생성은 각 well의 상층액을 이용하여 human MDC/CCL22 ELISA kit를 사용 Fig. 1. A photo of Ceramium boydenii.
하여 측정하였다. 표준곡선(standard curve)은 human MDC 를 이용하여 1,000 pg/mL에서부터 1/2씩 순차적으로 희석 하였다(serial dilution). 결과값 측정 시 광학밀도는 450 nm 파장에서 VersaMax ELISA microplate reader로 분석하였다.
Western Blot Analysis− HaCaT 각질형성세포를 60 mm culture plate에 5×105 cells/mL로 접종하여 10% FBS, 1%
Antibiotic-Antimycotic이 있는 DMEM 배지를 이용하여 18 시간 동안 전배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 plate에 각각 단박 추출물 3.13, 6.25, 12.5 µg/mL의 농도로 처리된 배지를 처리하여 2시간 동안 전처리 하였다. 그 후 각 조건 에 맞게 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)를 처리하여 15분 동안 자극하였다. 이렇게 처리된 세포를 차가운 phosphate buffered saline (PBS)를 사용하여 2번 세정 후, protein lysis buffer (basic lysis buffer: 50 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonident P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25µg/mL leupeptin)를 처리 하고 얼음 위에서 30분 동안 lysis하였다. 그 후 cell lysates 을 튜브에 담고, 원심분리(15000 RPM, 4oC, 15분)하여 cell down한 후 상등액만 분리하여 western blot analysis에 사용 하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 사 용하여 표준화하였고, 단백질정량은 bradford assay (Bio-rad, Herculers, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 동량의 lysate 를 8% mini gel sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 loading하여 변성 분리한 후, PVDF membrane (Bio-Rad)에 100mA로 약 2시간 동안 이식(transfer)하였다. 단백질이 옮겨진 membrane은 5%
skim milk blocking buffer (5% skim milk+TBS+0.1%
Tween 20)로 1시간 동안 실온에서 blocking하였고, 이어서 각각의 1차 항체(STAT1 1:1000, pSTAT1 1:1000, β-actin 1:5000)를 1% BSA/TTBS (TBS+0.1% Tween 20) 용액에 희석하여 처리한 다음 상온에서 30분 반응시킨 후 4oC, overnight (O/N) 하였다. 그 다음 상온에서 20분 반응시켰고 TTBS로 10분씩 3회 세정한 후, 2차 항체로는 horseradish peroxide (HRP)가 결합된 항-래빗 (anti-rabbit IgG)과 항-마 우스(anti-mouse IgG) 항체를 1:5000으로 희석하여 처리한 후 실온에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 면역반응이 완료 된 membrane은 TTBS로 5회 세정 후, WEST-ZOL plus western blot detection system (iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하여 발광시킨 다음 X-ray 필름에 감광시켜 확인하였다.
레이저초점 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy) 검사 − HaCaT 각질형성세포(1.0×105 cells/mL) 를 6-well plate에 유리 커버글라스를 넣고 접종하여 18시간 동안 전배양하였다. 그 후, 단박 추출물을 6.25, 12.5 µg/mL 의 농도로 2시간 전처리 한 다음 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)
로 세포를 30분 동안 자극하였다. 그 다음 배지를 제거한 후 에 세포가 있는 유리 커버글라스에 3.5% paraformaldehyde (PFA)를 넣어 30분 동안 세포를 고정시켰고, 과량의 aldehyde 를 제거하기 위하여 0.1M glycine을 15분간 처리하였다. 그 다음 0.1% Triton X-100을 10분 동안 처리하였고, 3%
BSA/0.1% triton X-100/PBS를 처리하여 1시간 동안 반응시 켰다. 세포와 항체를 반응시키기 위하여 1차 항체인 anti- STAT1를 1:200으로 희석하여 처리하여 4oC에서 overnight 하였다. 다음으로는 세포를 세정한 후에, DyLight488 conjugated donkey anti-rabbit secondary antibody를 1:300 으로 희석하여 처리하여 30분 동안 어두운 곳에서 반응시 켰다. 그 다음 세포를 세정하였고, 핵 염색과 유리 커버글 라스에 mounting을 위하여 VECTASHIELD Mounting Media with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 을 처리하였고, 매니큐어를 사용하여 커버글라스를 sealing 하였다. FV500 Confocal microscopy (OLYNPUSM Tokyo, Japan)로 형광 반응을 관찰하였다.
통계처리 − 본 연구의 통계처리는 Student’s t-test 분석을 이용하여 검정했으며, 값은 평균과 표준편차로 나타냈다.
Western blot에서 측정한 density는 Image J을 사용하여 확 인하였다.
결과 및 고찰
각질형성세포에서 세포 생존능에 대한 단박 추출물의 효 과 − 세포 생존능을 측정하는 것은 조직 배양과 세포 독성 연구에서 중요하다.16) 세포에 단박 추출물을 처리하여 활성 평가에 들어가기 앞서, 단박 추출물이 세포독성에 의하여 염증성 chemokine 생성이 억제될 가능성을 배제하기 위해 MTT assay 방법을 사용하였다. 세포에 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL) 와 함께 단박 추출물을 각각의 농도 별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay로 세포 생존능을 측정 하였다. 그 결과 단박 추출물을 처리한 각각의 농도에서 세 포에서 독성이 나타나지 않음을 확인 할 수 있었다(Fig. 2- A). 따라서 이후의 활성 평가 실험은 25 µg/mL 이하의 농 도에서 실시하였다. 즉 25 µg/mL 이하의 농도에서 나타나 는 단박 추출물의 활성은 세포사멸에 의해 chemokine 생성 이 감소하여 나타나는 것이 아니라 단박 추출물의 고유한 효과에 의하여 나타나는 것임을 의미한다.
각질형성세포에서 IFN-γ와 TNF-α로 유도되는 MDC 생 성에 대한 단박 추출물의 효과 − MDC/CCL22는 수지상세 포, B세포, 대식세포, 각질형성세포, 그리고 상피세포에서 지속적으로 생성되며, 특히 건강한 피부와 비교했을 때 아 토피 피부염의 표피층인 각질형성세포에서 MDC/CCL22를 발현한다.17,18)특히 IFN-γ 또는 IFN-γ와 TNF-α 로 자극한 각질형성세포에서 MDC 생성이 증가한다고 보고되었다.19,20)
염증성 chemokine인 MDC에 대한 단박 추출물의 억제효능 을 확인하기 위하여 HaCaT 각질형성세포에 단박 추출물 (3.13, 6.25, 12.5, 25µg/mL)과 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL) 을 처리하여 24시간 동안 배양하고, 배지에서 MDC의 농도 를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/
mL)와 단박 추출물을 각 농도 별로(3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/
mL) 동시 처리하였을 때, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)만 처 리한 그룹에서 418.6 pg/mL의 MDC가 생성된 반면, 단박 추출물을 처리한 그룹에서는 MDC의 생성이 단박 추출물 에 대하여 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 특히 12.5, 25µg/mL의 단박 추출물을 처리한 그룹에서는 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/mL)만 처리한 그룹과 비교하였을 때, 12.5µg/mL에서 222.9 pg/mL, 25 µg/mL에서 176.3 pg/mL 의 MDC 생성이 확인되어 단박 추출물로 인해 MDC 생성 이 감소된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2-B).
관련성 있는 연구로서, Furukawa 등이 발표한 논문에서 아토피 피부염환자에서 분리한 말초혈액의 단핵구 세포에
서 항알러지 약물인 olopatadine hydrochloride가 MDC 생 성을 억제하였으며,21) 2012년 김 등은 IFN-γ와 TNF-α로 자 극된 HaCaT 각질형성세포에서 Inulae Flos(선국화)가 MDC 생성을 억제한다고 보고하였다. 이러한 결과들은 면역세포 에서 염증관련 chemokine인 MDC 생성을 감소시키는 것이 알러지성 질환을 개선할 수 있음을 시사한다.
각질형성세포에서 IFN-γ와 TNF-α로 유도되는 STAT1의 활성화에 대한 단박 추출물의 효과 − IFN-γ와 TNF-α를 세 포에 자극시켰을 때 STAT1, Nuclear factor-κB (NF-κB) 등 과 같은 다양한 신호전달 경로를 활성화 시키며.23,24) 이러 한 STAT, NF-κB의 활성화가 MDC 등의 염증성 인자 생성 에 대한 주 기전으로 알려져 있다.25) 단박 추출물에 의한 농 도의존적인 MDC 생성 억제가 STAT1 신호전달기전과 관 련이 있는 지 확인하기 위하여 STAT1 인산화를 western blot 으로 확인하였다. HaCaT 각질형성세포에 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)를 처리했을 때, 인산화된 STAT1이 의존적으로
Fig. 2. Effect of Ceramium boydenii on the protein production of MDC in HaCaT human keratinocytes. (A) Cells were pre- incubated for 18 hr, and cell viability was determined from the cells treated with of Ceramium boydenii (3.13, 6.25, 12.5, 25µg/mL) for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. (B) Cells (2.0×105cells/mL) were pre-incubated for 18 hr, and MDC production was determined from the culture supernatant of cells stimulated by IFN-γ and TNF-α (10 ng/
mL) in the presence of Ceramium boydenii (3.13, 6.25, 12.5, 25µg/mL) for 24 hr. MDC production was measured by ELISA. The measurements of MDC were done in duplicate.
Data are presented as the mean±SD of three experiments.
*p<0.05, **p<0.01 compared to the IFN-γ and TNF-α alone.
Fig. 3. Effect of Ceramium boydenii on the phosphorylation and levels of STAT1 in IFN-γ and TNF-stimulated HaCaT human keratinocytes. (A) Cells (5.0×105 cells/mL) were pre- incubated for 18 hr. Expression of STAT1 phosphorylation was determined in cells stimulated by LPS (1µg/mL) for the indicated times. The phosphorylation of STAT1 proteins were determined by Western blotting of whole cell lysates with the indicated antibodies. (B) cells (5.0×105 cells/mL) were pre- treated with Ceramium boydenii (3.13, 6.25, 12.5µg/mL) for 2 hr. Cells were then stimulated with IFN-γ and TNF-α (10 ng/
mL) in the presence of Ceramium boydenii. The phosph- orylation of Tyr701 within the sequence of STAT1 was determined in cells stimulated by IFN-γ and TNF-α for 15 min. The phosphorylation of STAT1 and the level of STAT1 and β-actin proteins were determined by Western blotting of whole cell lysates with the indicated antibodies.
증가하였으며, IFN-γ와 TNF-α를 처리한지 15분에 인산화 가 가장 증가한 것을 확인하였다(Fig. 3-A). HaCaT 각질형 성세포에 단박 추출물을 6.25, 12.5, 25 µg/mL을 처리하여 2시간 동안 배양하고, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)를 15분 동안 처리한 후 단백질을 분리하여 STAT1의 인산화 정도 를 확인하였다. 결과 IFN-γ와 TNF-α 처리 후 증가된 STAT1 의 인산화는 단박 추출물 처리에 의해 농도 의존적 감소를 나타내었다(Fig. 3-B).
2011년 Kang 등은 제주 감귤 미숙과 추출물이 IFN-γ와 TNF-α로 자극된 HaCaT 각질형성세포에서 STAT1 인산화 의 억제를 통해 MDC의 생성을 저하시킨다고 보고하였으 며,26) 아토피 피부염 동물모델에서 감귤미숙과 추출물을 피 부에 도포하였을 때 다양한 아토피 증상들이 개선되었다고 보고한 바 있다.26) 이러한 연구들로부터 염증 유발의 신호 전달경로 중 하나인 STAT1을 염증성 질환 개선 소재 탐색 의 새로운 타겟으로 생각해볼 수 있다.
각질형성세포에서 IFN-γ와 TNF-α로 활성화되는 STAT 의 핵 내 전이에 대한 단박 추출물의 효과 − STAT은 핵 세 포질 수송 전사 인자로서, 활성화되지 않은 STAT1은 세포 질 내에 불활성 전구체의 형태로 격리되어 있다가 활성화 되면 tyrosine 인산화의 결과로 핵 내로 이동하여 DNA에
결합하는 친화력이 증가한다. 즉 STAT1의 DNA 결합이 증 가하면 핵에 축적되어 다양한 염증과 관련된 유전자 발현 을 유도한다.27,28)
앞선 결과에서 단박 추출물은 IFN-γ와 TNF-α의 자극으 로 유도된 STAT1 인산화를 감소시켰다(Fig. 3). 이러한 STAT1 인산화 감소가 STAT1 단백질의 핵 내 전이 감소로 결과하는지 확인하기 위하여 공초점 현미경을 이용한 간접 면역 형광법으로 영상을 분석하였다(Fig. 4). 외부 자극이 없 는 경우, STAT1 단백질이 세포질에 발현되었고, IFN-γ와 TNF-α(10 ng/mL) 처리 후 핵 내부에 STAT1 단백질 형광 이 나타나는 것을 확인하였다. 단박 추출물을 전처리 한 경 우, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)에 의한 STAT1 단백질의 핵 내 전이가 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, STAT1 인 산화를 강하게 억제했던 농도인 6.25, 12.5 µg/mL에서(Fig 3) STAT1이 세포질에 강한 형광을 나타낸 것으로 보아 단 박 추출물의 STAT1 인산화 억제는 핵 내 전이감소로 연결 된다는 것을 알 수 있다.
결 론
본 연구에서는 단박 추출물의 염증억제효과 및 그 활성기 Fig. 4. Effect of Ceramium boydenii on the Translocation of STAT1 in IFN-γ and TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes.
Cells (1.0×105 cells/mL) were pre-treated with Ceramium boydenii (6.25, 12.5µg/mL) for 2 hr. Then cells were stimulated with IFN-γ (10 ng/mL) and TNF-α (10 ng/mL) in the presence of Ceramium boydenii for 30min. Immunofluorescence stain of STAT1 was stained with FITC-rabbit anti-mouse IgG-conjugated 2nd antibody and the fluorescence was identified using confocal microscopy (FV500, OLYMPUS) and the images were acquired at constant PMT, gain, offset, magnification (40x oil immersion objective with zoom factor of 2.5) and resolution.
전을 밝히고자 각질형성세포인 HaCaT 세포에서 염증성 chemokine 생성억제 활성을 평가하였다.
단박 추출물은 IFN-γ와 TNF-α 자극으로 유도되는 MDC 생성을 농도의존적으로 억제하였으며, 이와 연결되는 신호 전달 경로인 STAT1의 인산화 및 핵 내 전이를 일관성 있 게 억제하였다. 이러한 결과는 단박 추출물이 STAT1 경로 억제를 통해 염증 억제효과를 발휘하며, 단박 추출물이 염 증성 피부질환의 예방 및 치료에 유용한 소재가 될 수 있음 을 시사한다.
사 사
이 논문은 교육과학기술부의 재원으로 한국연구재단의 지 원을 받아 수행된 연구이며(NRF-C1ABA001-2011-0021039) 이에 감사드립니다.
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(2013. 3. 27 접수; 2013. 5. 16 심사; 2013. 6. 10 게재확정)
