Free radical scavenging, anti-inflammatory and melannin synthesis inhibitory activities of Gloeostereum incarnatum

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J. Mushrooms 2014 June, 12(2):107-116 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2014.12.2.107 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853

© The Korean Society of Mushroom Science

*Corresponding author E-mail : [email protected]

Tel : +82-32-835-4619,Fax : +82-32-835-0763 Received May 29, 2014

Revised June 15, 2014 Accepted June 25, 2014

느릅나무버섯 자실체의 메탄올과 열수추출물의 항산화, 항염증 및 멜라닌 생성저해 활성

권예주¹·김미현¹·최재순¹·이태수*

인천대학교 생명과학기술대학, 생명과학부,

인천논현고등학교

Free radical scavenging, anti-inflammatory and melannin synthesis inhibitory activities of Gloeostereum incarnatum

Ye Ju Kwon¹, Mi-Hyeon Kim¹, Jae Soon Choi¹ and Tae Soo Lee*

Division of Life Sciences, Incheon National University,(Songdo-dong) 119 Academy-ro, Yeonsu-gu, Incheon, Korea

1

Incheon Nonhyeon High School, 604-2 Nonhyeon-dong, Namdong-gu, Incheon, Korea

ABSTRACT: Gloeostereum incarnatum is an edible and medicinal mushroom belongs to Family Cyphellaceae of Polyporales, Basidiomycota. The purpose of this study was to investigate the free radical scavenging, anti-inflammatory, and melanin synthesis inhibitory activities of fruiting bodies of Gloeostereum incarnatum. In the free radical scavenging activities, the mushroom extracts showed good 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging and chelating activity on the ferrous ions compared with the positive control, BHT. The mushroom extract suppressed nitric oxide (NO) production in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells in dose dependant manners. Significant reduction of paw edema of rats were observed at 2~6 h after administration with 50 mg/kg of the methanol and hot-water extracts, which were comparable with treatment of 5 mg/kg of indomethacin, the positive control. The melanin synthesis of Melanoma B16/F10 cells treated with 100 µg/mL of the methanol and hot water extracts decreased melanin concentration to 50% and 45% compared with the control, arbutin. Therefore, the experimental results showed that methanol and hot-water extracts of Gloeostereum incarnatum fruiting bodies might be used for good sources of anti-inflammatory, free radical scavenging, and skin whitening agents for human health.

KEYWORDS: Anti-inflammation, Free radical scavenging, Gloeostereum incarnatum, Melanin inhibition

서 론

인체에 활성산소가 과다 발생하면 세포대사에 심각한 이상을 초래하여 심혈관계 질환, 암 및 신경 전달물질에

영향을 미쳐 체내에 치명적 손상을 주게 된다. 현대의 생 활에서 건강한 삶을 살아가기 위해 체내의 활성산소를 효 과적으로 제거하기 위해 항산화 효과를 나타내는 물질의 분리와 이용에 많은 노력이 경주되고 있다 (Weisburger, 1999). 인체 내에서 생성되는 superoxide (O_2-), hydroxyl radical (HO), hydrogen peroxide 등(H2O₂)과 같은 활성 산소 종들(ROS: reactive oxygen species)은 DNA를 손상 시키고 정상세포의 노화, 암의 유발 및 각종 질병을 일으킨 다. 이와 같은 질병과 노화를 방지하기 위해 개발된 합성 항산화제에 butylated hydroxyl toluene (BHT)과 butylated hydroxyl anisol (BHA)가 있다. 이들 합성 항산화제는 효 과와 안정성이 높아 널리 사용되어 왔지만 과다하게 사용 하게 되면 인체에 심각한 부작용을 일으키는 것으로 알려 져 효과적이고 안전한 항산화제의 개발이 시급하게 되었 다(Lee et al., 1997).

활성 산소 종들의 다른 문제점은 이들 물질들이 체내의 염증 반응에 직간접적으로 관여한다는 것이다. 염증 반응

은 생체나 조직에 물리적인 작용, 화학 물질, 미생물의 침 입, 감염 등의 외부자극에 의해 손상이 일어난 부위를 재 생하려는 기전이다. 이러한 자극이 체내에 가해지면 국소 적으로 히스타민, 세로토닌, prostaglandins와 같은 혈관 활성물질이 유리되면서 혈관의 투과성이 증대되어 염증이 유발되게 된다. 이러한 과정을 통해 생성된 염증은 피부 의 손상과 노화 및 인체의 각종 질환을 촉진시키기 때문 에 염증에 의해 유발되는 여러 질환을 치료하기 위해서는 체내의 항산화 능력을 증가시켜 염증을 줄일 수 있는 천 연물질의 개발이 필요하게 되었다 (Gey, 1993).

최근 기미, 주근깨, 반점 및 과잉 색소증의 치료와 항상 흰 피부를 원하는 사람들을 위해 다양한 미백물질을 소재 로 한 화장품이 개발되어 사용되고 있으나, 세포독성으로 인한 피부자극과 피부암의 유발과 같은 부작용으로 인해 안정성의 문제점이 제기되면서 현재 세계 여러 나라에서 는 특정 미백 물질을 이용해 제조한 미백화장품의 제조가 전면 금지되었거나 제한적인 농도에서만 사용이 허가되고 있다. 따라서 우리나라에서 피부 치료제로 미백제를 사용 하기 위해서는 의사의 처방이 필요하고, 병원이나 약국에 서 판매되는 미백제에는 5% 미만의 미백 성분이 포함되 어 있다(Park et al., 2009). Kojic acid는 Aspergillus속의 곰팡이로부터 분리된 물질로 동물 피부세포 내의 melanin 의 생합성을 저해하는 기작을 가지고 있어 기존에 개발한 다른 물질에 비해 독성이 낮고 효과가 좋아 널리 사용되 어 왔으나, 2000년 초 피부암의 유발 가능성에 관한 연구 내용이 보고된 이후 사용이 중지되었다. 또한 월귤나무에 서 분리된 arbutin은 세포독성이 거의 없고 in vitro 상태 의 실험에서 효과가 우수하여 현재 가장 많이 사용되고 있지만, hydroquinone에 당이 붙어 있는 구조로 인해 세 포의 투과성에 문제점이 있어 in vivo 상태에서 상대적으 로 미백 효과가 낮게 나타난다. 또한 melanin의 생합성 대사는 미백 활성 효과뿐만 아니라 피부암과의 관련성 때 문에 최근 다양한 연구가 진행되고 있지만 아직도 melanin의 생합성을 저해하고 부작용이 없는 새로운 저해 물질이 발견되지 않아 기존의 멜라닌 저해제를 대체할 수 있는 물질의 탐색과 개발이 진행되고 있다. 이제까지 melanin 생합성 저해물질 탐색은 주로 식물에서 추출한 물질을 중심으로 이루어져 왔으며, 최근 방선균이나 곰팡 이를 대상으로 한 새로운 미백 활성 물질에 대한 연구가 보고되고 있다(Jeon et al., 2009).

느릅나무버섯(Gloeostereum incarnatum)은 담자균류 (Basidiomycota)의 구멍장이버섯목 (Polyporales), 느릅나 무버섯과(Cyphellaceae)에 속하는 버섯으로 나무의 목질 부 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 성분을 분해하 여 살아가는 백색부후균이다. 이 버섯의 자실체에 는 항 산화, 항종양, 항균 등의 효과를 나타내는 물질이 함유되 어 있어 건강에 도움을 주는 식의약용 버섯으로 보고되어 있다 (Ying et al., 1987). 따라서 본 연구에서는 이 버섯

의 자실체에 함유되어있는 물질의 생리활성 효과를 알아 보기 위해 이 버섯의 자실체에서 메탄올과 열수를 이용해 추출한 물질의 항산화, 항염증 및 Melanoma B16/F10 세 포에서의 멜라닌의 생성을 저해하는 효과에 대한 실험을 수행하고 그 결과를 보고하는 바이다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용한 느릅나무버섯(Gloeostereum incarnatum) 의 자실체는 중국의 Peking Union Medical College의 Guo, Shun-Xing 교수로 부터 받아 45^oC의 건조기에서 48 시간 건조하고 마쇄 후 -70^oC의 저온냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

성분의 추출 및 분리

Shim 등(2003)의 방법에 따라 건조한 느릅나무버섯 자 실체의 분말에 80% 메탄올과 열수를 이용해 성분을 추출 하여 실험에 사용하였다. 즉, 느릅나무버섯 자실체의 분 말 50 g을 80%의 메탄올 용액(덕산약품공업, Korea) 1,000 mL에 침지하여 48시간 동안 상온에서 3회 추출한 후 이 추출액을 모으고 여과지 (Avantec Toyo Co., No.

2, Japan)로 여과한 후 40^oC에서 회전 감압농축기(N- 1000, EYELA Co., Japan)로 감압 농축한 후 농축액 내 의 수분을 제거하기 위해 동결건조기(Operon Co., Korea) 를 이용하여 메탄올 추출물 분말을 얻었다. 열수추출물은 50 g의 자실체 분말을 3차 증류수 5 L에 넣어 95^oC에서 10시간 동안 3회 추출 후 이들 추출액을 모아 4^oC에서 24시간 동안 정치시킨 후 여과지(Avantec Toyo Co., No.

2, Japan)로 여과하고 동결건조기 (Operon Co., Korea)을 이용하여 여과액의 수분을 제거하여 열수추출물 분말을 얻었다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량의 측정은 Folin-Denis을 변형한 Swain 등(1959)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 느릅나무버섯의 자실체 추출물을 메탄올 1 mg/mL의 농도로 녹인 각 용매 별 추출액에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10%의 NaCO3용 액을 각각 1 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간방치 후 UV/VIS Spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용해 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid (Sigma Co., Ltd., St. Louis, MO, USA)를 0100 g/mL의 농도로 제조한 후 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선을 이용하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 구 하였다.

총 플라보노이드 함량 측정

느릅나무버섯 자실체의 총 플라보노이드 함량은 Moreno

등 (2000)의 방법에 따라 1 mg/mL 농도의 시료액에 10%

aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 ethanol 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 방치한 다음 UV/VIS Spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용해 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Quercetin을 표준물질로 하여 얻은 표준 검량선을 이용하 여 추출물의 총플라보노이드 함량을 구하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성 은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 시료를 메탄올로 녹여 최종 농도가 25, 125, 250, 500, 1,000, 1,500 μg/mL 이 되도록 정량하여 96 well plate에 각 시료를 100 mL를 주입하고. 동시에 0.3 mM DPPH 100 mL를 넣어 총량이 200 mL가 되도록 하였다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader (SpectraMax 340PC, California, USA) 를 이용해 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이 의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성(%)

= [1 − (첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)] × 100 철 이온 제거능 측정

철 이온 제거능 실험은 Yena 등 (2002)의 방법에 준하 여 수행하였다. 먼저 각각의 농도별로 준비된 느릅나무버 섯의 자실체 추출물 2.0 mL에 2 mM FeCl₂ (Sigma Aldrich Co., USA) 0.05 mL를 섞은 후 5 mM의 ferrozine 0.2 mL를 첨가하여 반응시킨 뒤 메탄올 2.75 mL를 가하 여 총 용량이 5 mL가 되도록 한 후 vortex mixer를 이용하 여 강하게 진탕한 뒤 UV/VIS Spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용하여 562 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하여 다음의 계산식에 의해 철 이온 제거능을 계산하 였다. 양성대조군으로는 BHT를 사용하였으며 철 이온 제 거능의 측정은 다음의 식을 이용하여 구하였다.

철 이온 제거능 (%)

= [(A_control - A_sample) / A_control] × 100

환원력 활성 측정

느릅나무버섯 추출물의 환원력 활성에 대한 실험은 Gulcin 등 (2003)의 방법에 따라 수행하였다. 시료 2.5 mL에 sodium phosphate buffer (2.5 mL, 200 mM, pH 6.6)와 1% potassium ferricyanide (2.5 mL)를 혼합시킨 후 혼합물을 50^oC에서 20분 간 배양한 뒤 trichloroacetic acid (2.5 mL, 10%, w/v)를 첨가하여 650×g에서 10분간 원심 분리하였다. 원심 분리 후 상층액 5 mL에 3차 증류 수 5 mL와 1% ferric chloride 1 mL를 첨가한 후 UV/

VIS Spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용하 여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포배양

실험에 사용한 생쥐의 RAW 264.7와 Melanoma B16- F10 세포는 서울대학교의 한국세포주은행에서 분양받았 으며 이들 세포의 배양에는 DMEM 배지와 RPMI-1640 배지를 각각 기본배지로 하여 10% FBS, 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 조제하 였고, 37^oC, 5% CO₂배양기에서 3일 배양하였다.

추출물의 세포 독성 측정

느릅나무버섯 자실체 추출물의 RAW 264.7 세포에 대 한 독성은 Mosmann의 방법(1983)에 따라 수행하였다.

지수기에 도달한 세포를 RPMI-1640 배지가 분주된 96 plate well에 2×10⁵cell/mL의 농도로 분주하고 24시간 배 양한 후, 배지의 상층액을 제거하고 느릅나무버섯 추출물 을 10, 100, 500, 1,000, 2,000 μg/mL 농도로 새로운 배지 에 200 μL 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 상층액을 제거하고 각각의 well에 MTT용액 (5 mg/mL in PBS) 10μL씩을 첨가하고, 다시 37^oC, 5% CO₂ 배양기 에서 4시간 동안 배양하여 MTT를 환원시켰다. MTT의 환 원에 의해 각각의 well에 생성된 자주색의 formazan 결정은 150 mL의 DMSO로 녹여 microplate reader (SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

Nitrite (NO) 생성 저해효과 측정

NO 생성저해 효과는 Ryu 등(2003)의 방법을 이용하여 측정하였다. DMEM 배지가 들어있는 96 well plate 에 RAW 264.7 세포를 5×10⁴ cell/well로 분주하고 12시간 배양 후 느릅나무버섯 자실체 추출물을 0, 1, 2.5, 5.0 mg/mL의 농도로 1 시간 전 처리 한 후 1 μg/mL의 농도 로 LPS를 투여하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 상 층액 100 μL를 취한 뒤 동량의 Griess reagent (Sigma, St. Louis, MO, USA) 100μL를 넣어 총량이 200 μL가 되도록 한 뒤 상온에서 10 분간 반응하여 생성된 NO의 양을 microplate reader (SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 의 농도는 아질산염의 표준 곡선을 이용하여 구하였다.

Carrageenan

흰쥐 뒷발의 급성 부종유발은 Winter 등(1962)의 방법에 따라 수행하였다. 생리식염수에 녹인 0, 5, 15, 50 mg/kg 농도의 느릅나무버섯 자실체의 추출물을 흰쥐 마리당 0.1 mL씩 오른쪽 뒷발바닥에 주사하고 30분이 지난 후 기염 제인 1%의 carrageenan 용액 0.1 mL를 뒷발바닥에 주사

하였다. 본 실험에서는 각각의 처리 당 5마리의 흰쥐를 사용하였다. 소염효과는 먼저 느릅나무버섯 자실체 추출물 을 생쥐에 뒷발에 주사한 후 30분 후 carrageenan을 주사하 여 흰쥐의 뒷발바닥에 생긴 부종의 용적을 plethysmometer (MK-101P, Tokyo, Japan)로 측정하여 구하였다. 즉, 흰쥐 뒷발에 carrageenan을 주입하기 전을 0으로 하고 주입 후 2, 4, 6시간이 지난 후 증가한 뒷발의 용적을 실험군 별로 각각 측정하여 다음의 식에 의하여 부종 증가율을 산출하 였다.

부종증가율 (%) = (Vt− Vn)/V_n × 100 V_t = 주입 후 일정시간 후의 뒷발의 용적 V_n = 주입 직후 뒷발의 용적

티로시나아제 활성 저해능 측정

느릅나무버섯 추출물의 티로시나아제 활성 저해시험은 Ishihara 등(1991)의 방법을 변형하여 수행하였다. 즉, 50%의 DMSO에 125~2,000 mg/mL의 농도로 녹인 각각 의 추출물 60 μL에 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 6.5) 120μL를 넣은 뒤 31 U/mL의 mushroom tyrosinase (Sigma Co., USA)액 60 μL를 넣은 뒤 1.5 mM의 tyrosine (Sigma Co., USA) 액 60 μL를 첨가한 후 37^oC에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 microplate reader (SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용하여 475 nm의 파장에서 흡광도를 측정 하였다. Blank는 시료 액 대신 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 6.5)를 사 용하였다. 양성대조군은 kojic acid (Sigma Co., USA)를 사용하였다. 티로시나아제 저해 능(%)은 다음의 식에 따 라 구하였다.

티로시나아제 저해 능(%)=

[(A_control−A_sample)/A_control] × 100

Melanoma B16/F10 세포내 멜라닌의 생성억제 측정

F10 세포를 24 well plate에 4×10⁴cells/well이 되도록 DMEM 배지로 희석하여 분주하고 24시간 배양하여 안정 화 한 후 0.4 μM의 α-melanocyte stimulating hormone (MSH, Sigma Co., USA)과 0.5 mM의 3-isobutyl-1- methylxanthine (IBMX, Sigma Co., USA)가 첨가된 배 지에 시료를 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처 리하고 72 h 동안 37^oC의 5% CO2 배양기에서 배양하였 다. 양성 대조군으로는 알부틴(Arbutin, Sigma Co., USA) 을 사용하였다. 1% Triton X-100 (Sigma Co., USA)이 포함된 PBS에서 5분간 진탕 후 3,000 rpm으로 5분간 원 심 분리하여 얻은 pellet에 1 N NaOH 100 μL와 10%

DMSO 용액 200 μL를 첨가하여 60^oC에서 1시간 동안 용

해시키고, microplate reader (SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용하여 405 nm의 파장에서 흡광도 를 측정하였다. 멜라닌 생성 억제 능(%)는 다음의 식에 따라 계산하였다.

멜라닌 생성 억제 능 (%)

=[(A_control−A_sample)/A_control] × 100

통계 처리

실험은 3회 이상 반복 실험을 통하여 얻은 각각의 결과 를 mean ± SD로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 통 계적 유의검정은 대조군과 비교하여 Student’s t-test 후, p

< 0.05 수준에서 통계적으로 유의성 있는 결과로 표시하 였다.

결과 및 고찰

총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량

메탄올과 열수를 이용해 느릅나무버섯 자실체에서 추 출한 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 Table 1에 나 타내었다. 메탄올 추출물의 총 페놀 함량과 총 플라보노 이드 함량은 각각 1.29 μg/mg과 1.51 μg/mg이었고 열수 추출물은 각각 0.51 μg/mg과 1.43 μg/mg으로 나타나 총 페놀의 양은 메탄올 추출물이 열수추출물에 비해 약 2.5 배 이상 많았으며 플라보노이드의 양은 메탄올 추출물과 열수추출물이 각각 1.51 μg/mg과 1.43 μg/mg으로 나타 나 각각의 추출물의 양은 매우 유사하게 나타났다(Table 1). 이 결과는 약용버섯인 차가버섯에서 메탄올로 추출한 페놀의 31.85 μg/mg과 플라보노이드의 28.33 μg/mg (Guk et al., 2013)과 다른 약용버섯인 기와층버섯의 메 탄올 추출물의 페놀 양인 16.37 μg/mg과 총 플라보노이 드 양인 5.10 μg/mg에 비해 적었다(Nguyen et al, 2013b).

그러나 식용인 흰망태버섯의 열수 추출물의 페놀 양인 1.21μg/mg과 총 플라보노이드 양의 0.14 μg/mg에 비해 서는 높게 나타났다(Nguyen et al, 2013a). 따라서 느릅 나무버섯의 자실체에서 추출한 총 페놀과 플라보노이드

Table 1. Total phenolic and flavonoid contents of methanol and hot-water extracts from fruiting bodies of Gloeostrereum incarnatum

Sample Yield Phenolics content Flavonoids content (% w/w) ( µg GAEs/mg extract) (µgQEs/mg extract) Methanol

extract 11.64 1.29 ±0.259 1.51 ±0.768 Hot-water

extract 6.51 0.51±0.076 1.43±0.671

GAEs, gallic acid equivalent; QEs, quercetin equivalent.

의 양은 약용버섯인 차가버섯과 기와층버섯에 비해 적었 으나 식용버섯인 흰망태버섯에 비해서는 높은 것으로 분 석되었다.

DPPH 라디칼 소거활성

느릅나무버섯 자실체 추출물의 DPPH 라디칼의 소거 활성을 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 느릅나무버섯 추출물의 DPPH 소거 활성은 0.625 mg/mL의 농도에서 메탄올과 열수 추출물이 각각 13.14%, 15.81%로 나타나 동일한 농도에서 양성대조군인 BHT의 96.55%에 비해서 낮게 나타났다. 그러나 2.0 mg/mL의 농도에서 메탄올과 열수 추출물의 소거활성은 각각 79.91%와 81.05%를 보 여 양성대조군인 BHT의 96.55%에 비해 낮았다. 따라서 느릅나무버섯 추출물의 농도가 0.125 mg/mL에서 2.0 mg/mL으로 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성은 농 도 의존적으로 증가하는 것으로 나타나 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성은 양성대조군인 BHT에 근 접하는 것으로 나타났다. 이 결과는 차가버섯 균핵의 메 탄올 추출물과 흰망태버섯의 자실체에서 메탄올과 열수로 추출한 물질의 DPPH 라디칼 소거활성에 비해서는 낮았 지만 (Guk et al., 2013; Nguyen et al, 2013a), Um 등 (2010)이 보고한 노랑느타리의 열수추출물의 소거 활성과 유사하게 나타나서 본 느릅나무버섯 추출물의 DPPH 소 거활성은 양성대조군이나 약용버섯에 비해서 낮았지만 다 른 식용버섯에 비해서는 유사한 결과를 나타내었다.

철 이온 제거능

느릅나무 자실체의 메탄올과 열수추출물의 0.0625 mg/mL 농도에서의 철이온 제거능은 각각 5.03과 9.185%로 나타 나 양성 대조군인 BHT의 37.38%에 비해 매우 낮게 나타 났다. 2.0 mg/mL의 농도에서는 메탄올과 열수 추출물의 철 이온 제거능은 각각 37.90%와 75.44%을 나타내 양성

대조군인 BHT의 68.05%에 비해 메탄올 추출물의 철이 온 제거능은 매우 낮았으나 열수 추출물의 제거능은 7%

높게 나타났다(Fig. 2). Nguyen 등(2013b)의 연구 결과에 의하면 흰망태버섯 자실체의 열수 추출물의 철 이온 제거 능은 2.0 mg/mL의 농도에서 91.44%로 나타나 본 실험의 동일 농도에서 제거능에 비해 16% 높은 것으로 나타났다.

또한 Lee 등(2007)의 연구 결과에 의하면 느티만가닥버 섯의 자실체 열수 추출물 5 mg/mL 농도에서의 철 이온 제거 효과는 75.6%로 나타나 본 실험의 결과와 매우 유 사하였으나 본 실험의 느릅나무버섯 자실체의 추출 농도 2 mg/mL는 느티만가닥버섯 실험에 사용한 농도 5 mg/mL 의 40%인 것을 감안하면 실제로 느릅나무버섯 열수추출 물의 철이온 제거능은 느티만가닥버섯에 비해 높은 것으 로 사료된다.

환원력

느릅나무버섯 자실체의 메탄올과 열수 추출물의 환원력 은 0.5 mg/mL의 농도에서 각각 0.23으로 동일하게 나타

Fig. 1.

extracts from fruiting bodies of Gloeostrereum incarnatum against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Values are expressed as means±SD (n=4). BHT, butylated hydroxytoluene.

Fig. 2.

BHT, butylated hydroxytoluene

Fig. 3.

나 같은 농도에서의 양성대조군 BHT의 10%로 매우 낮 았고 6.0 mg/mL의 농도에서도 느릅나무버섯의 메탄올과 열수 추출물의 환원력은 1.44와 1.31로 양성대조군으로 사용한 BHT의 2.73에 비해 매우 낮게 나타났다(Fig. 3).

또한 느릅나무버섯의 메탄올과 열수 추출물은 0.5~6.0 mg/mL 농도 범위에서 환원력에 다소의 차이가 있었으나 큰 차이를 보이지 않았다. Mau 등(2004)은 잎새버섯의 자실체 열수추출물이 5 mg/mL의 농도에서 0.37의 환원력 을 나타낸다고 보고해 느릅나무버섯 자실체 4 mg/mL 농 도에서의 메탄올과 열수추출물의 환원력 0.73과 0.95에 비해 낮았다. 따라서 느릅나무버섯 자실체의 환원력은 양 성대조군으로 사용한 BHT에 비해서는 낮았지만 잎새버 섯의 환원력에 비해서는 높은 것으로 나타났다.

추출물의 세포독성

느릅나무버섯 자실체 추출물이 RAW 264.7 세포와 Melanoma B16/F10 세포에 미치는 세포독성을 알아보기 위해 RAW 264.7과 Melanoma B16/F10세포에 메탄올과 열수추출물을 50, 100, 500, 1,000, 2,000 μg/mL의 농도 로 처리하고 배양한 후 MTT 방법을 이용하여 세포의 생 존율을 조사하였다. 실험결과 RAW 264.7 세포의 생존율은 50μg/mL 농도에서 메탄올과 열수 추출물은 각각 102.35%

와 109.42%의 세포 생존율을 보였으며 100 μg/mL 농도에 서도 각각 94.56%와 97.62%의 생존율을 보여 독성을 거 의 나타내지 않았다. Melanoma B16/F10 포의 생존율은 50μg/mL 농도에서 메탄올과 열수 추출물이 각각 105.20%

와 116.23%의 세포 생존율을 나타냈으며 100 μg/mL 농도 에서도 각각 98.24%와 100.25%의 생존율을 보여 독성을 거 의 나타내지 않았다(Fig. 4). 추출물의 농도가 500 μg/mL에 서 2,000 μg/mL로 증가하면서 세포가 생존율은 농도 의 존적으로 감소하였지만 2,000 μg/mL의 농도에서 메탄올 과 열수추출물은 RAW 264.7 세포와 Melanoma B16/F10 세포에 각각 66% 이상의 생존율을 나타냈다. 따라서 느

릅나무 자실체의 메탄올과 열수 추출물은 고농도에서도 거의 독성을 나타내지 않아, RAW 264.6 세포를 이용한 NO 생성 저해시험과 carrageenan을 이용한 흰쥐의 부종 저해실험 그리고 Melanoma B16/F10 세포에서의 멜라닌 저해실험을 진행하였다.

NO 생성 저해

NO는 인체의 염증 유발에 관여하는 물질로 nitrite oxide synthase (NOS)에 의해 생성된다. 본 실험에서는 느릅나무버섯 자실체의 메탄올과 열수 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리하고 염증 유발물질인 LPS를 추가로 투여하여 RAW 264.7 세포 내에 생성되는 NO가 느릅나 무버섯의 자실체 추출물에 의해 저해되는 효과를 조사하 였다. 실험 결과 RAW 264.7 세포만 단독으로 배양한 대 조군의 NO 농도는 6.13 μM이었으나 LPS만 1.0 μg/mL의 농도로 단독 처리한 실험군의 NO 농도는 64.73 μM로 약 10배 증가하였다. 그러나 메탄올 추출물을 2.5 mg/mL와

Fig. 4. In vitro cytotoxicity against RAW 264.7 and melanoma

Values are expressed as means±SD (n=3). Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol; Fr.HW, fraction extracted with hot-water.

Fig. 5. Inhibitory effects of methanol and hot extracts from fruiting bodies of Gloeostrereum incarnatum on LPS-induced NO

5.0 mg/mL의 농도로 처리한 실험군의 NO 농도는 각각 31.82μM과 13.76 μM로 낮아져 메탄올 추출물을 2.5 μg/mL 과 5.0 mg/mL의 농도로 처리한 RAW 264.7 세포의 NO 생성량은 LPS만을 단독으로 처리한 군에 비해 NO의 생 성량이 각각 50.86%와 88.74% 감소하는 것으로 나타났 다(Fig. 5). 또한 열수 추출물을 2.5 mg/mL와 5.0 mg/mL 의 농도로 처리한 군의 NO의 생성량이 각각 15%와 22.27% 감소하여 RAW 264.7 세포에서 메탄올 추출물의 NO 생성 저해효과는 열수추출물에 비해 현저하게 높게 나타났다(Fig. 5). Jang (2007)은 낙엽송충버섯 메탄올 추 출물의 hexane 분획물을 RAW 264.7 세포에 처리한 후 LPS를 투여했을 때 NO의 생성량은 유의성 있게 저해되 었다고 보고하였다. Kang (2012)에 의하면 팽이버섯의 열 수추출물을 1.0 mg/mL 농도로 RAW 264.7 세포에 처리 한 후 LPS를 처리한 경우 RAW 264.7 세포 내의 NO의 생성은 농도 의존적으로 유의성이 있게 감소하였다고 보 고하였다. 본 실험에서도 RAW 264.7 세포에 처리한 느 릅나무버섯의 추출물 농도가 높아짐에 따라 NO의 생성도

농도 의존적으로 감소하여 위의 보고와 매우 유사한 결과 를 얻었다. Nguyen 등(2013a)은 망태버섯의 자실체에서 추출한 물질이 NO를 생성하는 iNOS의 발현을 저해하였 고 버섯 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO의 생성량도 감소했다고 보고하였다. 본 실험에서도 RAW 264.7 세포 에 처리된 느릅나무버섯의 추출물 농도가 증가시킴에 따 라 RAW 264.7 세포 내에 생성된 NO의 양도 농도에 따 라 감소하는 것이 관찰되었다.

Carrageenan

느릅나무버섯 자실체의 메탄올 추출물의 소염효과를 Fig. 6에 나타냈다. 기염제인 carrageenan 만을 주사한 대 조군의 경우 carrageenan에 의해 유도된 부종에 의해 흰쥐 뒷발의 용적은 주사 후 2~6 시간 경과 후 40.57~65.32%

증가했으나, carrageenan 주사 후 소염제인 indomethacin 을 5 mg/kg의 농도로 투여한 양성 대조군은 20.14~33.68%

증가하였고, carrageenan 주사 후 메탄올 추출물을 5 mg/kg 투여한 실험군의 뒷발 용적은 26.00~42.71% 증가하였으

Fig. 6.

며 메탄올 추출물을 15 mg/kg 투여한 실험군의 뒷발의 용 적은 25.63~38.84% 증가했다. 또한 메탄올 추출물을 50 mg/kg의 농도로 투여한 실험군의 뒷발 용적은 17.53~

30.29% 증가했다. 또한 느릅나무버섯의 열수 추출물의 소 염 효과는 carrageenan 주사 후 메탄올 추출물을 5 mg/kg 투여한 실험군의 뒷발 용적은 27.41~46.05% 증가하였고 메탄올 추출물을 15 mg/kg 투여한 실험군의 뒷발의 용적 은 22.84~35.90% 증가했으며, 메탄올 추출물을 50 mg/kg 의 농도로 투여한 실험군의 뒷발 용적은 16.91~30.08% 증 가하였다(Fig. 6). 따라서 흰쥐에 투여한 느릅나무버섯의 메탄올과 열수추출물은 낮은 농도부터 높은 농도에 이르 기 까지 의 소염효과가 나타났다. 그 중 열수 추출물을 50 mg/kg의 높은 농도로 투여한 실험군의 소염효과가 5 mg/kg을 투여한 실험군에 비해 약 1.53배 높았다. 특히 indomethacin을 5.0 mg/kg 투여한 양성대조군의 소염효과 는 5.0 mg/kg의 열수추출물을 투여한 실험군에 비해 1.4배 높았으나 50 mg/kg의 열수추출물을 투여한 실험군에 비 해 소염효과가 90%로 나타나 소염효과가 조금 낮게 낮았 다. Nguyen 등(2013b)은 carrageenan으로 부종을 유발시 킨 흰쥐에 기와층버섯의 자실체 메탄올과 열수추출물을 투여한 후 소염 효과를 측정한 결과 투여한 추출물 농도가 증가함에 따라 소염효과도 비례적으로 증가한다고 보고하 였다. 본 실험에서도 느릅나무버섯 자실체의 메탄올과 열 수추출물의 농도가 증가함에 따라 소염효과도 농도 의존 적으로 증가하는 것으로 나타나 느릅나무버섯의 자실체 메탄올 추출물은 앞으로 항염증 치료에 이용가능성이 있 는 것으로 사료되었다.

티로시나아제 활성 저해

느릅나무버섯의 자실체에 피부의 미백효과를 나타내는 성분이 함유되어 있는지 확인하기 위해 느릅나무버섯의 메탄올과 열수추출물이 멜라닌 합성에 1차적으로 관여하 는 티로시나아제의 활성을 저해하는 실험을 수행하였다.

L-티로신을 티로시나아제의 기질로 사용하여 활성을 측정 한 결과, 느릅나무버섯의 메탄올과 열수추출물은 0.125 mg/mL의 농도에서 티로시나아제의 저해율이 각각 42.99%

와 44.71%로 나타나 양성대조군으로 사용한 kojic acid의 95.85%에 비해 매우 낮았으나 2.0 mg/mL의 고농도에서 는 메탄올과 열수 추출물의 티로시나아제 저해율이 각각 74.61%와 73.89%로 나타나 양성대조군인 kojic acid의 98.86%에 비해 낮았으나 저해효과가 매우 낮았던 저 농 도의 추출물에 비해서는 상대적으로 높게 나타났다. 따라 서 느릅나무버섯의 메탄올과 열수 추출물은 농도 의존적 으로 티로시나아제의 활성을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 7). 본 실험 결과는 Nam 등(2010)이 번데기동충하 초의 자실체 열수추출물을 5 mg/mL 농도로 처리해 얻어 진 티로시나제 저해율 71.0%에 비해서 조금 높았고, Nguyen 등(2013b)이 보고한 장수진흙버섯 자실체 메탄올

추출물의 1.5 mg/mL 농도에서의 저해율 95.0% 보다 낮 았다. 따라서 느릅나무버섯의 메탄올과 열수 추출물에는 멜라닌 합성에 관여하는 티로시나아제의 활성을 초기 단 계에 억제 하여 멜라닌의 생성을 어느 정도 차단하는 효 과가 있는 것으로 사료된다.

Melanoma B16/F10

Fig. 7. Tyrosinase inhibitory activities of methanol and hot

Values are expressed as means±SD n=3).

Fig. 8. Melanin synthesis inhibitory activities of methanol

incarnatum against Melanoma B16-F10 cell line. The values

Nguyen 등(2013b)은 장수상황버섯 자실체의 메탄올 추출 물을 100 μg/mL 농도로 Melanoma B16/F10 세포에 처 리하여 생성된 멜라닌의 양이 대조군의 31.55%에 이른다 고 보고하여 멜라닌 생성 저해효과가 69.45%에 이르렀다.

본 실험에서 느릅나무버섯 자실체의 메탄올과 열수추출 물을 동일한 농도로 Melanoma 세포에 처리 후 멜라닌의 생성이 저해된 효과는 각각 45.50%와 52.72%로 나타나 장수상황버섯에 비해 멜라닌 생성 저해 효과는 낮았고 또 한 양성대조군으로 사용한 arbutin의 저해율 54.47%에 비해서도 조금 낮았다. 그러나 느릅나무버섯의 자실체 추 출물의 멜라닌 생성 저해효과는 양성대조군으로 사용한 arbutin과 비교해 조금 낮았지만 두 물질간의 저해 정도의 차이가 크지 않아 앞으로 느릅나무버섯의 메탄올 추출물 을 새로운 미백 소재로 이용할 수 있는 가능성이 기대되 었다.

적 요

본 연구에서는 느릅나무버섯의 자실체에서 메탄올과 열 수를 이용해 추출한 물질의 항산화, 항염증 및 Melanoma B16/F10 세포에서의 멜라닌 생성 저해 효과를 탐색하였 다. DPPH 라디칼 소거능과 환원력을 이용해 항산화 효과 를 측정한 결과 양성대조군으로 사용한 BHT에 비해 항산 화 효과는 낮았지만 다른 종류의 버섯에 비해 효과가 우 수한 것으로 나타났으며, 철 이온 제거 항산화 실험에서 느릅나무버섯의 열수 추출물은 양성대조군인 BHT에 비 해 철 이온을 효율적으로 제거하여 항산화 효과가 높게 나타났다. 느릅나무버섯 자실체의 염증 저해 실험에서는 배양 중인 RAW 264.7 대식세포에 자실체의 메탄올과 열 수추출물을 각각 처리 한 후 염증 유도 물질인 LPS를 투 여하여 추출물의 NO 생성 저해효과를 조사한 결과, 처리 한 추출물의 농도 의존적으로 염증 유발의 주요 인자인 NO의 양이 현저하게 감소하는 우수한 소염효과를 보였으 며, carrageenan에 의해 흰쥐 뒷발에 유도된 부종을 저해 하는 실험에서는 투여한 추출물의 농도가 증가함에 따라 흰쥐의 뒷발에 유도된 부종의 용적도 비례적으로 감소하 여 항염증 효과가 높은 것으로 나타났다. Melanoma 세포 에 버섯추출물을 처리하고 생합성된 멜라닌의 양을 측정 한 결과 농도 의존적으로 melanoma 세포내 멜라닌의 양 이 감소하여 멜라닌 저해 효과가 높은 것으로 나타났다.

따라서 느릅나무버섯 자실체의 항산화, 항염증 및 멜라닌 생성 저해 선분은 앞으로 항산화제, 소염제 및 미백제로 의 이용이 가능할 것으로 사료된다.

감사의 글

본 논문은 2013년도 인천논현고등학교 R&E 프로그램 의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

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