들깨박으로부터 항산화 활성 물질의 동정
⁃ 연구노트 ⁃
정경한1․정윤희1․남정호2․김태훈1
1대구대학교 식품공학과
2농업회사법인 동방제유(주)
Characterization of Antioxidant Constituents from Perilla Cake
Gyeong Han Jeong1, Yun Hee Jeong1, Jung Ho Nam2, and Tae Hoon Kim1
1Department of Food Science and Biotechnology, Daegu University
2Dongbang Food Co., Ltd.
ABSTRACT The antioxidant capacity of the hot water extract of defatted Perilla cake were evaluated using DPPH and ABTS+ radical scavenging assays. The extracts of four solvent fractions (n-hexane layer, EtOAc layer, n-BuOH layer, and residue) of the hot water extract were also investigated. In particular, the radical scavenging activity of the EtOAc-soluble portion from defatted Perilla cake was higher than those of the other solvent-soluble layers. This paper reports the chromatographic isolation and characterization of ten phenolic constituents of previously known struc- tures, rosmarinic acid 3-O-glucoside (1), rosmarinic acid (2), caffeic acid (3), p-coumaric acid (4), vanillic acid (5), vanillin (6), protocatechuic acid (7), protocatechuic aldehyde (8), p-hydroxybenzoic acid (9), and p-hydroxybenzaldehyde (10). The chemical structures of these isolated compounds were identified by neclear magnetic resonance (NMR) spectro- scopy and mass spectrometry methods. Among the compounds tested, rosmarinic acid (2) and protocatechuic aldehyde (8) showed the most potent DPPH radical scavenging activities with IC50 values of 34.1±0.8 and 74.2±1.2 μM, respectively. In addition, these two compounds showed significant ABTS+ radical scavenging capacities. These results suggest that the radical scavenging activities of defatted Perilla cake are closely correlated with the presence of phenolic compounds.
Key words: defatted Perilla cake, phenolic constituent, radical scavenging, DPPH, ABTS+
Received 29 April 2020; Accepted 15 June 2020
Corresponding author: Tae Hoon Kim, Department of Food Science and Biotechnology, Daegu University, Gyeongsan, Gyeongbuk 38453, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-53-850-6533
Author information: Gyeong Han Jeong (Graduate student), Yun Hee Jeong (Graduate student), Tae Hoon Kim (Professor)
서 론
현대인들은 자외선, 흡연, 매연, 방사선 및 스트레스 등의 여러 가지 요인에 의해 인체의 산화에 대한 방어체계가 붕괴 하며(Videla와 Fernández, 1988), 이로 인해 생성된 su- peroxide, nitric oxide, nitrogen dioxide, hydroxyl 및 peroxynitrite 등과 같은 활성산소종(reactive oxygen spe- cies)은 산화적 스트레스를 유발하게 된다(Halliwell과 Aruoma, 1991). 과도하게 생성된 산화적 스트레스는 세포 의 구성 성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등을 비선택적 및 비가역적 파괴를 촉진하여 노화 및 각종 질병을 유발한다 (Valko 등, 2004). 특히 피부, 암 및 심혈관계 등의 질환과 밀접한 상관관계가 잘 알려져 있다(Fang 등, 2002). 항산화 물질은 활성산소종을 중화시켜 노화 방지 및 관련 질병을
예방하는데, 대표적인 항산화제로는 butylated hydroxy anisole 및 butylated hydroxy toluene등의 합성 항산화제 가 있으나(Branen, 1975; Jennings와 Akoh, 2009), 이들 을 장기 복용하면 암 유발 및 지질대사 불균형 등의 부작용 을 유발할 수 있어 사용 제한을 권고하고 있다(William 등, 1999). 따라서 보다 안전하고 부작용이 적은 천연물 유래 천연 항산화제의 개발연구가 지속해서 진행되고 있다(Pod- sedek, 2007).
들깨(Perilla frutescens)는 꿀풀과 한해살이풀로 인도의 고지와 중국 중남부 등이 원산지이며, 한국 등에서도 재배되 고 있다. 들깨는 잎을 생으로 먹거나 장아찌 형태로 섭취하 며, 들깨 종자는 기름으로 착유한 들기름으로 섭취하는데 주요 성분으로 불포화지방산인 linolenic acid가 풍부하게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Longvah 등, 2000). 그 외에도 들깨에는 플라보노이드 및 phenylpropanoid 등의 폴리페놀류 화합물을 함유하며(Lee 등, 2013), 항산화(Jun 등, 2014; Nagatsu 등, 1995), 항염증(Yamamoto 등, 1998), 항균(Yamamoto와 Ogawa, 2002) 및 항당뇨(Ha 등, 2012) 등의 다양한 생리활성이 보고되어 있다. 최근 천연물을 가공 후 발생하는 부산물을 기능성 소재로 활용하기 위한 연구가
COOH
OH R
CHO
OH R HO
R COOH
RO OH
O O COOH
OH OH 1 R = Glucoside 2 R = H
5 R = OCH3 7 R = OH 9 R = H 3 R = OH
4 R = H 6 R = OCH3
8 R = OH 10 R = H
Fig. 1. Chemical structures of the isolated compounds 1∼10 from Perilla cake. 1, rosmarinic acid 3-O-glucoside; 2, rosmarinic acid; 3, caffeic acid; 4, p-coumaric acid; 5, vanillic acid; 6, vanillin; 7, protocatechuic acid; 8, protocatechiuc aldehyde; 9, p-hydrox- ybenzoic acid; 10, p-hydroxybenzaldehyde.
활발히 진행 중이며, 그중 참깨(Sesamum indicum)를 기름 으로 착유하고 남은 가공부산물의 70% EtOH 추출물에서 우수한 DPPH 및 oxygen 라디칼 소거 활성이 보고되었으며 (Othman 등, 2015), 올리브(Olea europaea) 가공부산물로 부터 항산화 활성을 나타내는 페놀성 화합물이 LC-MS로 동정되었다(Moudache 등, 2016). 또한 석류(Punica gran- atum) 가공부산물은 우수한 라디칼 소거 활성 및 α-gluco- sidase를 효과적으로 저해하는 결과가 보고됐으며(Ambi- gaipalan 등, 2016), 와인 가공 후의 포도(Vitis vinifera) 찌꺼기에서도 항산화 활성을 나타내는 새로운 flavan 3-ols 유도체가 분리되었다(Torres와 Bobet, 2001; Torres 등, 2002).
본 연구에서는 들깨박 열수 추출물을 각종 유기용매를 활 용하여 극성별로 분획 후 이들 소재에 대해서 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH) 및 2,2′-azino-bis-3-ethyl- benzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS+) 라디칼을 활용 한 항산화 활성을 평가하였다. 그 결과 ethyl acetate (EtOAc) 분획물에서 가장 우수한 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 활성지표 탐색법을 수행하여 10종 의 페놀성 화합물을 분리하였다. 분리 화합물은 nuclear magnetic resonance(NMR) 및 fast atom bombardment mass(FABMS) 스펙트럼 측정과 표준품과의 HPLC 직접 비 교분석을 통하여 화합물을 동정하였다. 본 연구에서는 들깨 박 열수추출물의 EtOAc 층으로부터 분리된 화합물에서 우 수한 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 확인하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
재료 및 방법
재료
본 실험에 시료로 사용한 들깨는 2018년 5월에 전라남도 신안군에서 채취한 신선한 들깨를 사용하였으며, 들깨박은 (주)동방제유(Yeongcheon, Korea)에서 제조하였다. 들깨 20 kg을 볶음솥(D-1692, Dongkwang Oil Machine Co., Seoul, Korea)에 넣고 290°C에서 6분 동안 볶음 처리 후 착유기(D-1880, Dongkwang Oil Machine Co.)를 이용하 여 착유하고 남은 들깨박을 사용하였다. 표본시료는 대구대
학교의 식품공학과 천연물화학 실험실에 보관하였다. 기능 성 평가에 사용된 (+)-catechin, DPPH 및 ABTS+ 등의 시 약은 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 물질 분리에는 역상 HPLC(LC- 20A, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 1H, 13C- NMR과 HSQC 및 HMBC 스펙트럼은 CD3OD(δH 3.35, δC
49.5) 용매(Sigma-Aldrich Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 600 MHz의 NMR spectrometer(FT-NMR, Varian VNS 600, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였으며, 분석 및 컬럼크 로마토그래피용 용매는 특급시약을 사용하였다.
추출 및 분획
들깨박 9 kg을 분쇄기(HMF-3250S, Hanil Electric Co., Seoul, Korea)로 잘게 마쇄한 후 증류수(60 L)에 침지하여 70°C에서 90분 동안 열수 추출 후 농축하였다. 열수 추출물 의 경우 EtOH 추출물보다 DPPH 라디칼 소거능이 상대적으 로 우수하였으며 총 페놀 함량도 높은 것으로 확인하여 열수 추출물을 대상 시료로 결정하였다. 얻어진 열수 추출물 (629.0 g)을 10% methyl alcohol(MeOH)에 현탁한 다음 n-hexane으로 분획한 후 수층을 다시 EtOAc, n-butyl al- cohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 용매 분획을 실시하였다. 각 분획물을 감압 농축하여 건조한 후 n-hex- ane 분획물(16.1 g), EtOAc 분획물(43.0 g), n-BuOH 분획 물(25.9 g), H2O 분획물(338.8 g)을 각각 얻었다. 유기용매 별 분획물에 대해 항산화 활성과 관련된 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가를 수행하였으며, 그중 EtOAc 분획물 에서 IC50(half maximal inhibitory concentration)값이 각 각 167.5±1.8과 28.0±1.1 μg/mL로 다른 유기 용매 분획물 에 비해 상대적으로 우수한 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 나타내어 EtOAc 분획물에 대해 활성지표 탐색법을 수행하여 활성 물질의 분리를 실시하였다.
화합물 분리 및 구조결정
EtOAc 분획물 20 g을 H2O-MeOH 혼합용매를 용출용매 로 사용하여 Toyopearl HW-40(coarse grade; 4.0 cm i.d.×40 cm, Tosoh Co., Tokyo, Japan)을 충진제로 사용 한 컬럼크로마토그래피를 실시하여 총 5개의 용리액[PF01:
H2O-MeOH(100:0), PF02: H2O-MeOH(80:20), PF03:
H2O-MeOH(60:40), PF04: H2O-MeOH(40:60), PF05:
H2O-acetone(30:70)]을 얻었다. 이후 PE02 용리액에 대해 YMC gel ODS AQ 120S(1.0 cm i.d.×40 cm, YMC Co., Kyoto, Japan)를 충진제로 이용한 컬럼크로마토그래피 및 ODS column(YMC gel ODS A-323, 4.6 mm×150 mm, YMC Co.)을 이용한 semi-preparative HPLC를 수행하여 vanillin(6) 3.1 mg, protocatechuic acid(7) 7.6 mg, pro- tocatechuic aldehyde(8) 16.5 mg 및 p-hydroxybenzal- dehyde(10) 17.4 mg을 분리하였다. 또한 PE03 용리액에 대해 같은 방법을 사용하여 rosmarinic acid 3-O-gluco- side(1) 33.3 mg, rosmanrinic acid(2) 184.3 mg, caffeic acid(3) 14.0 mg, p-coumaric acid(4) 5.8 mg, vanillic acid(5) 57.4 mg 및 p-hydroxybenzoic acid(9) 8.0 mg을 분리 정제하였다(Fig. 1). HPLC 분석은 gradient elution으 로 수행하였으며, 이동상 용매는 0.1% formic acid(solvent A)와 acetonitrile(solvent B)을 사용하여 100% A; 0% B로 시작하여 30분까지 0% A; 100% B의 용매조성으로 물질을 분석하였으며, 이동상의 유속은 1.0 mL/min을 유지하였고 280 nm에서 화합물을 검출하였다.
Rosmarinic acid 3-O-glucoside(1): Yellow amor- phous powder, FABMS m/z 523 [M+H]+; 1H-NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 7.59(1H, d, J=15.6 Hz, H-7), 7.52 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2), 7.17(1H, dd, J=7.8, 2.4 Hz, H-6), 6.86(1H, d, J=7.8 Hz, H-5), 6.76(1H, d, J=2.4 Hz, H-2′), 6.70(1H, d, J=8.4 Hz, H-5′), 6.61(1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-6′), 6.36(1H, d, J=15.6 Hz, H-8), 5.17(1H, dd, J=7.8, 4.2 Hz, H-8′), 4.82(1H, d, J=7.8 Hz, H-1″), 3.97(1H, dd, J=11.4, 2.4 Hz, H-6″), 3.72(1H, dd, J=
11.4, 6.0 Hz, H-6″), 3.52(1H, m, H-5″), 3.50(1H, m, H-2″), 3.48(1H, m, H-3″), 3.39(1H, t, J=9.6 Hz, H-4″), 3.08(1H, dd, J=14.4, 4.2 Hz, H-7′), 3.00(1H, dd, J=14.4, 7.8 Hz, H-7′); 13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δ 168.7 (C-9), 168.3(C-9′), 151.2(C-3), 147.1(C-7), 147.0(C- 4), 146.1(C-3′), 145.2(C-4′), 129.3(C-1′), 127.9(C-1), 123.6(C-6), 121.8(C-6′), 118.1(C-2), 117.7(C-2′), 117.4 (C-5), 116.3(C-5′), 115.4(C-8), 104.2(C-1″), 78.3(C- 3″), 77.6(C-5″), 74.9(C-2″), 74.5(C-8′), 71.5(C-4″), 62.5(C-6″), 37.8(C-7′).
Rosmarinic acid(2): Yellow amorphous powder, FABMS m/z 361 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz):
δ 7.54(1H, d, J=15.6 Hz, H-7), 7.03(1H, d, J=2.4 Hz, H-2), 6.93(1H, dd, J=7.8, 2.4 Hz, H-6), 6.77(1H, d, J=7.8 Hz, H-5), 6.74(1H, d, J=2.4 Hz, H-2′), 6.69(1H, d, J=8.4 Hz, H-5′), 6.60(1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-6′), 6.26(1H, d, J=15.6 Hz, H-8), 5.18(1H, dd, J=7.8, 4.2 Hz, H-8′), 3.08(1H, dd, J=15.0, 4.2 Hz, H-7′), 3.00(1H,
dd, J=15.0, 7.8 Hz, H-7′); 13C-NMR(CD3OD, 150 MHz):
δ 173.5(C-9′), 168.4(C-9), 149.7(C-4), 147.7(C-7), 146.8(C-3), 146.1(C-3′), 145.3(C-4′), 129.3(C-1′), 127.6 (C-1), 123.1(C-6), 121.8(C-6′), 117.6(C-2′), 116.5(C- 5), 116.3(C-2), 115.2(C-5′), 114.4(C-8), 74.7(C-8′), 37.
(C-7′).
Caffeic acid(3): White amorphous powder, FABMS m/z 181 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ 7.51 (1H, d, J=15.6 Hz, H-7), 7.02(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 6.92(1H, dd, J=7.8, 1.8 Hz, H-6), 6.77(1H, d, J=7.8 Hz, H-5), 6.21(1H, d, J=15.6 Hz, H-8); 13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δ 169.0(C-9), 148.5(C-4), 147.9(C-7), 145.3 (C-3), 128.1(C-1), 121.1(C-6), 117.2(C-5), 116.8(C-2), 114.0(C-8).
p-Coumaric acid(4): White amorphous powder, FABMS m/z 165 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz):
δ 7.59(1H, d, J=16.2 Hz, H-7), 7.44(2H, d, J=9.0 Hz, H-2, 6), 6.80(2H, d, J=9.0 Hz, H-3, 5), 6.27(1H, d, J= 16.2 Hz, H-8); 13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δ 171.1 (C-9), 161.2(C-4), 146.5(C-7), 131.1(C-2, 6), 127.3 (C-1), 115.7(C-3, 5), 112.0(C-8).
Vanillic acid(5): Yellow amorphous powder, FABMS m/z 169 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ 7.54 (1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6), 7.53(1H, d, J=1.8 Hz, H- 2), 6.83(1H, d, J=8.4 Hz, H-5), 3.83(3H, s, 3-OCH3).
Vanillin(6): Yellow amorphous powder, FABMS m/z 153 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ 9.74(1H, s, CHO), 7.44(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 7.42(1H, dd, J=7.2, 1.8 Hz, H-6), 6.94(1H, d, J=7.2 Hz, H-5), 3.83(3H, s, 3-OCH3).
Protocatechuic acid(7): Yellow amorphous powder, FABMS m/z 155 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz):
δ 7.51(1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6), 7.50(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 6.78(1H, d, J=8.4 Hz, H-5).
Protocatechuic aldehyde(8): Yellow amorphous powder, FABMS m/z 139 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ 9.68(1H, s, CHO), 7.30(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 7.29(1H, dd, J=7.2, 1.8 Hz, H-6), 6.90(1H, d, J= 7.2 Hz, H-5).
p-Hydroxybenzoic acid(9): White amorphous pow- der, FABMS m/z 139 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ 7.87(2H, d, J=8.4 Hz, H-2, 6), 6.81(2H, d, J=8.4 Hz, H-3, 5).
p-Hydroxybenzaldehyde(10): White amorphous powder, FABMS m/z 123 [M+H]+; 1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ 9.76(1H, s, CHO), 7.77(2H, d, J=9.0 Hz, H-2, 6), 6.90(2H, d, J=9.0 Hz, H-6).
Table 1. DPPH and ABTS+ radical scavenging activities of Perilla cake extract and its organic solvent-soluble portions
Extract and fractions IC50 values (μg/mL)1)
DPPH ABTS+
Hot water ext.
n-Hexane layer EtOAc layer n-BuOH layer H2O layer (+)-Catechin2)
281.5±4.1b
>500a 167.5±1.8c
>500a
>500a 11.8±0.8d
71.5±2.7b
>500a 28.0±1.1c 62.6±2.1b
>500a 6.7±0.3d
1)All tested samples were examined in triplicated experiments.
Different letters (a-d) within the same column indicate sig- nificant differences (P<0.05).
2)Positive control.
DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 측정
들깨 가공부산물로부터 분리된 페놀성 화합물의 DPPH 라디칼 소거능 평가는 Blois(1958)가 행한 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 각 시료 용액 120 μL에 0.45 mM 의 DPPH 용액(in EtOH) 60 μL를 넣고 교반하여 15분간 방치한 다음 ELISA reader(Infinite F200, Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)를 이용하여 517 nm에서 흡광도 를 측정하였다.
ABTS+ 라디칼 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 7 mM ABTS+와 2.4 mM K2O8S2 을 동량으로 혼합 후 실온의 암실에서 12시간 방치하여 라 디칼의 생성을 유도한 다음 ABTS+ 라디칼 용액의 흡광도 값이 734 nm에서 0.7~0.8 정도가 되도록 희석하여 사용하 였다. 희석한 ABTS+ 라디칼 용액 100 μL와 들깨박 추출물 및 단일물질 100 μL를 혼합하여 실온에서 7분간 반응시킨 후 ELISA reader로 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가에 사용한 양성 대조군은 천연 항산화제로 알려진 (+)-catechin을 사용하 였으며, 들깨박 추출물과 분획물 및 분리된 단일물질의 라디 칼 소거 활성은 시료가 DPPH 및 ABTS+ 라디칼을 50% 소 거하는 농도인 IC50 값으로 나타내었다.
통계처리
실험 결과는 SPSS package program(version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 실험군 간의 유의성을 검증한 후 Duncan’s multiple range test로 P<
0.05에서 의미를 부여하였다.
결과 및 고찰
들깨박 추출물의 항산화 활성
들깨를 착유하고 남은 부산물을 기능성 소재로 활용하기 위해 열수를 이용하여 추출하였다. 얻어진 열수 추출물을 유기용매를 이용하여 극성별로 분획하였고, 열수 추출물 및 각 분획물을 대상으로 항산화 활성과 관련된 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가를 수행하였다(Table 1). 들
깨박 열수 추출물의 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평 가에서 IC50값은 각각 281.5±4.1과 71.5±2.7 μg/mL를 나 타냈으며 n-BuOH 분획물은 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가 에서 IC50값이 62.6±2.1 μg/mL를 나타내었으나, DPPH 라 디칼 소거능에서는 IC50값이 >500 μg/mL 이상으로 다소 약한 활성을 나타내었다. 또한 n-hexane 및 H2O 분획물에 서 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가의 IC50값이 500 μg/mL 이상으로 다소 미미한 소거 활성을 나타내었다. 마지 막으로 EtOAc 분획물에서 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거능 의 IC50값이 각각 167.5±1.8과 28.0±1.1 μg/mL로 다른 유 기용매 분획물보다 가장 우수한 라디칼 소거 활성을 나타내 었다. 이에 EtOAc 분획물에서 항산화 활성을 나타내는 화합 물이 다량 함유되어 있음을 확인하고 활성지표 탐색법을 수 행하였으며 활성 물질의 분리 및 구조 동정을 수행하였다.
단일물질 분리 및 구조 동정
EtOAc 분획물을 대상으로 Toyopearl HW-40 및 ODS gel을 충진제로 이용한 컬럼크로마토그래피를 수행하여 10 종의 페놀 유도체를 분리하였다. 분리된 화합물은 1H 및
13C-NMR과 HSQC, HMBC 및 FABMS 스펙트럼을 측정하 여 구조를 동정하였다.
화합물 1은 노란색의 분말상 형태로 분리되었으며, FABMS 스펙트럼 측정 결과 m/z 523 [M+H]+에서 ion peak를 확 인하였다. 1H-NMR 스펙트럼의 aromatic proton 영역에서 벤젠고리 유래의 두 쌍의 ABX-type signals이 δH 7.52(1H, d, J=2.4 Hz, H-2), 7.17(1H, dd, J=7.8, 2.4 Hz, H-6), 6.86(1H, d, J=7.8 Hz, H-5), 6.76(1H, d, J=2.4 Hz, H-2′), 6.70(1H, d, J=8.4 Hz, H-5′) 및 6.61(1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-6′)에서 관찰되었고, 한 쌍의 trans-olifinic protons 이 δH 7.59(1H, d, J=15.6 Hz, H-7) 및 6.36(1H, d, J=15.6 Hz, H-8)이 관찰되었다. 그리고 한 개의 oxygenated pro- ton signal이 δH 5.17(1H, dd, J=7.8, 4.2 Hz, H-8′)과 한 개의 methylene proton signals이 δH 3.08(1H, dd, J=14.2, 4.24 Hz, H-7)과 3.00(1H, dd, J=14.4, 7.8 Hz, H-7)에서 관찰되었다. 이들 signal로 화합물 1은 rosmarinic acid 유 도체임을 시사하였다. 추가로 anomeric proton signal이 δH
4.82(1H, d, J=7.8 Hz, H-1″)에서 관찰되었고, 당에 해당하 는 carbon signals이 δC 104.2(C-1″), 78.3(C-3″), 77.6 (C-5″), 74.9(C-2″), 71.5(C-4″) 및 62.5(C-6″)에서 관찰 되어 한 개의 glucose가 존재함을 확인하였다. 이 glucose 의 결합 위치를 결정하기 위하여 HMBC 등의 2D NMR을 측정한 결과, 화합물 1은 rosmarinic acid의 3번 위치에 glucose가 결합한 rosmarinic acid 3-O-glucoside로 구조 를 동정하였고, 문헌(Ha 등, 2012)의 결과와 일치하였다.
화합물 2 역시 노란색의 분말상 형태로 분리하였으며,
1H-NMR 스펙트럼 측정 결과 두 쌍의 ABX type의 ar- omatic proton signals이 δH 7.03(1H, d, J=2.4 Hz, H-2), 6.93(1H, dd, J=7.8, 2.4 Hz, H-6), 6.77(1H, d, J=7.8 Hz,
Table 2. DPPH and ABTS+ radical scavenging activities of the isolated compounds 1∼10
Compounds IC50 values (μM)1) DPPH ABTS+ Rosmarinic acid 3-O-glucoside (1)
Rosmarinic acid (2) Caffeic acid (3) p-Coumaric acid (4) Vanillic acid (5) Vanillin (6)
Protocatechuic acid (7) Protocatechiuc aldehyde (8) p-Hydroxybenzoic acid (9) p-Hydroxybenzaldehyde (10) (+)-Catechin2)
77.8±1.6c 34.1±0.8d 82.7±1.8c
>300a
>300a
>300a 147.3±3.6b 74.2±1.2c
>300a
>300a 28.9±1.1e
64.8±1.3c 20.6±1.0e 41.4±1.6d 89.9±2.5b
>300a
>300a 69.1±1.1c 14.4±0.8f
>300a
>300a 13.3±1.2f
1)All tested samples were examined in triplicated experiments.
Different letters (a-f) within the same column indicate sig- nificant differences (P<0.05).
2)Positive control.
H-5), 6.74(1H, d, J=2.4 Hz, H-2′), 6.69(1H, d, J=8.4 Hz, H-5′) 및 6.60(1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-6′)에서 관찰되었 다. 그리고 trans-olifinic protons이 δH 7.54(1H, d, J=15.6 Hz, H-7) 및 6.26(1H, d, J=15.6 Hz, H-8)과 oxygenated proton signal이 δH 5.18(1H, dd, J=7.8, 4.2 Hz, H-8′)과 methylene proton signals이 δH 3.08(1H, dd, J=15.0, 4.2 Hz, H-7′), 3.00(1H, dd, J=15.0, 7.8 Hz, H-7′)에서 관찰되 었다. 또한 13C-NMR 스펙트럼에서 두 개의 carbonyl기 signal이 각각 δC 173.5(C-9′) 및 168.4(C-9)에서 관찰되 었다. 이상의 분광학적 결과는 Lee 등(2013)의 결과와 일치 하였으며, HPLC를 이용하여 표준품과의 tR 비교를 통해 화 합물 2는 rosmarinic acid로 동정하였다.
화합물 3은 FABMS 측정 결과 m/z 181 [M+H]+의 ion peak를 확인하였으며, 1H-NMR 스펙트럼 측정 결과 ABX type의 aromatic proton signals이 δH 7.02(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 6.92(1H, dd, J=7.8, 1.8 Hz, H-6) 및 6.77(1H, d, J=7.8 Hz, H-5)에서 관찰되었고, trans-olifinic protons 이 δH 7.51(1H, d, J=15.6 Hz, H-7) 및 6.21(1H, d, J=15.6 Hz, H-8)에서 관찰되었다. 13C-NMR 데이터 해석 결과 car- bonyl기 signal이 δC 169.0(C-9)에서 관찰되었고, 6개의 aromatic carbons과 한 쌍의 trans-olifinic carbons이 관 찰되었다. 이상의 결과는 문헌치(Zhou, 2014)와 일치하였 고, 화합물 3은 caffeic acid로 동정하였다.
화합물 4의 1H-NMR 스펙트럼 데이터를 해석한 결과 벤 젠 유래 A2B2 type의 aromatic protons이 δH 7.44(2H, d, J=9.0 Hz, H-2, 6) 및 6.80(2H, d, J=9.0 Hz, H-3, 5)에서 관찰되었고, δH 7.59(1H, d, J=16.2 Hz, H-7) 및 6.27(1H, d, J=16.2 Hz, H-8)에서 전형적인 trans-olifinic proton signal이 관찰되었다. 이상의 분광학적 결과는 문헌치(An 등, 2008)와 일치하였으며, HPLC를 이용하여 표준품과 tR 비교를 통해 화합물 4는 p-coumaric acid로 동정하였다.
화합물 5의 1H-NMR 스펙트럼 측정 결과 ABX type의 aromatic proton signals이 δH 7.54(1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6), 7.53(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 6.83(1H, d, J=8.4 Hz, H-5)이 관찰되었고, δH 3.83(3H, s, 3-OCH3)의 signal이 관찰되어 methoxy기의 존재가 시사되었다. 화합물 5는 문 헌치(Zhou 등, 2014)와 함께 HPLC를 이용한 tR 비교를 통 해 vanillic acid로 구조를 동정하였다. 화합물 6은 화합물 5와 매우 유사한 1H-NMR 스펙트럼이 측정되었으며, 추가 로 aldehyde 유래 proton signal이 δH 9.74(1H, s, CHO)에 서 관찰되어 화합물 6은 vanillin으로 구조를 동정하였다 (He와 Liu, 2006).
화합물 7과 8은 노란색의 분말상 형태로 정제되었으며, FABMS 측정결과 각 m/z 155 및 139 [M+H]+의 ion peak 를 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼 측정 결과 공통으로 벤 젠 유래의 ABX type의 proton signal이 측정되었다. 하지 만 화합물 8에서는 aldehyde 유래의 proton signal이 δH 9.68(1H, s, CHO)에서 관찰되었다. 이상의 분광학적 결과는
문헌(Lee 등, 2011)과 일치하였고, HPLC를 이용하여 표준 품과의 tR 비교를 통해 화합물 7은 protocatechuic acid, 8은 protocatechuic aldehyde로 구조 동정하였다.
화합물 9와 10은 흰색의 분말상 형태로 분리되었으며,
1H-NMR 스펙트럼 측정 결과 A2B2 type의 벤젠 유래 ar- omatic proton signal이 측정되었고, 화합물 10에서는 δH
9.76(1H, s, CHO)에서 aldehyde 유래의 signal을 확인하였 다. 이상의 분광학적 결과는 문헌(Cho 등, 1998)과 일치하 였고, HPLC를 이용하여 표준품과의 tR 비교를 통해 화합물 9는 p-hydroxybenzoic acid, 10은 p-hydroxybenzalde- hyde로 구조를 동정하였다(Fig. 1). 얻어진 순수한 화합물 은 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가를 수행하였다.
분리된 페놀성 화합물의 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 들깨박 열수 추출물의 EtOAc 분획물로부터 분리된 순수 한 페놀성 화합물에 대하여 항산화 활성과 관련된 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가를 수행하였다(Table 2). 그 결과 p-coumaric acid(4)의 DPPH 라디칼 소거능은 IC50값 이 300 μM 이상으로 라디칼 소거능이 나타나지 않았으나, ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가에서는 IC50값이 89.9±2.5 μM 의 소거 활성을 나타내었다. 화합물 3은 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성의 IC50값이 각각 82.7±1.8, 41.4±1.6 μM 로 화합물 4보다 우수한 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 또 한 rosmarinic acid 3-O-glucoside(1)는 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성 평가에서 IC50값이 각각 77.8±1.6, 64.8±
1.3 μM의 활성을 나타내었고, 화합물 1의 aglycone인 ros- marinic acid(2)는 IC50값이 각각 34.1±0.8 및 20.6±1.0 μM의 활성을 나타내어 배당체보다 aglycone에서 보다 더 강한 라디칼 소거 활성을 나타냄을 확인하였다. 그리고 pro- tocatechuic acid(7)는 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거능의 IC50값이 각각 147.3±3.6, 69.1±1.1 μM의 라디칼 소거 활
성을 나타내었으며, protocatechuic aldehyde(8)의 IC50값 은 74.2±1.2, 14.4±0.8 μM로 화합물 7보다 상승한 라디칼 소거 활성을 확인하였다. 하지만 다른 저분자 페놀 화합물들 (5, 6, 9 및 10)은 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성의 IC50값이 300 μM 이상으로 다소 미미한 라디칼 소거능을 나타내었다(Table 2). 이상의 연구 결과 들깨를 기름으로 착유하고 남은 들깨박으로부터 항산화 활성을 나타내는 페 놀성 화합물이 다량 함유되어 있음을 확인하였고, 향후 폐기 되는 들깨박을 기능성 소재로 활용하기 위한 기초자료로 이 용될 수 있을 것으로 사료된다.
요 약
들깨박의 열수 추출물의 EtOAc 가용부는 DPPH 및 ABTS+ 라디칼을 활용한 라디칼 소거능 평가에서 IC50값이 각각 167.5±1.8, 28.0±1.1 μg/mL로 우수한 라디칼 소거 활성을 나타냄을 확인하였다. 활성성분 동정을 위하여 EtOAc 분획 물에 대해 반복적인 컬럼크로마토그래피를 활용하여 활성 물질의 분리 및 정제를 수행하여 10종의 페놀성 화합물을 분리하였고, 각 화합물의 구조는 NMR, FABMS 스펙트럼 해석 및 표품과의 HPLC 직접 비교를 통하여 rosmarinic acid 3-O-glucoside(1), rosamrinic acid(2), caffeic acid (3), p-coumaric acid(4), vanillic acid(5), vanillin(6), protocatechuic acid(7), protocatechuic aldehyde(8), p- hydroxybenzoic acid(9) 및 p-hydroxybenzaldehyde(10) 로 동정하였다. 분리된 화합물에 대해 라디칼 소거 활성을 평가한 결과, romarinic acid(2)가 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 에 대해 가장 우수한 라디칼 소거 활성(IC50＝34.1±0.8, 20.6±1.0 μM)을 나타냄을 확인하였으며, 또한 caffeic acid (3)는 DPPH 및 ABTS+ 라디칼에 대해 IC50값이 각각 82.7
±1.8, 41.4±1.6 μM의 라디칼 소거능을 확인하였다. 들기 름 착유 후의 들깨박에는 우수한 라디칼 소거능을 나타내는 다량의 페놀성 화합물이 함유되어 있는 것을 확인하였으며, 향후 세포 및 동물을 활용한 연구를 통하여 기능성 소재로서 의 추가 검증이 필요하다고 생각된다.
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