171 책임저자：김정상, 702-701, 대구시 북구 산격동 1370
경북대학교 농업생명과학대학 생명식품공학부 Tel: 053-950-5752, Fax: 053-950-6750
E-mail: [email protected]
접수일：2009년 5월 12일, 게재승인일：2009년 6월 1일
Correspondence to：Jong-Sang Kim
Department of Life and Food Sciences, Department of Life and food Science, Kyungpook National University, 1370, Sangyeok-dong, Buk-gu, Daegu 702-701, Korea
Tel: ＋82-53-950-5752, Fax: ＋82-53-950-6750 E-mail: [email protected]
청국장 추출물의 항산화 효과
경북대학교 농업생명과학대학 생명식품공학부, 1경성대학교 생활경영학과
이인애ㆍ김효정ㆍ강희정1ㆍ김정상
Effect of Antioxidant Activity of Cheonggukjang
In-Ae Lee, Hyo Jung Kim, Hee Jung Kang1 and Jong-Sang Kim
Department of Life and Food Sciences, College of Agriculture and Life Science, Kyungpook National University, Daegu 702-701, 1Department of Human Ecology, Kyungsung University, Busan 608-736, Korea
Cheonggukjang (CGJ) is one of the important fermented foods in Korea. The traditionally fermented soy paste, CGJ, has been reported to have several health benefits including antioxidant, antimicrobial, blood pressure lowering and antidiabetic activities, compared to the unprocessed soybeans and cooked soybeans. The objective of this study was to establish the optimum fermentation conditions for maximizing antioxidative activity and production of free isoflavones. The fermentation of CGJ for 5 h resulted in a significant increase in the antioxidant capacity as evaluated by radical scavenging assay (DPPH), total phenolic contents and flavonoid contents. Significant differences in antioxidant capacity were observed at 5 h of fermentation time. (Cancer Prev Res 14, 171-176, 2009)
Key Words: Cheonggukjang, Soybean, Isoflavones, Fermentation, Antioxidant
서 론
청국장은 콩을 삶은 다음 볏짚 위에 놓고 40∼42°C에 서 2∼3일간 발효시킨 우리나라 전통 발효식품으로써 대부분 Bacillus sp. 작용으로 제조된다. 청국장 발효에 관여 하는 미생물로는 B. subtilis,1) B. lincheniformis,2) B. amylolique- faciens3) 등이 분리되어 있으며, 분리된 균주들 모두 pro- tease 효소활성이 우수하였다고 보고되어 있다.4) 최근에 청국장에서 항암, 항산화, 혈당조절, 혈압상승억제, 면역 증강, 혈전용해 및 항균효과 등 각종 유용한 생리활성 기능이 보고됨에 따라 기능성 건강식품으로 각광받고
있지만,5∼11) 청국장은 각 지방이나 가정마다 제조방법이
일정하지 않아 품질이 균일하지 못하며, 발효 시 생성되
는 암모니아 화합물의 독특한 냄새와 오염 등의 문제 때 문에 소비자들의 기피현상이 있다.12,13) 현재는 볏짚 등을 이용한 종래의 청국장 제조방법에 따른 유해균 오염 등 의 문제를 개선하기 위하여 종균을 사용한 위생적인 청 국장을 제조하기 위한 우수 균주에 대한 연구 등이 수행 되고 있다.13,14) 청국장은 원료 콩 자체 성분보다 필수아 미노산, 비타민 B1, B2, 나이아신, 판토텐산의 함량이 높 으며, 된장보다 콩 단백질과 지방질 함량이 높을 뿐만 아니라, 칼슘의 중요한 공급원이다.15,16)
청국장에는 콩으로부터 유래된 각종 생리활성물질 (isoflavones, phytic acid, saponin, trypsin inhibitor, tocopherol, 불포화지방산, 식이섬유, 올리고당)과 항산화물질 및 혈 전용해 효소를 다량 함유하고 있어서 고혈압방지 효과, 혈중 콜레스테롤 저하능, 심혈관질환 및 암예방효능 등
이 함유된 것으로 알려져 있다. 또한 청국장은 발효과정 중에 생성되는 효소의 작용으로 섬유소 및 세포내의 당 질, 단백질을 분해하여 소화율의 향상과 변비개선효과 가 있으며, Bacillus sp.은 발암물질이나, ammonia, indole 등 을 흡착, 배설시키는 작용을 한다고 알려져 있다.17∼21) 본 연구에서는 시간별로 표준 제조방법으로 제조한 청 국장의 항산화활성을 측정하여 가장 항산화효과가 높은 발효시간을 설정하고자 하였다.
재료 및 방법 1. 실험재료 및 시료제조
본 실험에 사용한 표준 제조 청국장은 한국식품연구 원으로부터 시간별(0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 시간)로 발효시켜 제조한 청국장을 냉동 건조하여 마쇄한 시료 를 증여 받아 사용하였으며, 각 시료 10 g에 80% 메탄올 을 첨가하여 14시간 교반하여 고속 원심분리한 후, 상등 액을 얻어 0.45μm syringe filter로 여과하여 메탄올 추출 물을 얻었다.
2. 세포배양
대장암세포 HT-29와 HCT116세포를 10% fetal bovine serum을 함유하는 RPMI 배지에서 배양한 후, 80% 메탄 올로 추출한 청국장 추출물을 각각 0.5 mg/ml 농도로 처 리하고 24시간 배양한 다음, 세포를 수집하여 lysis 시킨 후 원심 분리하여 단백질을 추출하고 정량한 다음, western blot 분석용 시료로 사용하였다.
3. 총 폴리페놀 함량
총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등22)의 방법에 따라 Folin- Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측 정하였다. 각 발효시간별 청국장 메탄올 추출물을 1 mg/ml의 농도로 만든 후, 시료 0.1 ml에 증류수 3 ml, Folin-Ciocalteu reagent를 5배 희석하여 15μl를 넣은 후 10% sodium carbonate (Na2CO3) 50μl를 첨가하여 혼합한 후, 실온에서 5분간 정치한 뒤, Microplate reader (Sunrise- basic TECAN, Austria)를 이용하여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 이용한 표준곡선은 gallic acid 0.02 mg/ml을 증류수에 녹이고 최종농도가 0, 0.06, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0μg/ml 용액이 되도록 조제하고 이를 일정량 취하여 위와 같은 방법으로 655 nm에서 흡광도 를 측정하여 계산하였다. 추출물의 총 폴리페놀함량은 ml당μg gallic acid로 나타내었다.
4. DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 의한 자유라디칼 소거 활성
DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma-Aldrich)에 의 한 자유라디칼 소거 활성은 Kilani 등,23) Choi 등24)의 방법 을 변형하여 측정하였다. 200μM 농도가 되도록 메탄올 에 용해한 DPPH를 200μl, 시료 50μl를 첨가하여 30분 동 안37°C에서 반응시킨 다음, Microplate reader로 515 nm에 서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성(%)은 다음과 같이 계산하였다.
Radical scavenging activity (%)=(1−A1/A0)×100 A1: 시료 처리군의 흡광도
A0: 시료 대조군의 흡광도
양성대조군으로 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid, α-tocopherol, butylated hydroxytoluene (BHT), delphinidin을 사용하였다. Kang 등25)은 전자공여능이 phenolic acids와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화작용의 지 표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 큰 것일수록 전 자공여능이 높다고 하였다. 또한 식물체의 총 폴리페놀 함량과 전자공여 작용사이에는 밀접한 상관관계가 있어 폴리페놀 함량이 높을수록 전자공여능이 높고 추출시간 이 증가할수록 그 효능이 크게 나타나는 경향이 있다고 알려져 있다.26,27)
5. 총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법28)을 변형하 여 각 농도별 추출액 0.1 ml에 10% aluminum nitrate 0.1 ml와 0.1 ml의 1 M potassium acetate 그리고 4.7 ml의 80%
ethanol를 가하여 25°C에서 40분간 반응시킨 후 415 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 표준곡선은 quercetin (Sigma-Aldrich)을 이용하여 최종농도가 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500μg/ml가 되도록 취하여 위와 동일한 방 법으로 측정한 검량선으로 발효시간별 청국장 메탄올 추출물의 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
6. 단백질 분리, 전기영동 및 Western blot
세포에 청국장 추출물을 처리하여 24시간 후 세포를 수집하여 lysis buffer로 용해한 후 고속원심분리로 단백질 을 추출하여 정량하여 동량의 단백질을 SDS-polyacryla- mide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함 유한 acrylamide gel을 PVDF membrane (Milipore Co, USA) 으로 electroblot에 의해 transfer 시킨 후, 5% skim milk를
Fig. 1. DPPH radical scavenging activities of methanolic extracts of cheonggukjang collected at various fermentation time. The results were expressed as the means +/− S.D. of three separate experiments. Different letters on bars represent statistically different values at p＜0.05.
Fig. 2. Total polyphenol contents in cheonggukjang fermented for different periods. The results were expressed as the means +/− S.D. of three separate experiments. Different letters on bars represent statistically different values at p＜0.05.
Fig. 3. Total flavonoid contents in cheonggukjang fermented for different periods. The results were expressed as the means +/− S.D. of three separate experiments. Different letters on bars represent statistically different values at p＜0.05.
함유한 TBS-T (0.1% Tween 20 in TBS)에 4°C에서 하룻밤 동안 비특이적 단백질을 blocking 시킨 다음, 특정단백질 (PGK1)에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후 TBS-T로 씻어내고 특정항체에 대한 이차 항체반응을 실시하고 형광감광용액(Super signal west pico chemiluminescent substrate, Thermo Scientific, USA) 에 적용시킨 다음 LAS-4000 mini (Fuji film, Japan)를 사용 하여 특정단백질의 양을 분석하였다.
결과 및 고찰
청국장 메탄올 추출물의 DPPH radical scavenging 활성 은 다음과 같았다. 추출물의 DPPH radical scavenging 활성 은 5시간 배양하여 만든 청국장 추출물에서 18.7%로 가 장 높은 활성을 보였으며, 5시간 이상 배양한 청국장의 경 우(13.7∼16.9%)와 배양하지 않은 청국장의 경우(13.8%)는 5시간 배양한 청국장의 추출물에 비하여 약 5% 가량 낮은 활성을 보여 주었다(Fig. 1).
총 페놀 함량의 경우도 DPPH radical scavenging 활성과 마찬가지로 5시간 발효시킨 청국장의 경우(1.10 mg/ml) 가 발효시키지 않은 청국장보다(0.93 mg/ml)로 약 8.5%
더 높은 활성을 보였으며, 발효시간이 길어질수록 오히 려 총 페놀함량이(0.84∼0.97 mg/ml) 감소되는 현상을 보 였다(Fig. 2).
Fig. 3에 나타낸 바와 같이 총 플라보노이드 함량도 5 시간 배양의 경우에 34.0μg/ml로 가장 높았으며 배양시 간이 길어질수록 28.8∼32.4μg/ml로 감소되는 경향을 보 였다. 이는 DPPH 소거능이나 총 폴리페놀 함량에서와 같은 경향을 나타내는 것으로 청국장 발효시간이 5시간 이상 길어질수록 항산화활성은 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
Fig. 4에서는 PGK1이 산화적 스트레스와 관계있는지 를 확인하기 위하여 사람 대장암세포 HT-29와 HCT116 에 산화적 스트레스로 과산화수소를 처리한 다음, 항산 화제를 처리하여 western blot 분석으로 그 발현 정도를
Fig. 4. Modulation of PGK1 expression by H2O2 and delphinidin in HT-29 (A) and HCT-116 (B) human colon cancer cells. C:
control, H: hydrogen peroxide 100μM, D: delphinidin 50μM, H+D: hydrogen peroxide 100μM＋delphinidin 50μM. β-tubulin was used as an internal control.
Fig. 5. Modulation of PGK1 expression by methanolic extracts of cheonggukjang fermented for different time in human colon carcinoma cells, HT-29 (A) and HCT116 (B). β-tubulin was used as an internal control.
살펴보았다. 실험 결과, 과산화수소를 처리한 경우에는 PGK1이 과발현되었고 항산화제로서 delphinidin을 처리 한 경우에는 PGK1의 발현이 감소하는 결과를 보이므로 써 PGK1이 산화적 스트레스와 관련이 있음을 확인하였 다.
Fig. 5에서는 발효시간별 청국장 메탄올 추출물을 사 람 대장암세포 HT-29와 HCT116에 처리하여 24시간 배
양 후 Western blot 분석에서 이미 산화적 스트레스의 biomarker로 알려져 있는 PGK1의 발현정도를 살펴보았 다.29) 그 결과 5시간 발효시킨 청국장추출물에서 PGK1 발현이 가장 낮게 발현되어 항산화효과가 가장 높는 것 을 확인할 수 있었고, 발효시간이 길어질수록 PGK1의 발현이 증가하는 것으로 보아 산화적 스트레스가 발효 시간이 길어질수록 증가함을 알 수 있었다. 이는 DPPH
소거능과 총 페놀함량 측정에서 보여주었던 결과와 동 일한 결과를 나타내는 것으로서 청국장의 발효시간이 5 시간 정도일 때 가장 높은 항산화활성을 나타내는 것을 확인하였다.
결 론
표준제조방법으로 청국장을 제조하는 과정에서 발효 시간에 따른 항산화활성 차이를 알아보기 위하여 발효 시간을 달리하여 제조한 청국장을 80% 메탄올 수용액으 로 추출하여 DPPH, 총페놀함량, 그리고 Jang 등29)의 연 구에서 산화적스트레스 단백질 biomarker로서 보고된 phosphoglycerate kinase 1 (PGK1)의 발현 등을 조사함으로 서 항산화효능을 조사하였다. 즉, 사람 대장암세포 HT-29와 HCT116에 산화적 스트레스로 과산화수소를 처 리한 다음, 항산화제를 동시에 처리하여 PGK1의 발현 정도가 변화하는 지 여부를 조사한 결과, Fig. 4에 나타낸 바와 같이 과산화수소를 처리한 경우에는 PGK1의 발현 이 증가되었고 항산화제로서 delphinidin을 처리한 경우 에는 발현이 감소하는 결과를 보여 줌으로써 PGK1이 산 화적 스트레스의 생물지표로 활용될 수 있음을 재확인 하였으며, 또한 청국장 발효시간별로 대장암세포 HT29 와 HCT116에 처리하여 PGK1 발현조절 여부를 평가해 본 결과, 5시간 발효시킨 청국장에서 PGK1발현이 가장 낮게 발현되었고, 이는 DPPH 소거능이나 총페놀 및 플 라보노이드 함량분석에서 관찰된 결과와 유사한 경향이 었다. 암세포는 정상세포보다 에너지를 획득하기 위하 여 해당작용이 활발하게 진행되며, 특히, 암조직이 일정 크기 이상으로 증가하면 암조직 내부에 hypoxia상태가 되고, 이에 따라 HIF-1alpha의 농도가 증가되어 down- stream에 존재하는 해당작용관련 효소계 그리고 신생혈 관형성과 관련이 깊은 VEGF 등의 발현을 증가시키는 것 으로 알려져 있다.30) 특히 최근 연구에 의하면 항산화 성 분이 HIF-1alpha의 proteosomal degradation을 촉진한다는 것이 보고되어 있어, 천연에 존재하는 항산화 성분의 섭 취가 형성된 암의 진행을 차단하는 효과가 있을 것으로 기대된다.
결론적으로, 본 연구를 통하여 표준 청국장 제조시 발 효시간이 5시간 정도일 때 가장 높은 항산화활성을 나타 내는 것을 확인하였다.
감사의 글
본 연구는 학술진흥재단 연구비지원(KRF-2008-532- F00018, 2008- F00069)에 의해 이루어졌습니다.
참 고 문 헌
1) Kim YS, Jung HJ, Park YS, Yu TS. Characteristics of flavor and functionality of Bacillus subtilis K-20 Cheonggukjang. Korean J Food Sci Technol 35, 475-478, 2003.
2) Lee MY, Park SY, Jung KO, Park KY, Kim SD. Quality and functional characteristics of Cheonggukjang prepared with various Bacillus sp. isolated from traditional Cheonggukjang. J Food Sci 70, M191-M196, 2005.
3) Kim SS, Lee JH, Ahn YS, Kim JH, Kang DK. A fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens D4-7 isolated from Cheonggukjang: Its characterization and influence of additive on thermostability. Korean J Microbiol Biotechnol 31, 271-276, 2003.
4) Han GH, Cho TY, Yoo MS, Kim CS, Kim JM, Kim HA, Kim MO, Kim SC, Lee SA, Ko YS, Kim SH, Kim DB.
Biogenic amines formation and content in fermented soybean paste (Cheonggukjang). Korean J Food Sci Technol 39, 541-545, 2007.
5) Lee JJ, Cho CH, Kim JY, Kee DS, Kim HB. Antioxidant activity of substance extracted by alcohol from chungkukjang powder. Korean J Microbiol 37, 177-181, 2001.
6) Chang JH, Shim YY, Kim SH, Chee KM, Cha SK.
Fibrinolytic and immuno-stimulating activities of Bacillus spp.
strains isolated from chungkukjang. Korean J Food Sci Technol 37, 255-260, 2005.
7) Kim JI, Kang MJ, Kwon TW. Antidiabetic effect of soybean and chungkukjang. Korean Soybean Digest 20, 44-52, 2003.
8) Matsui T, Yoo HJ, Hwang JS, Lee DS, Kim HB. Isolation of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from chungkukjang. Korean J Microbiol 40, 355-358, 2004.
9) Kim IJ, Kim HK, Chung JH, Jeong YK, Ryu CH. Study of functional chungkukjang contain fibrinolytic enzyme. Korean J Life Sci 12, 357-362, 2002.
10) Kwon HY. Kim YS, Kwon GS, Kwon CS. Isolation of immunostimulating strain Bacillus pumilus JB-1 from chong- kukjang and fermentational characteristics of JB-1. Korean J Microbiol Biotechnol 32, 291-296, 2004.
11) Youn HK, Choi HS, Hur SH, Hong JH. Antimicrobial activities of viscous substance from chongkukjang and fer- mented with different Bacillus spp. J Fd Hyg Safety 16, 188- 193, 2001.
12) Allagheny N, Obanu ZA, Cambell-Platt G, Owens JD. Con- trol of ammonia formation during B. subtilis fermentation of legumes. Int J Food Microbiol 29, 321-333, 1996.
13) Youn KC, Kim JO, Park BJ, Yook HS, Cho JM, Byun MW.
Quality characteristics of the Cheonggukjang fermentated by mixture culture of Bacillus natto and B. licheniformis. J Korean Soc Food Sci Nutr 31, 204-210, 2002.
14) Kim YS, Jung HJ, Park YS, Yu TS. Characteristics of flavor and funtionality of Bacillus subtilis K-20 chunggukjang. Korean J Food Sci Technol 35, 475-478, 2003.
15) 장지현. 우리나라의 장류문화. 농촌생활과학 17, 31-35, 1996.
16) Choe JS, Kim JS, Yoo SM, Park HJ, Kim TY, Chang CM, Shin SY. Survey on prepatation method and consumer response of chungkukjang. Korean Soybean Digest 13, 29-43, 1996.
17) 김정상. 콩의 생리활성에 관한 최근 연구동향. 한국콩 연구회지 13, 17-24, 1996.
18) 성미경. 대두의 항암효과에 관한 고찰. 한국콩연구회지 13, 25-31, 1996.
19) 윤기도, 권동진, 홍석산, 김수일 정건섭. 대두 및 대두발 효식품의 항돌연변이성. 산업미생물학회지 24, 525-528, 1996.
20) 정건섭, 최신양. 대두발효식품의 암세포주에 대한 세포 독성 조사. 산업미생물학회지 25, 477-483, 1997.
21) 길지은, 김기남, 박인식. 새로운 혈전용해효소의 생성 및 특성: 청국장에서 분리한 Bacillus sp. KP-6408로부터 효소생성의 최적조건. 한국식품영양과학회지 27, 51-56, 1998.
22) Dewnto V, Xianzhong W, Liu RH. Processed sweet corn has higher antioxidant activity. J Agric Food Chem 50, 4959-4964, 2002.
23) Kilani S, Ammar RB, Bouhled I, Hayder N, Mahmoud A, Ghedira K, Chekir-Ghedira l. Investigation of extracts from (Tunisian) Cyperus rotundus as antimutagens and radical scavengers. Environ Toxicol Phar 20, 478-484, 2005.
24) Choi Y, Kim MH, Shin JJ, Park JM, Lee J. The antooxidant activities of the some commercial teas. J Korean Soc Food Sci Nutr 32, 723-727, 2003.
25) Kang YH, Park YK, Lee GD. The nitrite scavenging and electron donating ability of phenolic compounds. Korean J Food Sci Technol 28, 232-239, 1996.
26) Seog HM, Seo MS, Kim SR, Park YK, Lee YT. Characteristics of barley polyphenol extract (BPE) separated from pearling by-products. Korean J Food Sci Technol 34, 775-779, 2002.
27) Kim HK, Choi YJ, Kim KH. Functional activities of mi- crowave-assisted extracts from Flammulina velutipes. Korean J Food Sci Technol 34, 1013-1017, 2002.
28) Nieva Moreno MI, Isla MI, Sampietro AR, Vattuone MA.
Comparison of the free radical-scavenging activity of propolis from several regions of Argentina. J Ethnopharmacol 71, 109- 114, 2000.
29) Jang CH, Lee IA, Ha YR, Lim J, Sung MK, Lee SJ, Kim JS. PGK1 induction by a hydrogen peroxide treatment is suppressed by antioxidants in human colon carcinoma cells.
Bioscience Biotechnology and Biochemistry 72, 1799-1808, 2008.
30) Chao Wan, SR Gilbert, Y Wang, X Cao, X Shen, G Ramaswamy, KA Jacobsen, ZS Alaql, AW Eberhardt, LC Gerstenfeld, TA Einhorn, L Deng, TL Clemens. Activation of the hypoxia-inducible factor-1α pathway accelerates bone regeneraation. PNAS 105, 686-691, 2008.
