산수유 에탄올 추출물의 식중독 및 식품 부패 세균에 대한 항균 활성 분석
전연희1․박미혜1․김미라2†
1경북대학교 식품영양학과, 2경북대학교 식품영양학과․장수생활과학연구소
Antibacterial Activity of the Ethanol Extract from Cornus officinalis against Some Bacteria Related to Foodborne Illness and Food Spoilage
Yeon-Hee Jeon1, Mi-Hye Park1 and Meera Kim2†
1Dept. of Food Science and Nutrition, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea
2Dept. of Food Science and Nutrition, Center for Beautiful Aging, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea
Abstract
The antibacterial activity of the ethanol extract of Cornus officinalis against some bacteria related to foodborne illness and food spoilage was investigated. In the case of the disc diffusion assay, clear zones due to the inhibition of proliferation by Cornus officinalis extract were 8.5～18.3 mm at 4,000 μg/disc. The inhibitory effect of Cornus officinalis was as follows:
Escherichia. coli ≥ Listeria monocytogenes ≥ E. coli O157:H7 > Bacillus cereus > Staphylococcus aureus > Pseudomonas aeruginosa > Salmonella typhimurium. In addition, the MIC of Cornus officinalis extract toward B. cereus was the lowest at 1,000 ppm. The extract inhibited the growth of E. coli, L. monocytogenes, E. coli O157:H7, and Bacillus cereus throughout the growth stage. However, the growth of P. aeruginosa, S. aureus, and S. typhimurium was only inhibited by the extract during the lag phase. The constituents of all cells tested were released, especially E. coli and E. coli O157:H7. Observation of the cells using SEM demonstrated a morphological change and disruption of cells in response to treatment with Cornus officinalis extract. Based on these findings, the ethanol extracts of Cornus officinalis showed strong antimicrobial activity against all tested bacteria, indicating that Cornus officinalis can be a useful natural antimicrobial reagent.
Key words : Cornus officinalis, antibacterial, disc diffusion, MIC, SEM.
†Corresponding author : Meera Kim, Tel : +82-53-950-6233, Fax : +82-53-950-6229, E-mail : [email protected]
서 론
최근 국민소득의 증가 및 생활양식의 향상과 더불어 건강 한 생활을 영위하고자 하는 욕구가 강해지면서 소비자들의 안전한 식품에 대한 관심과 수요 증가로 식품 가공산업 및 기능성 식품 시장의 규모도 지속적인 성장 추세에 있다. 따 라서 식품 가공 및 저장 과정에서 식품 위생과 안전성을 확 보하기 위해 여러 가지 첨가물이 사용되고 있으나, 대부분의 첨가물은 화학 합성품으로 안전성에 대한 문제가 제기되고 있다. 이로 인해 천연식품에서 추출한 천연 소재에 대한 관 심이 증대되고 있으며, 특히 민간에서 사용되어 효능이 입증 된 재료들의 생리활성을 연구하여 기능성식품으로서 개발하 기 위한 여러 연구들이 수행되었다(Lee & Shin 1991, Lee et al 2002, Chung et al 2000, Kwon et al 2009). 천연물의 항균 성에 대한 연구들을 통해 동․식물 내의 단백질과 효소 및 유 기산, 식물의 정유성분과 색소 등이 천연 항균 물질로 보고
되었고(Larry & David 1989), phenolic acid와 flavonoid 화합 물 등의 phytochemicals도 항균력을 가지는 물질로 보고되었 다(Jang et al 2007, Kim et al 2007a).
산수유(Cornus officinalis)는 예로부터 한방에서 이용되는 약용식물로 가을에 익은 열매의 씨를 뽑아내 햇볕에 말린 것 을 이용하며, 다뇨․요통․이명․폐결핵 등의 치료 효과 및 신경안정․이뇨 작용․혈압강하 작용․항암 활성 등의 효능 을 가진 것으로 알려져 있다(Park et al 1995, Chung et al 1993). 산수유는 ursolic acid, tartaric acid, malic acid, citric acid, succinic acid 등의 유기산과 glucoside를 함유하고 있다 고 보고되었으며(Lee et al 1999, Kim et al 2003a), 산수유의 항산화 활성과 항당뇨, 항염증 작용 및 열수추출물에 대한 항균 활성 등의 생리활성에 대한 연구도 보고되었다(Seo et al 1999, Dai et al 1992). 본 연구에서는 안전성이 인정되어 생약재료와 식품가공재료로 상용되고 있는 약용식물인 산수 유의 에탄올 추출물이 식중독균과 식품 부패 세균에 미치는 항균 활성 및 세포 구조 변화를 탐색하여 천연 항균 소재로 서 산수유의 이용 가능성에 대해 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 실험 재료
1) 시약
실험에 사용된 액체 및 고체 배지(nutrient broth, nutrient agar, tryptic soy broth)는 Acumedia Co.(Michigan, USA)에서 구입하였고, dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Ducksan Chemical Co.(Kyungkido, Korea)로부터 구입하였으며, 실험에 사용된 모든 시약 및 증류수는 멸균 또는 syringe filter(Advantec 0.2 μm, Japan)를 이용하여 제균한 후 사용하였다.
2) 실험재료 및 추출물 제조
대구 약령시 한약방에서 음건된 형태로 시판되는 국내산 산수유 한약규격품을 구입하여 냉장보관하며 추출하여 시료 로 사용하였다. 분쇄한 시료 100 g에 70% 에탄올 2 L를 가하 여 실온에서 12시간 진탕한 후, 여과지(Advantec. Toyo No.
2)로 여과한 여과액은 감압 농축(EYELA, Rikakikai Co., Ja- pan)하였다. 농축된 시료는 동결 건조(Bondiro, Ilsin Lab Co., Korea)한 후, 20℃에서 냉동 보관하며 실험에 사용하였다.
3) 실험 균주
시료의 항균 활성 측정을 위해 식중독 관련 균주인 Bacillus cereus(KCTC 1012), Escherichia coli(KCTC 1682), Escheri- chia coli O157:H7(ATCC 43894), Listeria monocytogenes(KCTC 3569), Pseudomonas aeruginosa(KCTC 1750), Salmonella ty- phimurium(KCTC 2515), Staphylococcus aureus(KCTC 1916) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korea)에 서 구입하여 계대배양하며 사용하였다. L. monocytogenes는 Tryptic soy broth를 이용하였고, 다른 균주들은 nutrient broth 를 이용하여 배양하였다.
2. 항균성 측정
1) 생육저해환 측정
Disc diffusin assay를 이용하여 각 균주의 생육저해환을 측정하였다(McFarland J 1907, Bauer et al 1966, Kwak et al 2002). 즉, 12시간 배양한 미생물 배양액의 흡광도가 0.3이 되도록 배지를 이용하여 희석하였고, 희석한 미생물 배양액 100 μL를 nutrient agar plate에 도말하여 2시간 동안 고착시 켰다. 여기에 멸균된 paper disc(∅ 6 mm, Advantec, Japan)를 얹고, 각 paper disc에 농도별 시료를 20 μL씩 분주하였다.
시료를 첨가한 plate를 37℃의 incubator에서 24시간 배양하 여 paper disc 주위에 생성된 clear zone의 크기를 통하여 시
료의 항균 활성을 측정하였다.
2) 최소저해농도(Minimum inhibition contcentration, MIC) 측정
Demircia et al(2008)의 방법에 따라 96-well plate를 이용한 micro-well dilution법으로 미생물에 대한 시료의 최소 저해 농 도를 측정하였다. 각 균에 적합한 액체 배지를 이용해 37℃
에서 12시간 동안 배양한 미생물 배양액을 흡광도가 0.13이 되도록 희석한 후, 각 well에 100 μL씩 분주하였다. 각 well 에 최종 농도가 4,000 ppm, 2,000 ppm, 1,000 ppm, 500 ppm 이 되도록 시료 100 μL를 첨가한 후 ELISA reader(Tecan- Sunrise, Komabiotech, Australia)를 이용해 600 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 측정된 96-well plate는 37℃에서 24시간 배 양 후 동일한 파장에서 흡광도를 측정하여 흡광도의 증가가 나타나지 않는 시료의 최소 농도를 확인하였다.
3) 생육저해도 측정
멸균된 용기에 시료 1 mL를 첨가하여 최종 농도가 1,000 ppm, 3,000 ppm이 되도록 조절한 후, 흡광도가 0.3이 되도록 희석한 미생물 배양액 100 μL를 첨가하여 최종 부피를 30 mL로 하였다. 37℃ shaking incubator에서 24시간 동안 진탕 배양하며, 4시간 단위로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미 생물 생육에 미치는 시료의 영향력을 측정하였다(Davidson
& Parish 1989, Cho & Kim 2003, Oh et al 1999).
4) 세포 성분 유출 측정
Turgis et al(2009)의 방법에 따라 각 균을 액체배지에 대수 증식기까지 37℃에서 선배양한 후 원심분리와 0.1 M phosphate buffer saline(PBS, pH 7.0)를 이용한 세척을 통하여 균체만을 수집하였다. 수집된 균체는 0.1 M PBS 100 mL에 접종하고, 산수유 에탄올 추출물을 각 균의 MIC와 동일한 농도로 첨가 하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 전과 후의 PBS 균액 을 필터(pore size 0.22 μm)로 여과하여 260 nm에서 각각의 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로는 산수유 에탄올 추출물 을 첨가하지 않고 동일한 방법으로 배양한 PBS균액을 사용 하였다.
5) 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 측정
액체배지에 각 균을 선배양한 배양액 1 mL와 최종 농도가 1,000 ppm이 되도록 산수유 에탄올 추출물을 첨가하여 최종 부피를 10 mL로 조절한 후 12시간 배양하였다. 배양된 균액 을 원심분리하여 상층액을 제거한 후 0.1 M PBS(pH 7.2)로 세척하였다. 2% glutaraldehyde를 이용하여 냉장온도에서 2
시간 동안 균을 고정하고 0.1 M PBS를 이용하여 세척한 후 1% osmium tetroxide에 2시간 처리 후 ethanol을 이용하여 탈 수하였다. 그 후, isoamylacetate에 12시간 처리 후 gold coa- ting하여 FE-SEM(S4300, Hitachi, Japan)으로 측정하였다. 대 조군은 시료를 제외한 배지에서 배양한 후 동일한 방법으로 처리하여 측정하였다(Turgis et al 2009, Kim & Kim 2012).
3. 통계 분석
본 연구의 통계처리는 SPSS(version 18.0) 프로그램의 one- way ANOVA와 Student’s t-test를 실시하여, p<0.05 수준에 서 평균 결과 값의 유의차를 검정하였다.
결과 및 고찰
1. 생육저해환 측정
산수유 에탄올 추출물의 항균력을 평가하기 위하여 시료 를 첨가하여 미생물을 배양하였을 때 미생물의 생육저해로 인해 나타나는 clear zone의 크기를 측정하는 disc diffusion 법을 이용하였다. 식중독이나 식품부패와 관련된 7가지 균주 에 대한 산수유 에탄올 추출물의 항균 활성을 측정하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다. 산수유 에탄올 추출물의 농도가 짙어질수록 각 미생물에 대한 생육 저해환의 크기가 증가하 는 양상이 나타남으로써 추출물이 항균 활성을 가지고 있음 을 확인할 수 있었으나, 각 균주에 대한 생육저해환의 크기 가 다양하게 나타나 7가지 균주에 대한 산수유 에탄올 추출 물의 항균 활성은 균주마다 차이가 있는 것으로 확인되었다.
산수유 에탄올 추출물은 실험에 사용된 추출물의 농도 중 가 장 높은 농도인 4,000 μg/disc에서 E. coli ≥ L. monocytogenes
≥ E. coli O157:H7 > B. cereus > S. aureus > P. aeruginosa
Table 1. Clear zone of Cornus officinalis ethanol extract against microorganisms by disc diffusion assay (Unit: mm)
Microorganism Concentration (μg/disc)
500 1,000 2,000 3,000 4,000
Bacillus cereus 6.3±0.21)B2)c3) 7.3±0.6Bc 8.5±0.8Cbc 11.0±2.2Bab 12.0±1.9Ba
Escherichia coli 7.2±0.6Ad 10.7±0.5Ac 13.8±0.8Ab 16.7±1.4Aa 18.3±0.9Aa
Escherichia coli O157:H7 6.2±0.2Bd 7.3±0.8Bd 12.8±0.5ABc 14.7±1.0Ab 16.3±0.5Aa
Listeria monocytogenes 6.0±0.0Bd 6.0±0.0Cd 11.7±0.5Bc 16.7±0.2Ab 18.2±0.2Aa
Pseudomonas aeruginosa 6.3±0.2Bd 6.8±0.5BCcd 7.8±0.5CDbc 8.2±0.6Cb 9.5±0.7Ca
Staphylococcus aureus 6.0±0.0Bc 6.0±0.0Cc 7.3±0.2CDbc 8.3±0.5Cb 10.3±1.2BCa
Salmonella typhimurium 6.0±0.0Bc 6.0±0.0Cc 6.7±0.6Dbc 7.5±0.4Cab 8.5±0.7Ca
1) Mean±S.D. of triplicated experiments.
2) A～D Mean in the column with different superscripts (capital letter) are significantly different at p<0.05.
3) a～d Mean in the row with different superscripts (small letter) are significantly different at p<0.05.
> S. typhimurium 순으로 항균 활성을 나타내어 E. coli 에 대 한 항균 활성이 가장 높게 나타났다. S. typhimurium에 대한 항균 활성은 다른 균에 대한 항균력보다 약하게 나타났으나, 7가지 균주에 대해 6.2～18.3 mm의 뚜렷한 생육저해환을 나 타냄으로써 전체적으로 높은 항균 활성을 보였다. 산수유 에 탄올 추출물의 모든 농도에서 E. coli와 E. coli O157:H7에 대한 생육저해환의 크기가 유의적으로 크게 나타났고, 고농 도에서는 L. monocytogenes에 대한 생육저해환이 유의적으 로 크게 나타나, 산수유 에탄올 추출물의 이 세 가지 균에 대 한 항균 활성이 큰 것으로 나타났다. 산수유 에탄올 추출물 이 뚜렷한 생육저해환을 나타낸 균주 중 Gram (+)인 L. mo- nocytogenes와 Gram ()인 E. coli O157:H7의 생육저해환을 Fig. 1에 제시하였다. Fig. 1에서 제시된 바와 같이 산수유 에 탄올 추출물의 농도가 짙어질수록 각 균주에서 선명한 생육 저해환이 나타났고, 환의 크기가 커져 산수유 에탄올 추출물 의 높은 항균력을 확인할 수 있었으며, Gram ()균과 (+)균 모두에서 항균력이 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, Kim
E. coli O157:H7 L. monocytogenes
Fig. 1. Disc diffusion of Cornus officinalis ethanol extract against E. coli O157:H7 and L. monocytogenes.
①: 500 μg/disc, ②: 1,000 μg/disc, ③: 2,000 μg/disc, ④: 3,000 μg/disc, ⑤: 4,000 μg/disc.
et al(1999)이 연구한 천연물에 대한 항균 결과에서 복분자 메탄올 추출물이 B. cereus와 L. monocytogenes에 대한 생육 저해환을 나타나지 않았으나, 본 연구의 산수유 에탄올 추출 물은 L. monocytogenes에 대해서도 생육저해환을 보임으로 써 산수유 에탄올 추출물이 좀 더 다양한 식중독균에 대해 항균 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 전체적으로 산수 유 에탄올 추출물이 실험 균주들에 대해 뚜렷한 생육저해환 을 나타냄으로써 다양한 식품 위해성 세균들에 대해 높은 항 균 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
2. 최소저해농도 측정
앞의 disc diffusion 실험을 통해 산수유 에탄올 추출물이 식 중독 및 식품 부패 관련 세균에 대해 높은 항균력을 가지고 있음을 확인한 후, 이들 세균의 생육을 저해시키는 최소저해 농도인 MIC를 측정하였으며, 그 결과는 Table 2와 같다. 산 수유 에탄올 추출물은 본 연구에서 사용된 농도 범위(500～
4,000 ppm)에서 S. typhimurium에 대해서는 일부 생육 저해만 을 나타내었으나, 다른 모든 균에 대해서는 완전한 생육 억 제 효과를 나타내었다. 산수유 에탄올 추출물의 E. coli와 E.
coli O157:H7의 생육에 대한 최소저해농도인 MIC는 2,000 ppm, P. aeruginosa 및 S. aureus의 생육에 대한 MIC는 4,000 ppm으로 나타나 paper disc에 의한 항균 측정 결과에서와 같 이 E. coli와 E. coli O157:H7에 대한 항균 활성이 매우 큰 것 으로 나타났다. Chun et al(2003)에 의해 보고된 산수유 헥산 추출물의 항균 연구에서 일부 fraction의 P. aeruginosa에 대 한 MIC가 250～1,000 ppm으로 나타나, 본 연구에서 사용된 산수유 에탄올 추출물보다 높은 항균성을 나타내었으나, 일
Table 2. Minimum inhibitory concentration (MIC) of etha- nol extract from Cornus officinalis against some foodborne illness and food spoilage microorganisms
Microorganism
Growth at various
concentration MIC (ppm) 500
ppm 1,000
ppm 2,000
ppm 4,000
ppm
Bacillus cereus +3) 1,000
Escherichia coli ++ + 2,000
Escherichia coli O157:H7 ++ + 2,000
Listeria monocytogenes + + 2,000
Pseudomonas aeruginosa ++ ++ + 4,000
Staphylococcus aureus ++ ++ + 4,000
Salmonella typhimurium ++ ++ + + >4,000
1) ++: Growth, +: Inhibition of microorganism, : No growth.
부 fraction은 P. aeruginosa에 대한 MIC가 >1,000 ppm으로 나타났고, S. aureus에 대해서는 모든 fraction의 MIC가 >1,000 ppm으로 나타나, 산수유 헥산 추출물의 사용된 농도 내에서 는 항균활성이 없는 것으로 보고되었다. 이는 본 연구에서 산수유 에탄올 추출물이 두 균주에 대해 4,000 ppm의 MIC 를 나타낸 결과와 부합하는 것이었다. 또한 Kim et al(2003b) 에 의해 연구된 산수유 과육 에탄올 추출물의 B. cereus, S.
aureus, E. coli, S. typhimurium에 대한 MIC 측정에서는 이들 이 모두 0.25 mg/mL(250 ppm)의 MIC를 갖는 것으로 나타 나, 본 연구에서 사용된 에탄올 추출물보다 저농도에서 항균 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 이는 본 연구에서 산수 유 에탄올 추출물이 E. coli에 대해 가장 높은 항균 활성을 나타낸 것과는 상이한 양상이었다. 이렇게 여러 연구에서 세 균에 대한 항균 활성에 차이를 보이는 것은 각 연구마다 사 용된 시료의 전처리와 실험 방법이 동일하지 않고, Jeon et al(2012), Tabak et al(1996) 등에 의해 보고된 바와 같이 배 양에 사용된 배지의 물리적 형태가 다른 경우 추출물의 확산 정도에 영향을 미치기 때문인 것으로 사료된다.
3. 생육저해도 측정
산수유 에탄올 추출물이 각 균주의 생육 단계에 미치는 영향을 확인하기 위하여 24시간 동안 각 세균의 생장곡선을 측정하였다(Fig. 2). 산수유 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군은 각 균의 특성에 따라 유도기를 거친 후 미생물의 균체 증식을 나타내는 흡광도의 증가가 지속적으로 나타나 대부분의 균주는 12시간 부근에서 최대대수기를 나타내며 정지기로 접어들었다. 그러나 산수유 에탄올 추출물을 1,000 ppm, 3,000 ppm의 농도로 처리한 처리군에서는 대조군과는 달리 균주의 성장이 억제된 곡선 형태가 나타났다. 1,000 ppm의 산수유 에탄올 추출물을 처리한 균주의 생육곡선은 대부분 대조군과 유사하여 뚜렷한 생육 저해 효과가 나타나 지 않았으나, B. cereus, E. coli O157:H7에 대해서는 유도기 연장 및 대수기와 정지기에서 일부 생육 억제가 나타나 산수 유 에탄올 추출물의 항균 활성이 확인되었다. 3,000 ppm의 산수유 에탄올 추출물을 처리한 P. aeruginosa와 S. typhimu- rium에 대해서는 유도기 연장 및 대수기 동안 균의 증식 억 제가 나타났으나, 대수기 후기에는 뚜렷한 생육 저해 효과가 나타나지 않았다. 그러나 B. cereus, E. coli, E. coli O157:H7 및 L. monocytogenes에 대해서는 3,000 ppm의 산수유 에탄올 추출물 처리 시 24시간 동안 흡광도가 증가되지 않는 완전한 생육억제가 나타났다. 이는 Seo et al(1999)에 의해 보고된 산 수유의 물 추출물과 메탄올 추출물이 생육 저해를 나타낸 최 소 농도인 30 μL(15,000 ppm)보다 현저히 낮은 농도에서 생 육 저해를 나타낸 것으로 산수유 에탄올 추출물이 이들 균주 에 대해 물이나 메탄올 추출물보다 더 강한 항균 활성을 가
Fig. 2. Growth curve of foodborne illness and food spoilage microorganisms treated with Cornus officinalis ethanol extract.
지고 있음을 알 수 있었다.
4. 세포 성분 유출 측정
산수유 에탄올 추출물이 균주의 세포 변화에 미치는 영향 을 확인하고자 대수증식기에 수집된 균체의 세포 성분 유출 에 대한 시료의 영향력을 흡광도를 이용하여 측정하였다 (Fig. 3). 산수유 에탄올 추출물을 처리한 군의 초기 흡광도 와 24시간 후의 흡광도를 측정하였고, 산수유 에탄올 추출물 을 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 이용하여 처리군의 흡 광도를 보정하였다. 그 결과, 7가지 균주 모두 산수유 에탄올 추출물 처리 24시간 후 흡광도의 증가를 나타내었고, P. ae- ruginosa를 제외한 나머지 균주에서 유의적으로 흡광도의 증 가가 나타나(p<0.05), 산수유 에탄올 추출물이 세포 성분 유 출에 영향을 미치는 것으로 보였다. 각 균에 대한 산수유 에
Fig. 3. Effect of Cornus officinalis ethanol extract on cell- constituent release of foodborne illness and food spoilage microorganisms.
* p<0.05, ** p<0.01.
탄올 추출물의 처리 농도는 각 균의 MIC에 해당하는 농도로 산수유 에탄올 추출물의 처리 농도가 균주마다 상이하므로 산수유 에탄올 추출물이 각 균의 세포 성분 유출에 미치는 영향력을 절대적으로 비교하기는 어려우나, E. coli와 E. coli O157:H7의 흡광도가 급격히 증가하여 가장 많은 세포 성분이 유출된 것으로 나타났고, B. cereus와 S. typhimurium, S.
aureus, L. monocytogenes에서도 다량의 세포 성분 유출이 일 어난 것으로 나타났다. 오미자 에탄올 추출물에 의한 세균의 세포 성분 유출 연구 결과에서도 E. coli와 E. coli O157:H7 의 세포 성분 유출 정도가 가장 큰 것으로 나타나(Kim &
Kim 2012) 본 연구와 유사한 결과를 나타내었으나, 오미자 에탄올 추출물에서는 세포 성분 유출 정도가 Gram (+)보다 Gram () 균주들에게서 더 크게 나타난 반면, 산수유 에탄올 추출물에서는 Gram (+)와 Gram () 균주들 사이에 특별한 차이가 나타나지 않았다.
5. 주사전자현미경 관찰
실험에 사용된 균주의 세포 구조에 미치는 산수유 에탄올 추출물의 영향을 확인하기 위하여 산수유 에탄올 추출물을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 세포를 주사전자현미경으 로 관찰하였다. Gram (+) 균주인 S. aureus와 Gram () 균주 인 E. coli의 세포 형태를 측정한 결과를 Fig. 4와 Fig. 5에 각 각 나타내었다. 10,000배로 확대 관찰한 산수유 에탄올 추출 물 무처리군의 E. coli는 분열 중인 세포를 제외한 대부분의 세포가 온전한 단간균의 형태를 보여주었으나, 산수유 에탄 올 추출물 처리군에는 파괴된 세포 형태와 균체 외부에 잔해 들이 많이 분포하는 것으로 나타났다. 50,000배로 확대 측정 한 E. coli에서도 산수유 에탄올 추출물 처리군에서는 세포의
Magnification ×10,000
Not treated Treated
Magnification ×50,000
Not treated Treated
Fig. 4. Scanning electron micrographs of E. coli treated with Cornus officinalis ethanol extract.
Magnification ×10,000
Not treated Treated
Magnification ×50,000
Not treated Treated
Fig. 5. Scanning electron micrographs of S. aureaus treated with Cornus officinalis ethanol extract.
형태가 파괴된 것을 뚜렷하게 볼 수 있었다. S. aureus의 주 사전자현미경 측정 결과 또한 E. coli와 같이 산수유 에탄올 추출물 무처리군에서는 구형의 세포 형태를 유지하며 잔여 물이 없는 깨끗한 균체의 외부 공간을 나타내었으나, 산수유 에탄올 추출물 처리군에서는 세포의 크기가 균일하지 못하 고 구형이 완전 또는 일부 파괴된 형태를 나타내었으며, 균
체 외부 공간에 다량의 잔해들이 관찰되었다. 이는 Seo et al (1999)에 의한 산수유 물 추출물의 E. coli O157에 대한 주사 전자현미경측정 결과와 동일한 양상을 나타내는 것이었으며, Lee et al(2006)의 은행잎 항균효과에 의해 S. aureus 세포 표 면의 심한 손상을 나타난 결과와도 유사하였다. Ryu YJ(2003), Cho et al(1991), Seo et al(1997) 등은 항균 활성 물질 처리 시 미생물의 효소 기능 약화와 세포막 파손으로 인해 균체 외부로 세포내용물이 유출되어 균체 생육이 억제된다고 보 고하였는데, 본 연구에서도 산수유 에탄올 추출물 처리 시 세균의 세포막 파괴와 세포 성분의 유출 등으로 세포가 정상 적인 대사활성을 하기 어려워져 균의 생육이 억제되었을 것 으로 사료되었다.
본 연구에서 산수유 에탄올 추출물의 항균 활성 및 세포 구조에 미치는 영향을 여러 가지 방법으로 측정한 결과, 산 수유 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성이 증가 하는 것으로 나타났고 균주 종류에 따른 감수성의 차이는 있 었으나 대부분의 균주에 대해 높은 항균 활성을 나타내었다.
식물에서 발견되는 천연 항균 물질로는 polyphenol, flavonoid, terpenoid, polypeptide 등의 다양한 물질들이 보고되고 있는 데, 그 중 terpenoid와 phenolic은 미생물 세포막 파괴를 통한 항균 활성을 나타내고, phenol과 flavonoid는 미생물의 대사 작용에 관여하는 물질과 결합하여 성장 억제를 나타내는 것 으로 보고되었다(Cichewicz & Thorpe 1996, Cowan MM 1999, Lambert et al 2001, Peres et al 1997). 또한 항균 성분 들과 항균 활성 사이의 상관관계에 대해서도 다양한 연구 결 과들이 보고되고 있다. Kim et al(2007b)은 경단구슬모자반 추출물의 항산화와 항균 활성 결과가 폴리페놀 및 플라보노 이드 함량과 유의한 상관관계가 있으며, 페놀성 화합물 중 플 라보노이드 물질을 항균 활성의 주된 성분으로 보고하였고, Brackett RE(1987)과 Oh et al(1998)은 산수유에 함유된 citric acid와 malic acid 등의 유기산이 항균 활성에 효과적임을 보 고하였으며, 비타민 C는 자체적으로 항균 활성을 나타낼 뿐 만 아니라 다른 항균제들에 대한 상승효과를 나타내며(Cur- sino et al 2005, Jeon et al 2012, Tabak et al 2003), 유기산과 복합적으로 작용할 때 항균 활성이 더욱 증가된다고 보고되 었다(Ogden et al 1996, Zambuchini et al 2008). 산수유에도 다양한 유기산과 정유 성분 및 페놀성 화합물이 함유된 것으 로 알려져 있는데, Jeon et al(2008)에 따르면 산수유 에탄올 추출물은 34.22 mg/g과 5.67 mg/g의 폴리페놀과 플라보노이 드를 함유하고 있으며, 1.07 mg/100 g의 비타민 C도 함유하 고 있는 것으로 보고되었다(Kim et al 1999). 따라서 산수유 에 함유된 유기산, 비타민 C 및 페놀성 화합물들이 항균 활성 을 나타내는데 기여했을 것으로 생각된다. 한편, 항균력은 소 수성 분획물에서 높게 나타나는데, 특히 소수성 성질을 갖는
방향족 구조를 포함한 정유 성분들은 미생물 내부의 이온들과 ATP, 핵산, 아미노산 등의 세포외 유출 현상을 유발하거나, 세포에 심각한 손상을 야기함으로써 항균 활성을 나타내는 것으로 보고되었다(Wo WS 1995, Cho et al 2005, Demirci et al 2008, Yu et al 2011). 따라서 본 연구의 산수유 에탄올 추 출물에도 지질 성분과 정유 성분들이 에탄올에 용해되어 포 함되어 있기 때문에, 이들 성분들이 작용하여 미생물에 대한 항균 활성을 더욱 증가시켜 주었을 것으로 생각된다. 이들 결과를 종합해 볼 때 본 연구에서 나타난 산수유 에탄올 추 출물의 항균 활성은 에탄올 용매에 용해되어 추출된 항균 활 성 물질들의 작용과 이들의 상승효과 및 추출물에 의한 세포 막 파괴와 세포 성분 유출 등에 기인한 것으로 사료된다.
요약 및 결론
본 연구에서는 우리나라에서 자생하는 약용식물 중 하나인 산수유의 천연 항균 소재로서의 이용 가능성을 탐색하기 위 하여 식중독균과 식품 부패 세균인 B. cereus, E. coli, E. coli O157:H7, L. monocytogenes, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhi- murium에 대한 산수유 에탄올 추출물의 생육저해환과 MIC 및 생육저해도 측정을 통하여 항균 활성을 분석하였고, 세포 성 분 유출 및 주사전자현미경 측정을 통하여 세포 구조의 변화 와 영향력을 확인하였다. 실험 결과, 생육저해환의 크기는 E.
coli ≥ L. monocytogenes ≥ E. coli O157:H7 > B. cereus >
S. aureus > P. aeruginosa > S. typhimurium 순으로 나타났으 며, S. typhimurium을 제외한 모든 균주에 대해 1,000～4,000 ppm의 농도 범위에서 MIC를 나타내었다. 또한 3,000 ppm의 산수유 에탄올 추출물을 첨가한 P. aeruginosa와 S. typhi- murium의 생육곡선에서는 유도기 연장과 대수기의 증식 억제 가 나타났고, B. cereus, E. coli, E. coli O157:H7, L. monocy- togenes에서는 세포 증식이 완전히 억제된 것으로 나타났다.
한편 균주에 산수유 에탄올 추출물 처리 시 세포 성분이 유 출되는 것으로 나타났고, 주사전자현미경을 통해서 세포 형 태의 파괴가 일어남을 관찰할 수 있었다. 본 연구에서 산수 유 에탄올 추출물은 식중독균과 식품 부패 세균에 대해 높은 항균 활성을 가지고 있었을 확인할 수 있었고, Gram (+)균과 Gram ()균 모두에 항균 활성을 나타내어 천연 항균 소재로 서의 이용 가능성을 보여주었다.
감사의 글
이 논문은 2012년 (재)동일문화장학재단 학술연구비 지원 과 2012학년도 경북대학교 학술연구비 지원에 의하여 연구 되었으며, 이에 감사드립니다.
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