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2011 년 2 월 석사학위논문
고정화 효소를 이용한 alpha-ketoglutarate
생산공정 개발
조선대학교 대학원
화 학 공 학 과
안 영 덕
고정화 효소를 이용한 alpha-ketoglutarate
생산공정 개발
Production of α-Ketoglutarate using enzyme aggregated bioreactors
2011 년 2 월 25 일
조선대학교 대학원
화 학 공 학 과
안 영 덕
고정화 효소를 이용한 alpha-ketoglutarate
생산공정 개발
지도교수 이 중 헌
이 논문을 공학석사학위신청 논문으로 제출함.
2011 년 2 월
조선대학교 대학원
화 학 공 학 과
안 영 덕
안영덕의 석사학위논문을 인준함
위원장 조선대학교 교수 조 병 욱 (인) 위 원 조선대학교 교수 김 정 규 (인) 위 원 조선대학교 교수 이 중 헌 (인)
2011 년 2 월
조선대학교 대학원
I
목 차
ABSTRACT
제 1장 서론 ... 1
제 2장 실험재료 및 방법 ... 4
제1절 실험재료
... 4
제2절 GDH 특성분석
... 4
1. GDH 고정화
... 4
가. PANI제조 ... 4
나. PAMP제조... 5
다. PEIM 제조 ... 5
라. PAMP와 PEIM지지체에 L-glutamic dehydrogenase 고정 ... 5
2. 효소 고정화 특성
... 6
가. 효소 고정화... 6
나. 효소 정량 ... 6
3. pH 별 반응
... 6
II
4. 온도별 반응
... 6
5. 고정화 효소의 온도에 대한 안정성 조사
... 7
제 3절 ALPHA-KETOGLUTARATE 합성
... 7
1. 시약 및 기기
... 7
2. 자연효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate합성
... 8
3. Micro reactor에서 고정화 효소에 의한 Alpha- Ketoglutarate
... 8
4. Monolith reactor에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate
... 8
5. 고압 반응기에서 고정화 효소에 의한 Alpha- Ketoglutarate 합성
... 9
6. 고압 반응기에서 이온성 액체를 이용하여 고정화 효소에 의한
... 9
제 3 장 결과 및 고찰 ... 12
제 1절 GDH 특성 조사
... 12
1. 효소 고정화 능력.
... 12
2. pH별 반응
... 14
3. 최적 온도
... 16
4. 고정화 효소의 온도에 대한 안정성
... 18
제 2절 ALPHA-KETOGLUTARATE 합성
... 20
III
1. Microreactor에서 고정화 효소에 의한 Alpha-
Ketoglutarate 합성
... 20
가. Microreactor... 20
나. 온도 변화에 따른 반응 ... 22
다. 흐름속도에 따른 반응 ... 24
라. 일정온도에서 반응기 안정성 ... 26
마. 반응 후 회수한 고정화 효소 활성도 측정 ... 28
2. Monolith reactor에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합성
... 30
가. Monolith reactor 및 SEM 사진... 30
나. 담체 코팅여부 반응 및 온도 변화에 따른 반응 ... 33
다. 반응기 길이에 따른 반응... 36
3. 고압 반응기에서 고정화 효소에 의한 alpha- ketoglutarate 합성
... 38
가. 고압 반응기... 38
나. 기질농도 변화에 따른 반응... 40
다. 반응시간에 따른 반응 ... 42
라. 온도변화에 따른 반응 ... 44
마. 압력변화에 따른 반응 ... 46
4. 고압 반응기에서 이온성 액체를 이용하여 고정화 효소에 의한 Alpha-ketoglutarate합성
... 48
가. 이온성 액체의 특성... 48
나. 이온성 액체 첨가 압력 변화에 따른 반응 ... 49
다. 이온성 액체 첨가 온도 변화에 따른 반응 ... 51
IV
라. 이온성 액체 농도 변화에 따른 반응 ... 53
제 4장 결론 ... 55
참고문헌
... 56
V
List of figure
Figure 1. alpha-ketoglutarate synthesis from L-glutamic acid .... 3 Figure 2. Calibration curve for alpha-ketoglutarate concentration
... 10 Figure 3. Calivration curve for β-NADH concentration... 11 Figure 4. Loading capacity of immobilization media ... 13 Figure 5. Effect of pH on the activity of free and immobilized.... 15 Figure 6. Effect of temperature on the activity of free and
immobilized L-glutamic dehydrogenase... 17 Figure 7. Storage stability of immobilized L-glutamic
dehydrogenase 45℃ and pH 9.0... 19 Figure 8. microreactor configuration ... 21 Figure 9. Effect of temperature on conversion at microreactor .. 23 Figure 10. Effect of flow rate on conversion at microreactor ... 25 Figure 11. Storage stability of microreactor 45℃ and pH 9.0 .... 27 Figure 12. Effect of enzyme recycle on synthesis of ... 29 Figure 13. Monolith reactor configuration... 31 Figure 14. Monolith reactor SEM image ... 32 Figure 15. Effect of PANI coating and mo coating on conversion at monolithreator... 34 Figure 16. Effect of temperature on conversion at monolith
reactor... 35 Figure 17. Effect of reactor length on conversion at monolith
reactor... 37 Figure 18. High pressure reactor configuration ... 39
VI
Figure 19. Effect of initial glutamate on conversion at high
pressure ... 41
Figure 20. Effect of reaction time on conversion at high pressure ... 43
Figure 21. Effect of temperature on conversion at high pressure45 Figure 22. Effect of pressure on bioconversion ... 47
Figure 23. Effect of pressure on bioconversion ... 50
Figure 24. Effect of temperature on conversion ... 52
Figure 25. Effect of initial ionic liquid on conversion ... 54
VII
ABSTRACT
Production of α-Ketoglutarate using enzyme aggregated bioreactors
Ahn Young Deok
Advisor: Prof. Lee, Jung-Heon, PhD.
Department of Chemical Engineering.
Graduate School of Chosun University
α-Ketoglutarate (also called oxo-glutarate) is an important nitrogen acceptor in metabolism. It is produced by oxidative deamination of glutamate or reductive carboxylation of succinate. It has been used for the production of creatin-α-ketoglutarate which used as a fitness supplement. In this study, we developed a noble biotransformation reactor for α-ketoglutarate production using enzyme aggregated nanofiber reactor, micro reactor, monolith reactor and high pressure reactor for the development of biotransformation reactor. L-glutamic dehydrogenase was aggregated on the surface of nanofiber and used. The conversions of a micro reactor, monolith reactor and high pressure reactor were 20.1%, 20.3% and 53.0% respectively
VIII
1 제 1장 서론
Alpha-ketoglutarate는 글루타르산의 알파 위치에 케톤기가 붙어있 다. Glutamate의 탈아미노 반응에 의해 생성된 케토산이며 구연산 회로 의 중간 산물이다. 에틸옥살산과 에틸석신산의 축합반응으로 합성되며 생체 내에서는 유기산과 아미노산의 대사에서 중요한 역할을 하고 2- 옥소글루타르산 이라고도 한다. 미생물에서는 슈도모나스속의 발효에 의 해 글루코스로부터 케노글루콘산을 거쳐 합성된다. 생체 내에서는 TCA 회로 과정 중 시트르산 탈수소효소의 작용으로, 시트르산으로부터 수소 이탈과 탈카복시에 의해 생성된다. 이어서 alpha-ketoglutarate 탈수소 효소 복합체에 아미오기의 수용체로 작용하여 글루탐산이 된다. 글루탐 산 수소이탈효소에 의하여 글루탐산으로부터 산화적으로 탈아미노되어 생성되는 것도 알려져 있다. 본 연구에서 생성물과 반응물 Alpha- ketoglutarate와 L-glutamic acid 를 각각 1kg을 비교한다면 Alpha- ketoglutarate의 가치는 L-glutamic acid보다 26배 이상의 가치가 있 다. 또한 Alpha-ketoglutarate 합성 할 때 자석에 의해 반응조로부터 쉽게 회수 될 수 있는 고정화 효소를 사용함으로써 효소의 단점(활성이 불안정하고 반응 후 생성물과 효소의 분리가 어려우며 재사용이 불가 능)를 보안하고 공정의 경제성을 높일 수 있다. 여기서 고정화 효소 (immobilized enzyme)이란 효소단백질을 물에 녹지 않는 담체에 물리 적 또는 화학적 방법으로 부착시켜서 만든 물리적 촉매의 하나이다. 이 러한 효소 유도체는 안정성과 특이성이 높기 때문에 실질적으로 의학, 식품 또는 공업공정이나 폐기물 처리 등에 이용되고 있다. 본 연구는 L-glutamic dehydrogenase 효소를 이용하여 L-glutamic acid 의 탈 아미노 반응에 의해 alpha-ketoglutarate 생성하는데 목적을 두고 있 다. 본 연구에서는 alpha-ketoglutarate 를 생성하기 위해 Micro 반응 기와 Monolith 반응기, 고압반응기를 사용하였으며 이온성 액체를 이용 하여 전환율을 높이고자 하였다. Micro 반응기와 Monolith 반응기는 채
2
널과 세공이 마이크로미터 크기로 넓은 비표면적 덕분에 작은 크기의 장치임에도 열 및 물질 전달에 더 효율적이며 결과적으로 화학 반응의 선택도와 수율을 더욱 향상시킬 수 있다. 고압반응기는 초고압 상태에서 반응하여 기질 저해 반응에 변화를 주어 전환율을 높일 수 있다.
Alpha-ketoglutarate 합성은 많은 연구자에 의하여 연구되어 왔으나, 높은 효소농도를 사용함에도 불구하고 반응속도와 수율이 낮다. 따라서 본 연구에서는 고정화 효소를 반응기에 코팅시켜 alpha-ketoglutarate 를 합성하고 가장 바람직한 효소반응 공정을 제시하였고 alpha- ketoglutarate 높은 생산 수율로 혁신적인 생산공정이 될 것으로 전망 된다.
3
O O
O O
O
OH OH
OH OH NH2
L-glutamic acid
alpha-ketoglutarate + H2O + NAD+
+ NH3 + NADH
L-glutamic dehydrogenase
Figure 1. alpha-ketoglutarate synthesis from L-glutamic acid
4 제 2장 실험재료 및 방법
제1절 실험재료
본 연구에서는 L-glutamic dehydrogenase solution(Sigma Type 1, From Bovine Liver) 를 고정화 할 효소로 사용하였고, 고정화 할 지 지체로 polyanilin, polyethyleneimine-modifide magnetite을 사용하였 으며, 효소 활성측정을 위한 기질로서는 L-glutamic acid(JUNSEI)를 사용하였고, 조효소로는 NAD(β-Nicotinamide adenine dinucleotide(Flukar))사용하였다. 또한 본 연구에서는 Ammonium sulfate buffer(Sigma), Tris-HCl(Sigma), Protein assay kit(Bio- red), Alpha-ketoglutarate assay kit(Bio vision), 1-Butyl-3- methylimidazolium Tetrafluoroborate, 1-Butyl-3- methylimidazolium Hexafluorophosphate 등 시약을 사용하였다. 사용 한 기기로는 반응온도 유지를 위해 Thermo mixer(Fine mould precision znd.co), enzyme activity를 측정하기 위해 UV-visible spectrophotometer(Amersham)을 사용하였다. 또한 반응기 반응을 위 해 Multi pressure bomb reactor(㈜ 리액션 엔지니어링), LC-20AT (SHIMADZU), Refrigerated bath Circulator, syringe pump (HARVARD APPARATUS PHD 2000, New. Era pump systems. Inc) 를 사용하였다
제2절 GDH 특성분석 1. GDH 고정화
가. PANI제조
Polyaniline nanofiber를 제조하기 위해서 ammonium peroxo disulfate 0.1% (w/w) 와 aniline 용액(1M HCl용액)을 격렬하게 섞는 다. 고분자 중합 반응에 의해 nanofiber가 만들어지면 nanofiber내에
5
있는 HCl용액을 제거하기 위해 4번 이상 증류수로 씻어낸다. 제조된 시 료는 사용을 위해 냉장 보관하였다.
나. PAMP제조
자석으로 분리가 가능한 polyaniline nanofiber의 제조를 위해서 시약상 에서 구입한 iron oxide 나노입자를 고분자 중합 시 첨가하여 반응을 시켜 polyaniline중합 시 nanoparticle등이 끼워 들어가는 형태 또는 nanoparticle표면에 polyaniline이 coating 되는 형태의 자석에 의해 분 리가 가능한 나노입자 또는 nanofiber의 제조가 가능하였다. 이렇게 제조된 nanofiber는 증류수로 4번 이상 씻은 다음 효소의 고정화를 위 해 냉장고에 보관하였다.
다. PEIM 제조
자석으로 분리 가능한 polyethyleneimine nanoparticle 제조하기 위해 iron(II)와 iron(III) chloride 의 화학적 공침을 통하여 제조 가능하였다. 이렇게 제조된 nanoparticle 를 dry oven 에서 건조시켜 powder 형태로 보관하였다.
라. PAMP와 PEIM지지체에 L-glutamic dehydrogenase 고정
각각의 5ml vial 에 PAMP, PEIM 을 넣는다. L-glutamic dehydrogenase 50μl(9.8mg protein/ml)를 pH 7.0 인 500mM ammonium sulfate buffer 900μl 에 용해한 다음 이 효소용액 1ml 을 취하여 각각의 PAMP, PEIM 이 들어있는 5ml vial 에 첨가하여 실온에서 200rpm 으로 30 분간 반응시킨다. Glutaraldehyde 를 넣고 2 시간 후 상등액을 버리고 100mM sodium phosphate buffer 로 200rpm 에서 30 분 동안 세척한 후 더 이상의 효소가 떨어져 나오지 않을 때까지 세척과정을 5~10 회 반복한다.
6 2. 효소 고정화 특성
가. 효소 고정화
L-glutamic dehydrogenase 50μl(9.8mg protein/ml)를 pH 7.0 인 500mM ammonium sulfate buffer 900μl 에 용해여 PAMP 와 PEIM 지지체에 각각 고정화 하여 효소활성을 측정한다.
나. 효소 정량
효소 고정화 반응 후 잔존 효소 정량은 증류수 790μl와 sample 10μl 와 200μl의 Brad ford reagent를 혼합하여 595nm에서 흡광도 를 측정한 후 검량곡선을 이용하여 정량 하는 Bradford method를 사용 하였다. 검량곡선은 Bovine serum albumin(BSA)로 작성하였다.
3. pH 별 반응
L-glutamic dehydrogenase 와 PAMP-GDH, PEIM-GDH 의 pH 에 따른 영향을 조사하기 위해서 기질로써 50mM L-Glutamic acid 와 조효소로는 NAD 가 이용되었고, pH 의 조절은 200mM Tris- HCl 를 이용하여 pH 5~12 까지 바꿔가면서 유리되는 alpha- ketoglutarate 을 kit 를 이용하여 570nm 흡광도를 측정하였다.
4. 온도별 반응
L-glutamic dehydrogenase 와 PAMP-GDH, PEIM-GDH 의 온도의 영향 조사를 위해 pH 를 L-glutamic dehydrogenase 의 최적 pH 9.0 으로 고정하고, Thermo mixer(THERMO FINEMIXER 2000- DX, SHFINEMOULD PRECISION IND., CO.)를 이용하여 온도를 25℃~65℃로 바꿔가면서 유리되는 alpha-ketoglutarate 을 kit 를 이용하여 570nm 흡광도를 측정하였다.
7
5. 고정화 효소의 온도에 대한 안정성 조사
pH 를 L-glutamic dehydrogenase 의 최적 pH 9.0 으로 고정하고, storage temperature 를 45℃ batch 상태에서 10 시간 동안 PAMP- GDH 활성을 측정하는 방법으로 안정성을 조사하였다.
제 3절 Alpha-Ketoglutarate 합성 1. 시약 및 기기
Alpha-ketoglutarate 를 합성하기 위한 효소로는 L-glutamic dehydrogenase (Type I, From Bovine Liver , sigma)를 기질로는 L- glutamic acid 를 사용하였으며 조효소로는 NAD(β-Nicotinamide adenine dinucleotide(Flukar)) 사용하였다. 또한 반응 buffer 로는 pH9.0 인 200mM Tris-HCl 를 사용하였다. 반응에서 유리되는 NADH 을 측정하기 위해 UV-visible spectrophotometer(Amersham)을 사용하였다. Microreactor 는 Thermo micromixer(Mxi4t)에서 온도유지를 하였다. 반응물은 syringe pump (HARVARD APPARATUS PHD 2000)를 사용하여 주입하였으며 흐름의 속도를 변화시켜주며 반응 시켰다. Monolith reactor 는 GC capillary column DW-WAX 로 자체 제작한 반응기이다. 온도 유지를 위해 Thermo micromixer(Mxi4t)를 사용하였으며 반응물 주입은 syringe pump (New. Era pump systems. Inc)를 사용하였다. syringe pump 를 이용하여 흐름 속도를 변화해가며 반응 시켰다. 고압반응기 반응은 Multi pressure bomb reactor(㈜ 리액션 엔지니어링)반응기를 사용하였으며 반응기 압력변화는 LC-20AT (SHIMADZU)이용하여 변화를 주었으며 Refrigerated bath Circulator 로 온도변화를 주었다.
또한 고압반응기 에서 이온성 액체의 영향을 보기위한 실험으로 이온성 액체는 1-Butyl-3-methylimidazolium Tetrafluoroborate 과 1- Butyl-3-methylimidazolium Hexafluorophosphate 두가지 이온성
8
액체를 사용하였다. 반응기에서 합성된 alpha-ketoglutarate 는 alpha- ketoglutarate assay kit(Bio-vision)를 이용하여 UV 570nm 에서 측정하였다.
2. 자연효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate합성
반응온도가 45℃로 유지된 4ml vial 반응기에서 효소 반응계를 구성(Tris-HCl buffer/L-glutamic acid/NAD(10:4:3))하고 효소농도를 10μl(9.8mg protein/ml)로 하여 alpha-ketoglutarate 를 합성하였다. 3, 6, 9, 12, 24, 32 시간에 시료 0.2ml 을 채취하여 -70℃
냉동 보관 후 alpha-ketoglutarate 농도를 분석하였다.
3. Micro reactor 에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합성 L-glutamic dehydrogenase 가 고정화된 PAMP 와 PEIM 지지체를 microreactor channel 80 개중 27 개에 packing 하여 반응기를 만든 후 효소 반응계를 구성하였고 반응 온도와 흐름속도를 변화시키며 alpha-ketoglutarate 를 합성하였다. 최종 생성물의 농도 관점에서 두 담체를 비교하였다.
4. Monolith reactor 에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합성
GC capillary column 인 DB-WAX column 를 40cm, 60cm 그리고 10cm 씩 20 개를 한 묶음으로 하여 반응기를 만든 후 담체 PANI 로 coating 한 다음 L-glutamic dehydrogenase 효소로 고정화하여 반응기를 제작하였다. Thermo micromixer 을 이용하여 반응 온도를 변화시켜 주었으며 유량의 변화는 syringe pump 를 이용하여 변화시키며 alpha-ketoglutarate 를 합성 하였다. 최종 생성물인 alpha-ketoglutarate 는 kit 을 이용하여 분석하였다.
9
5. 고압 반응기에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합성 Multi pressure bomb reactor 반응기에 효소 고정화된 담체 PAMP, PEIM 를 기질과 조효소를 함께 넣어 반응을 유도하였다. LC-20AT Pump 를 이용하여 압력을 변화 시켜주었으며 Refrigerated bath Circulator 로 온도변화와 온도 유지를 하여 Alpha-Ketoglutarate 를 합성하였다.
6. 고압 반응기에서 이온성 액체를 이용하여 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합성
Multi pressure bomb reactor 반응기에 효소 고정화된 담체 PAMP, PEIM 를 기질과 조효소를 함께 넣어 주고 1-Butyl-3- methylimidazolium Tetrafluoroborate, 1-Butyl-3- methylimidazolium Hexafluorophosphate 두가지 이온성 액체를 농도별로 넣어주어 반응을 유도하였다. LC-20AT Pump 를 이용하여 압력을 변화 시켜주었으며 Refrigerated bath Circulator 로 온도변화와 온도 유지를 하여 Alpha-Ketoglutarate 를 합성하였다.
10
Alpha-ketoglutarate [mM]
0 2 4 6 8 10 12
O D _ 57 0n m
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Figure 2. Calibration curve for alpha-ketoglutarate concentration
11
NADH(mM)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
O D _3 40 n m
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
y = 0.19124x+0.02218 r2 = 0.9989
Figure 3. Calivration curve for β-NADH concentration
12 제 3 장 결과 및 고찰
제 1절 GDH 특성 조사 1. 효소 고정화 능력.
Figure 4. 에서 보는 바와 같이 PAMP 와 PEIM 의 양을 각각 달리하여 L-glutamic dehydrogenase 50μl (9.8mg/ml)씩 같은 양의 효소를 넣어 고정화 시킬 경우 PAMP 담체는 5mg, 20mg 일때 보다 2mg 일 때 상대적으로 높은 활성을 보였으며 PEIM 담체는 5mg 일 때 보다 20mg 일 때 상대적으로 높은 활성을 나타냈다. PAMP 는 담체의 양이 증가하여고 고정화 능력이 별 차이가 없어 그중에서도 활성이 가장 높은 2mg 를 사용하였으며 PEIM 담체는 활성이 좋은 20mg 의 양을 사용하여 담체에 고정화 하여 사용하였다.
13
0 10 20 30 40 50 60 70
0 20 40 60 80 100 120
PAMP2mg_GDH PAMP5mg_GDH PAMP20mg)GDH PEIM5mg_GDH PEIM20mg_GDH
Reaction Time (hr)
R el a ti ve a ct iv it y( % )
Figure 4. Loading capacity of immobilization supports
14 2. pH별 반응
L-glutamic dehydrogenase 및 고정화 효소 PAMP-GDH, PEIM-GDH 의 기질 L-glutamic acd 에 대한 pH 영향을 Figure 5 에 나타내었다. pH 별 완충액에 있어서의 활성비교를 pH5~12 까지의 범위 내에서 pH2,3 의 간격으로 반응을 진행시킨 후, pH 변화에 따른 활성 변화를 관찰하였다. PAMP-GDH, PEIM-GDH 의 경우 비교적 염기성영역에서 최대의 활성을 나타내고 있으며 중성, 산성으로 갈수록 활성이 저하되었다. pH 최적 활성 조건은 pH9.0 으로서 자연 효소와 동일하였으나 중성과 산성 영역에 있어서는 자연 효소에 비하여 상대적으로 높은 효소활성을 나타내어 효소의 고정화로 인해 pH 에 대한 안정성이 높아졌음을 확인하였다. 고정화 효소의 활성은 pH 에 따라 자연효소와 차이가 나는 경우가 많다고 알려져 있다. 이것은 대부분의 담체가 어느 정도 전하를 띠고 있으므로 그로 인하여 반응용액(macroenvironment)의 pH 와 고정화 효소가 있는 미세환경의 pH 가 서로 다르기 때문이다.
15
pH
pH3 pH5 pH7 pH9 pH12
R e la ti ve a c ti vi ty (% )
0 20 40 60 80 100 120
PAMP-GDH PEIM-GDH Free-GDH
Figure 5. Effect of pH on the activity of free and immobilized
L-glutamic dehydrogenase at 37℃
16 3. 최적 온도
자연 효소 및 고정화 효소의 기질 L-glutamic acdi에 대한 활성의 반 응온도에 대한 영향을 Figure 6에 나타냈는데 고정화 효소의 효소 활성 의 최적 온도 조건은 45℃로써 자연 효소와 동일한 것으로 나타났다.
온도에 대한 안정성은 자연 효소의 경우 35℃에서 60%, 45℃에서 100%, 55℃에서 90%의 활성을 보였으며 PEIM-GDH의 경우 35℃에 서 73%, 45℃에서 100%, 55℃에서 98%의 활성을 보였다. 그러나 PAMP-GDH 의 경우 35℃에서 80%, 45℃에서 100%, 55℃에서 91%
의 활성을 보여 자유 효소와 PEIM-GDH 고정화 효소와 달라 온도에 영향을 조금 받는 것으로 보여졌다.
17
Temperature
25℃ 35℃ 45℃ 55℃ 65℃
R el at iv e ac ti v it y( % )
40 50 60 70 80 90 100 110
PAMP-GDH PEIM-GDH Free-GDH
Figure 6. Effect of temperature on the activity of free and immobilized L-glutamic dehydrogenase
18 4. 고정화 효소의 온도에 대한 안정성
고정화 효소 PAMP-GDH, PEIM-GDH 의 기질 L-glutamate 에 대한 시간별 농도를 Figure 7. 에 나타내었다. 시간에 따른 농도변화 측정은 200mM Tris-HCl buffer(9.0), 온도는 45℃ 에서 10 시간 동안 반응하였을 때 시간에 따른 alpha-ketoglutarate 의 변화를 측정하였다. 1hr 반응 시켰을 때 3% 전환율을 보였으며 2 시간에서 10 시간까지 점점 전환율이 높아지는 것을 관찰 할 수 있었다. PAMP 담체와 반응된 NADH 를 OD-340nm 에서 측정한 결과 시간이 경과할수록 NADH 의 OD 값이 낮아지는 경향을 볼 수 있었다. 조효소 NAD 가 NADH 로 생성되면서 PAMP 담체에 흡착되어 OD 값이 떨어지게 되는 것이다. PEIM 담체 반응에서는 PAMP 와 달리 OD 값이 높아진다. 이러한 결과로 보았을 때 NADH 는 PAMP 담체에 잘 흡착되는 것을 확인할 수 있었다.
19 Time (hr)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Conversion(%)
0 5 10 15 20 25
(Conversion)PEIM (Conversion)PAMP
NADH (OD_340nm)
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 (NADH)PEIM
(NADH)PAMP
Figure 7. Storage stability of immobilized L-glutamic dehydrogenase 45℃ and pH 9.0
20 제 2절 Alpha-ketoglutarate 합성
1. Microreactor에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합성 가. Microreactor
Microreactor는 80개의 채널 중 27개의 V홈이 파여있는 채널에 효 소가 고정화 되어있는 담체를 흡착시켜 반응기를 만든다. 약8mg의 담 체를 흡착하였다. 반응물과 Buffer 조효소를 주사기에 넣어 주사기 펌 프를 이용하여 반응을 시켰다. 채널에 흡착되어있는 담체들이 반응하며 생성물과 함께 유출되지 않도록 반응기 아래에 자석을 두어 담체를 반 응기에 흡착 될 수 있도록 하였다. 반응기의 온도는 Thermo micromixer(Mxi4t)를 이용하여 반응을 유지하거나 변화시켜 반응하였 다. Microreactor는 반응물이 효소와 접촉하는 시간이 많아지고 반응 공간이 좁기 때문에 다른 인자들의 방해를 덜 받는다는 장점이 있다.
21
Figure 8. microreactor configuration
22 나. 온도 변화에 따른 반응
Microreactor를 제작하여 Thermo micromixer(Mxi4t)넣어 온도 변화를 주었다. 온도의 변화는 25℃, 45℃, 65℃ 변화를 주며 0.5시간 부터 3시간 까지의 분액을 받아 생성물의 농도를 측정하였다. 먼저 25℃일 때 0.5시간에서는 생성물의 전환율은 10.40%, 1시간일 때 12.98%, 1.5시간일 때 13.37%, 2시간일 때 16.11%, 2.5시간일 때 16.11%, 3시간일 때 16.36% 의 전환율을 보였다. 그리고 45℃ 일때 전환율은 0.5시간일 때 11.93%, 1시간일 때 17.46%, 1.5시간일 때 19.37%, 2시간일 때 20.34%, 2.5시간일 때 20.68%, 3시간일 때 21.34% 의 전환율을 보였으면 65℃일 때 전환율은 0.5시간일 때 12.71%, 1시간일 때 12.50%, 1.5시간일 때 14.08%, 2시간일 때 14.40%, 2.5시간일 때 14.53%, 3시간일 때 15.15% 의 전환율을 보였 다. 전환율을 비교한 결과 45℃ 일 때 가장 좋은 전환율을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 다른 조건의 시험들도 일정온도를 45℃로 하였다.
23
Reaction Time(hr)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
C o n ve rs o n (% )
0 5 10 15 20
25 25 'C
45 'C 65 'C
Figure 9. Effect of temperature on conversion at microreactor
24 다. 흐름속도에 따른 반응
Microreactor 반응은 PAMP, PEIM두 담체로 나누어 흐름 속도 별로 생성물을 측정하였다. 반응의 온도는 45℃로 일정하게 유지하였고 반응물의 최적pH는 9.0으로 맞추어 반응하였다. PAMP로 코팅하여 반 응시킨 결과 흐름속도가 1ml/hr, 2ml/hr, 3ml/hr, 4ml/hr, 5ml/hr,10ml/hr,20ml/hr, 30ml/hr 일 때 각각 반응물 전환율은 13.26%, 17.56%, 13.65%, 10.64%, 6.06%, 5.06%, 5.78%, 6.26% 로 측정되었다. 2ml/hr일 때 가장 좋은 전환율을 보였고, 그 이후 흐름속도 가 빨라지는 반응에서는 생성물 전환율에 낮아지는걸 볼 수 있었다. 담 체 PEIM 를 코팅하여 반응시킨 결과로 흐름속도가 1ml/hr, 2ml/hr, 3ml/hr, 4ml/hr, 5ml/hr,10ml/hr,20ml/hr, 30ml/hr 일때 각각 반응물 전환율은 17.95%, 19.97%, 16.46%, 13.16%, 12.06%, 14.72%, 10.00%, 8.18%로 측정되었다. PAMP와 동일하게2ml/hr일 때 가장 좋 은 전환율을 보였고 흐름속도가 빨라질수록 생성물 전환율이 점점 낮아 지는 경향을 보였다. 결과적으로 PAMP보다 PEIM 담체를 코팅하였을 때 더 좋은 생성물을 생성할 수 있다는 결과를 얻게 되었다
25
Flow rate
1ml/hr 2ml/hr 3ml/hr 4ml/hr 5ml/hr 10ml/hr 20ml/hr 30ml/hr
C o n ve rs io n (% )
0 5 10 15 20 25
PAMP PEIM
Figure 10. Effect of flow rate on conversion at microreactor
26 라. 일정온도에서 반응기 안정성
Microreactor 의 일정온도에서 반응기 안정성을 보기 위한 실험을 하였다. 반응기 온도는 45℃ 로 일정하게 7 일 동안 반응시켰다. 1 일째 생성물의 전환율은 22.25% 2 일째 20.33% 3 일째 14.34% 4 일째 11.42% 5 일째 9.31% 6 일째 7.61% 7 일째 5.34% 전환율을 나타내었다. 1 일과 7 일째 전환율을 비교해보면 22%에서 5% 로 약 17%가 감소되었음을 확인하였다. 반응기가 열에 대한 안정성이 약간 떨어지긴 하지만 이것은 고정화된 효소의 안정성으로 생각해보면 자유효소보다 안정성이 좋다고 볼 수 있다.
27
Rreaction Time(Day)
1 2 3 4 5 6 7
Conversion(%)
0 5 10 15 20 25
Figure 11. Storage stability of microreactor 45℃ and pH 9.0
28
마. 반응 후 회수한 고정화 효소 활성도 측정
Microreactor 에 코팅되어 있었던 두 담체 PAMP, PEIM 를 반응 종결후 다시 회수 하여 활성도를 측정하였다. 0시간부터 8시간까지 측 정하였으며 PAMP반응 8시간 반응 후 측정 활성도를 상대적 결과로 보 았다. PAMP담체의 경우 0시간 때 71.12%, 1시간 때 71.12%, 2시간 때 76.90%, 3시간 때 80.18%, 4시간 때 85.69%, 5시간 때 85.69%, 6시간 때 85.69%, 7시간 때 93.96%, 8시간 때 100% 상대적 전환율 을 보였다. PEIM 담체의 경우 0시간 때 59.44%, 1시간 때 56.69%, 2 시간 때 62.46%, 3시간 때 58.39%, 4시간 때 59.44%, 5시간 때 61.67%, 6시간 때 65.09%, 7시간 때 68.37%, 8시간 때 74.67상대적 전환율을 보였다. 두 담체 모두 반응 종결 후에도 높은 활성도를 나타내 었다. 이것은 고정화된 효소가 재 사용 능력이 있다는 것을 보여주고 있 다.
29
0 2 4 6 8 10
0 20 40 60 80 100 120
PAMP_GDH PEIM_GDH
Reaction Time (hr)
C o n v e rs io n (% )
Figure 12. Effect of enzyme recycle on synthesis of
alpha-ketoglutarate
30
2. Monolith reactor에서 고정화 효소에 의한 Alpha-Ketoglutarate 합 성
가. Monolith reactor 및 SEM 사진
Monolith reactor 는 GC acpillary column DB-WAX column 을 사용하여 반응기를 제작하였다. DB-WAX column 은 실리카 물질로 충진되어 있어 고정화 담체와 효소를 흡착시킬 수 있다. 반응기의 크기는 20cm, 40cm, 60cm 그리고 10cm 씩 20 개를 한 묶음으로 하여 반응기를 제작하였고 여기에 담체와 효소를 고정화 하였다.
Thermo micro mixer 을 이용하여 반응 온도를 변화시켜 주었으며 유량의 변화는 syringe pump 를 이용하여 변화시키며 alpha- ketoglutarate 를 합성하였다. 반응기의 단면을 절단하여 SEM(scanning electron microscope) 주사 전자 현미경으로 확인한 결과 반응기 1 개의 외경은 356μm 였으며 내경은 308μm 크기를 측정 할 수 있었다. 그리고 반응기 안쪽 벽면에 담체와 효소가 고정화 되어있는 것을 확인 할 수 있었다.
31
Figure 13. Monolith reactor configuration
32
Figure 14. Monolith reactor SEM image
33
나. 담체 코팅여부 반응 및 온도 변화에 따른 반응
Monolith reactor 의 길이를 40cm 로 하여 PANI담체 코팅 여부 에 따라 반응기를 제작하여 생성물을 합성하였다. 코팅된 반응기는 PANI 담체를 충분히 흘려준 다음 효소를 흘려보내 담체에 효소가 고정 화될 수 있도록 하였다. 다른 반응기는 담체를 흘려주지 않고 효소만 흘 려보네 컬럼 자체에 효소가 고정화될 수 있도록 하였다. 최적온도는 45℃ 로 하였고 최적 pH는 9.0으로 하였으며 흐름속도는 1ml/hr 로 하여 두 반응기를 반응시켰다. 그 결과 담체로 코팅한 반응기는 20.25%의 전환율을 나타내었으며 ,코팅되지 않은 반응기는 5.71% 전 환율을 나타내었다. 결과로 봤을 때 코팅하지 않은 반응기에서도 전환율 이 나타나였으나 담체로 코팅한 반응기에서 더 좋은 전환율을 관찰할 수 있었다. 이 결과 Monolith reactor는 PANI 담체로 코팅하여 사용하 여야 더 좋은 전환율을 얻을 수 있다.
Monolith reactor를 온도 변화에 따라 반응하였다. 온도 변화는 25℃, 45℃, 65℃ 로 하였으며 흐름속도는 1ml/hr로 하여 반응 시켰다.
25℃에서 전환율은 9.35%, 45℃ 17.35%, 65℃ 5.45% 의 전환율을 나타내었다. 전환율을 비교한 결과 45℃ 일 때 가장 좋은 전환율을 관 찰할 수 있었으며 다른 조건의 시험들도 일정온도를 45℃로 하여 실험 하였다
34
coating no coating
Conversion(%)
0 5 10 15 20 25
Figure 15. Effect of PANI coating and mo coating on conversion at monolithreator
35
Temperature
25℃ 45℃ 65℃
Conversion(%)
0 5 10 15 20
Figure 16. Effect of temperature on conversion at monolith reactor
36 다. 반응기 길이에 따른 반응
Monolith reactor 길이를 40cm와 60cm 그리고 10cm반응기를 20개를 묶음으로 하여 다발 반응기를 제작하여 실험하였다. 최적온도는 45℃ 로 하였고 최적 pH는 9.0으로 하였으며 흐름속도는 1ml/hr 로 하여 실험하였다. 40cm반응기에서 체류시간이 2시간 일 때 10.40% 전 환율을 보였으며 체류시간이 1시간 일 때 8.34% 전환율, 30분 일 때 7.60% 전환율을 보였다. 60cm반응기에서 체류시간이 2시간 일 때 13.51% 전환율을 보였으며 체류시간이 1시간 일 때 11.01% 전환율, 30분 일 때 7.06% 전환율을 보였다. 다발 반응기에서 체류시간이 2시 간 일 때 20.71% 전환율을 보였으며 체류시간이 1시간 일 때 15.32%
전환율, 30분 일 때 10.62% 전환율을 보였다. 단일 반응기보다 다발 반응기에서 더 좋은 전환율을 보였다. 체류 시간이 짧아질수록 전환율도 함께 감소하는걸 볼 수 있었다.
37
Resident time
2hr 1hr 30min
Conversion(%)
0 5 10 15 20 25
40cm 60cm 10cm*20
Figure 17. Effect of reactor length on conversion at monolith reactor
38
3. 고압 반응기에서 고정화 효소에 의한 alpha-ketoglutarate 합성 가. 고압 반응기
고압반응기는 Multi pressure bomb reactor(㈜ 리액션 엔지니어링) 에서 제조한 반응기를 사용하였으며 총 3개의 반응기로 되어있다. 반응 기의 크기는 25ml 정도이며 최고 4000psi 까지 가할수 있다. 반응기의 고압은 LC-20AT (SHIMADZU)를 사용하였다. 반응기 안에 자석막대 를 넣어두고 반응기 외부에서 교반기를 만들어 교반하여 주었다. 반응기 안에 고정화된 효소를 넣어주고 반응물로 압력을 가하여 반응시켰다. 고 압 반응기는 반웅물에 고압을 가하여 내부온도를 상승시켜 효소반응을 촉진하는 장점이 있다.
39
Figure 18. High pressure reactor configuration
40 나. 기질농도 변화에 따른 반응
고압반응기에서 반응 buffer와 조효소의 농도는 변화하지 않고 기질 의 농도만을 변화하여 실험 하였다. 기질의 농도는 담체별로 10mM, 30mM, 50mM로 하여 실험을 하였으며 최종 반응물에서의 기질의 농도 는 각각 2.4mM, 7.1mM, 11.8mM 이였다. 고정화 담체 PEIM-GDH를 사용하였을 때 기질의 농도가 10mM일때는 전환율은 86.39%, 30mM 일 때는 35.76%, 50mM 일 때는 46.48% 였다. 그리고 고정화 담체 PAMP-GDH를 사용하였을 때 기질의 농도가 10mM 반응에서 전환율 은 84.68%, 30mM일 때는 51.21%, 50mM 일 때는 45.75% 였다.
반응 결과 10mM 이상에서 기질의 저해 반응이 일어나 전환율이 감소 하는 것을 알게 되었다.
41
Glutamic acid concentration
10mM(f.c:2.4) 30mM(f.c:7.1) 50mM(f.c:11.8)
C o n ve rs io n (% )
0 20 40 60 80
100 (Conversion)PEIM (Conversion)PAMP
N A D H ( O D _ 3 4 0n m )
0 1 2 3 4 (NADH)PEIM 5 (NADH)PAMP
Figure 19. Effect of initial glutamate on conversion at high pressure
42 다. 반응시간에 따른 반응
고압반응기에서 시간에 변화를 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 9시간의 변 화를 주어 생성물의 전환율을 확인하였다. 반응온도는 45℃ 를 유지하 였으며 반응 압력은 3000psi를 가하여 반응하였다. 먼저 고정화된 담체 PEIM-GDH를 넣어 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 9시간 반응하였다. 각 각의 전환율은 30.48%, 39.24%, 45.31%, 44.13%, 46.69% 를 나타냈 었다. 두번째 반응으로 고정화된 담체 PAMP-GDH 를 넣어 1시간, 2 시간, 3시간, 6시간, 9시간 반응하였다. 각각의 전환율은 25.68%, 36.53%, 41.95%, 42.57%, 44.76% 를 나타냈었다. 두 담체 모두 2시 간 이후 3시간부터 45%로 일정한 전환율을 보였다.
43
Reaction time
1hr 2hr 3hr 6hr 9hr
C o n ve rs io n (% )
0 10 20 30 40 50 60
(Conversion)PEIM (Conversion)PAMP
N A D H (O D _ 3 4 0n m )
0 2 4 6 8 10 (NADH)PEIM
(NADH)PAMP
Figure 20. Effect of reaction time on conversion at high pressure
44 라. 온도변화에 따른 반응
고압반응기에서 온도에 따라 반응하였다. 온도의 변화는 15℃, 30℃, 45℃, 70℃, 85℃ 하였고 반응 압력은 3000psi로 하였으며 반응시간은 3시간으로 하여 반응하였다. 고정화된 담체 PEIM-GDH를 사용하여 반 응시킨 결과 15℃, 30℃, 45℃, 70℃, 85℃ 에서 각각 21.22%, 25.94%, 46.48%, 37.40%, 17.79% 의 전환율을 보였다. 다음은 고정화된 담체 PAMP-GDH를 사용하여 반응시킨 결과 15℃, 30℃, 45℃, 70℃, 85℃
에서 각각 36.88%, 33.96%, 45.75%, 21.63%, 18.89% 의 전환율을 보였다. 두 담체 모두 45℃ 에서 좋은 전환율을 보였으며 PEIM-GDH 고정화 담체는 낮은 온도에서는 전환율이 낮은 반면 높은 온도에서는 전환율이 좋았다. 그러나 PAMP-GDH 고정화 담체는 낮은 온도에서 전환율이 좋은 반면 높은 온도에서는 전환율이 낮았다. 그 이유는 높은 온도에서 담체들의 링크들이 풀렸기 때문이다. 실험 결과 낮은 온도에서 는 PAMP담체를 높은 온도에서는 PEIM 담체를 쓰는게 좋다고 보여진 다.
45
Temperature
15℃ 30℃ 45℃ 70℃ 85℃
C o n ve rs io n (% )
0 10 20 30 40 50
(Conversion)PEIM (Conversion)PAMP
N A D H ( O D _ 3 4 0n m )
0 1 2 3 4 5 (NADH)PEIM (NADH)PAMP
Figure 21. Effect of temperature on conversion at high pressure
46 마. 압력변화에 따른 반응
고압 반응기에서 압력 변화에 따른 실험을 하였다. 압력의 변화는 14.69psi 에서부터 1000psi, 2000psi, 3000psi 까지 변화를 주어 실험 하였다. 고정화 담체 PEIM-GDH를 사용하였을 때 14.69psi압력에서는 6.91%전환율을 보였으며 1000psi일 때는 17.79%, 200psi 일 때는 18.06%, 3000psi일 때는 53.20%전환율을 보였다. 고정화 담체 PAMP-GDH를 사용하였을 때 14.69psi압력에서는 7.91% 전환율을 보였으며 1000psi일 때는 21.99%, 200psi 일 때는 42.62%, 3000psi 일 때는 45.29% 전환율을 보였다. 압력이 높아짐에 따라 두 담체 모두 전환율이 증가함을 보였다.
47
Pressure
14.69psi 1000psi 2000psi 3000psi
C o n ve rs io n (% )
0 10 20 30 40 50 60
(Conversion)PEIM (Conversion)PAMP
N A D H (O D _ 3 4 0n m )
0 1 2 3 4 5 6 7 8
(NADH)PEIM (NADH)PAMP
Figure 22. Effect of pressure on bioconversion
48
4. 고압 반응기에서 이온성 액체를 이용하여 고정화 효소에 의한 Alpha-ketoglutarate합성
가. 이온성 액체의 특성
이온성 액체는 두 개의 이온으로 결합된 간단한 용액으로 소수성의 유기물, 무기물, 고분자를 녹일 수 있는 특성을 나타낸다. 효소반응에서 부 반응을 억제하여 수율을 향상시키고 보조용매로 사용되어 효소의 선택성을 높인다. 그리고 아주 낮은 증기압을 가지는 특성을 이용하여 재사용 및 재활용을 쉽게 할 수 있다. 이러한 장점을 이용하여 1- Butyl-3-methylimidazolium Tetrafluoroborate [bmim][BF4]와 1- Butyl-3-methylimidazolium Hexafluorophosphate [bmim][PF6] 두 이온성 액체를 선택하여 고압 반응기에서 반응하였다.
49
나. 이온성 액체 첨가 압력 변화에 따른 반응
두 이온성 액체를 사용하여 고압반응기에서 압력 변화를 주어 반응하 였다. 먼저 [bmim][BF4] 이온성 액체를 사용한 결과 14.69psi에서 6.91% 전환율을 나타내었으며 1000psi 일 때는 9.69%, 2000psi 일 때는 15.82%, 3000psi 일 때는 20.21% 전환율을 보였다. 그리고 [bmim][PF6] 이온성 액체를 사용한 결과 14.69psi에서 7.48% 전환 율을 나타내었으며 1000psi 일 때는 7.91%, 2000psi 일 때는 10.16%, 3000psi 일 때는 16.35% 전환율을 보였다. 압력이 증가함에 따라 두 이온성 액체모두 전환율이 증가함을 보였으며 [bmim][PF6]보다 [bmim][BF4] 이온성 액체에서 더 좋은 전환율을 보였다.
50
Pressure
14.69psi 1000psi 2000psi 3000psi
C o n ve rs io n (% )
0 5 10 15 20 25
BF4
PF6
Figure 23. Effect of pressure on bioconversion
51
다. 이온성 액체 첨가 온도 변화에 따른 반응
두 이온성 액체를 사용하여 고압반응기에서 온도 변화를 주어 반응하였다. 먼저 [bmim][BF4] 이온성 액체를 사용한 결과 15℃에서 7.02% 전환율을 나타내었으며 30℃ 일 때는 14.08%, 45℃ 일 때는 21.22%, 60℃ 일 때는 9.19%, 75℃ 일 때는 8.07% 전환율을 보였다.
그리고 [bmim][PF6] 이온성 액체를 사용한 결과 15℃에서 7.16%
전환율을 나타내었으며 30℃ 일 때는 8.92%, 45℃ 일 때는 18.84%, 60℃ 일 때는 9.60%, 75℃ 일 때는 7.75% 전환율을 보였다. 온도 변화에 따른 반응에서 온도가 45℃ 일 때 두 이온성 액체 모두 좋은 변환율을 보였으며 [bmim][PF6]보다 [bmim][BF4] 이온성 액체에서 더 좋은 전환율을 보였다.
52
Temperature
15℃ 30℃ 45℃ 60℃ 75℃
C o n ve s io n (% )
0 5 10 15 20 25
BF4 PF6
Figure 24. Effect of temperature on conversion
53 라. 이온성 액체 농도 변화에 따른 반응
두 이온성 액체를 반응물에서의 농도를 변화시켜 고압반응기에서 반 응시켰다. 먼저 [bmim][BF4] 이온성 액체를 0.5ml, 1ml, 1.5ml 씩 각 각 넣어 반응시킨 결과 16.60%, 16.10%, 21.22% 변환율을 보였다. 그 리고 [bmim][PF6] 이온성 액체를 0.5ml, 1ml, 1.5ml 씩 각각 넣어 반 응시킨 결과 19.39%, 18.84%, 18.43% 변환율을 보였다. 농도 변화에 따른 변환율의 변화에는 큰 영향을 주지는 않았다.
54
Ionic liquid loading volume
0.5ml 1ml 1.5ml
C o n ve rs io n (% )
0 5 10 15 20 25
BF4
PF6
Figure 25. Effect of initial ionic liquid on conversion
55 제 4장 결론
PEIM, PAMP, PANI 3 개의 담체에 L-glutamic dehydrogenase 효소를 고정화 하여 반응물과 함께 반응시겼으며 Microreactor, Monolithreactor, High pressure reactor 반응기를 이용하여 alpha- ketoglutarate 전환율을 확인하였다. Batch 상태 최적조건 45℃
반응에서 시켰을 때 최고 전환율은 18.3% 였으며 `최고 전환율에 도달하기까지 반응시간은 5 시간 이였다. Microreactor 에서 최적 온도 45℃, 체류시간 2 시간일 때 최고 전환율은 20.1% 였으며 최고
전환율에 도달하기까지 반응시간은 2 시간 이였다. 그리고
Monolithreactor 에서 최적 조건 45℃, 체류시간 2 시간 일 때 최고 전환율은 20.3% 였으며 최고 전환율에 도달하기까지 반응시간은 2 시간 이후였다. 반응기 반응 중 가장 좋은 전환율을 보인 High pressure reactor 최적 조건 45℃, 3000psi 에서 무려 53%까지의 전환율을 보였으며 최고 전환율에 도달하기까지 반응시간은 3 시간 이후였다. 기존 연구된 alpha-ketoglutarate 합성 전환율이 최고 20%
였음을 고려할 때 고정화 효소를 이용한 고압 반응기 반응 공정은 매우 효과적임을 볼 수 있었다.
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저작물 이용 허락서
학 과 화학공학과 학 번 20097070 과 정 석 사 성 명 한글: 안 영 덕 한문: 安 永 德 영문: AHN Young Deok
주 소 광주 광역시 광산구 신가동 866-17번지 연락처 E-mail : lifetime1019@lycos.co.kr
고정화 효소를 이용한 alpha-ketoglutarate 생산공정 개발
논문제목 Development of synthesis the alpha-ketoglutarate using enzyme aggregated nanofiber
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동의여부 : 동의(●) 반대( ) 2011 년 2 월
저 작 자 : 안 영 덕 (서명 또는 인)
조선대학교 총장 귀하
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