사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 유 용 욱. 원광대학교 치의학과 및 원광식품산업연구원. 1. 연구의 필요성 1.1. 연구배경 치아우식증과 치주병은 치과영역에서 가장 흔한 만성질환으로 알려져 있다. 치아우식증은 법랑 질, 백악질, 상아질등과 같은 치아의 경조직이 점차 비가역적으로 파괴되는 질환으로서 일반적으 로는 충치라고 알려져 있으며, 치주병은 치아 주위의 연조직 및 치조골이 만성염증으로 파괴되어 잇몸에서 출혈이 일어나고, 이가 흔들리며, 최후에는 치아를 상실하는 질환으로서 일반적으로 풍 치라고 알려져 있다 (Xu 등, 2011; 민 등, 2007; 김 등, 1987). 치아우식증 및 치주병은 전 세 계적으로 널리 만연된 대표적인 구강질환으로서 아직도 치아 상실의 주된 원인질환이므로 그 효과 적인 관리대책이 절실히 요구되고 있다(Xu 등, 2011; Hanada, 2000; Asikainen 과 Alauusua, 1993 ; Tanzer, 1979). 치아우식증 및 치주질환의 주된 원인은 치은연상 및 치은연하 치면세균막 에 의하여 유발되는데, 치면세균막에는 많은 함량의 미생물이 존재하는 것으로 알려져 있다. 치면세 균막내 미생물은 당질을 대사하여 유기산을 형성함으로 치아의 경조직을 파괴하고, 미생물에 대한 인 체의 염증 반응은 치주병을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. Streptococcus mutans (S. mutans) 및 mutans streptococci종류에 속해있는 구강세균들이 치면세균막형성에 가장 중요한 역할을 수 행하는 것으로 알려져 있으며, S. mutans는 치아우식을 일으키는 주요 원인균으로도 주목받고 있 다(민 등, 2007; 장 등, 1998; Koga 등, 1986). S. mutans를 비롯한 구강미생물은 구강내의. 134. 2013년 기초연구과제총서.

(2) 타액단백질과 섭취한 음식물에 포함된 탄수화물, 특히 자당(sucrose)을 분해하여 발생하는 glucose와 fructose를 이용하여 치면세균막을 형성하는 것으로 알려져 있다 (김과 최, 1991).. 치면세균막의 형성은 다단계의 복잡한 과정을 거쳐서 형성이 되는데 (그림 1) 처음에는 획득피 막표면(그림1,A)에 S. mutans를 비롯한 구강미생물의 침착(capture)이 먼저 일어난다(그림1,B). 치면세균막형성 초기의 미생물 침착은 가역적인 결합으로 이온결합 및 반데르발스 결합 등에 의하 여 일어나게 되며, 시간이 지남에 따라서 침착된 구강미생물들은 획득피막이 덮고 있는 치아표면 과 비가역적인 부착 (irreversible adhesion)을 이루게 된다. 이때, 미생물의 세포벽에 존재하는 teichoic acid와 획득피막이 덮고 있는 치아표면은 모두 음전하를 띠기 때문에 2가 양이온인 칼슘 이 매개를 하여 비가역적인 부착을 유발하는데 이를 calcium bridge라 한다. 미생물과 획득피막 이 덮고 있는 치아표면과는 calcium bridge 이외에도 소수성결합 (hydrophobic interaction), polymer bridge 및 공유결합이 비가역적인 부착의 주요한 기전이 된다(민 등, 2007). 비가역적인 부착이 일어난 후에 구강미생물은 성장하고 분열하여 집락을 형성(colonization)하게 된다. 그 후 치면세균막의 기질(plaque matrix)이 형성되는데(그림1,C) 치면세균막의 기질은 음식물이 없는 상태에서도 형성이 가능하다. 일부 구강미생물은 neuraminidase와 glycosidase를 분비하는데, 이 효소들은 타액내에 존재하는 당단백질의 일종인 sialoprotein에서 부착되어 있는 sialic acid와 oligosaccaride side chain을 제거하여 oligosaccaride side chain의 입체적인 장애효과(steric hindrance effect)를 감소시킴으로 sialoprotein의 등전점(pI)을 낮추어 치면세균막 표면에 침착 시키므로 치면세균막의 기질을 형성하게된다. 치면세균막의 기질이 형성된 후, 구강내에 sucrose 와 같은 당질이 존재하면, 구강미생물은 invertase 및 glycosyltransferase (GTFase)등과 같은 효소를 이용하여 sucrose를 glucose와 fructose로 분해한 후 glucose를 중합하여 glucan과 fructose를 중합하여 fructan같은 다당류를 합성하게 이들 다당류는 치면세균막을 두껍고 단단하 게 하며, 산소의 투과도를 낮추어 치면세균막 발달의 결정적인 역할을 수행하게 된다 (그림1,D). 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 135.

(3) Fig. 1. Five successive stages in the colonization of a pellicle-covered enamel surface by bacteria during early plague formation. 구강미생물이 합성하는 glucan으로는 세포내 글리코겐 유사 다당류(intracellular glycogen-like polysaccaride)와 dextran 및 mutan이 존재하는데, 구강미생물은 구강내에 영양물질이 충분할 경우 자신이 성장 및 증식에 필요한 에너지로 사용하고, 일부는 세포내 글리코겐 유사 다당류를 합성하여 에너지가 필요할 경우를 대비하여 세포내에 축적시킨다. 또 구강미생물이 형성하는 dextran 및 mutan은 세포외부에 축적되는데, dextran은 치면세균막의 부피증가에 큰 역할을 하며, 치면세균막 의 투과도를 감소시키고, 타액의 완충작용을 억제하는데에 결정적인 역할을 하게 된다. Mutan은 불 용성이므로 불용성 glucan 또는 main chain이 α-1,3 glycosidic linkage를 형성하므로 α-1,3 glucan으로도 불리우는데, 치면세균막내 미생물에 의하여 쉽게 분해되지 않으므로 치면세균막의 구 조유지에 중요한 역할을 수행한다. 구강미생물이 합성하는 fructan은 levan 한 종류가 있는데 역시 구강미생물의 세포외 다당류로 치면세균막 형성에 중요한 역할을 수행한다고 보고되었다.. 136. 2013년 기초연구과제총서.

(4) 1.2. 연구의 목적 동양의 전통의서인 동의보감, 중약대사전, 그리고 기타 한방 자료 및 민간 구전을 바탕으로 치 면세균막에 의해 유발되는 질환을 치료할 수 있는 한방식품 및 한방약재들이 소개되어 있다. 한방 식품의 우수한 효능에도 불구하고 아직 국내에서는 한방식품을 이용한 치면세균막 억제 물질을 개 발하려고 하는 연구가 미비하였다. 한방식품 및 한방 약재들은 과거 전통의학에서 뿐 아니라 현재 도 식재료나 질병의 치료목적으로도 많이 사용되고 있는 비교적 안전성이 물질들이며 또 치면세균 막을 유발하는 원인 세균의 증식을 억제하고, 치면세균막 발생기전을 차단하여, 보다 좋은 치면세 균막 억제제로 쓰일 수 있으리라 기대된다. 따라서 본 연구에서는 이들 한방식품 및 한방약재들을 검색하여, 활성이 높은 후보물질을 선정한 후 치면세균막 형성 억제 효능을 측정하고, 치면세균막 예방 효능이 있는 가공식품을 개발하고, 치면세균막을 억제할 수 있는 구강위생용품을 개발하고자 하였다.. 2. 연구의 목표 및 내용 2.1. 연구의 목표 본 연구에서는 한방식품 및 한방약재를 탐색하여 dental biofilm의 일종인 치면세균막의 형성억 제 효능을 측정하고, 활성을 보이는 쑥 및 강황 추출물을 이용하여 치면세균막 억제효능이 있는 가공식품과 구강위생용품의 개발을 시도하였다.. 2.2. 연구의 내용 2.2.1. 한방식품에서 치면세균막 형성억제 활성물질 추출 및 활성검사 • 전통의학에서 사용되는 한방식품과 한방약재를 탐색하여 쑥과 강황 추출물이 치면세균막 억제 효능이 있음을 발견하고 후보물질로 선정하였다.. • 한방식품인 쑥과 강황 추출물이 치면세균막 원인균의 성장 및 산생성 억제에 미치는 영향을 측 정하였다.. • 한방식품인 쑥 추출물이 인공치아에 치면세균막 형성 억제에 미치는 영향을 측정하였다.. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 137.

(5) • Scanning electron microscopy (SEM)을 이용한 치면세균막 원인균의 dental biofilm 생성 억제에 미치는 효과를 측정하였다.. • Confocal laser microscopy를 이용하여, bacteriocidal effect를 측정하였다. • Real-time PCR을 이용하여, 쑥추출물이 치면세균막 및 치아우식증 원인균의 독력인자 유전자 (gtfB, gtfC, gtfD, spaP, gbpB, relA ,brpA, virR) 발현에 미치는 효능을 평가하였다.. 2.2.2. 치면세균막 억제 물질이 함유된 가공식품 및 구강용품 개발 • 한방식품인 쑥과 강황 추출물을 스무디, 쿠키 등에 첨가하여 치면세균막 억제용 가공식품 시제 품을 개발함. • 한방식품인 쑥 추출물을 이용하여 마우스 스프레이에 첨가하여 치면세균막 억제용 구강위생용품 시제품을 개발함. 2.3. 연구의 방법 2.3.1. 연구재료 1) 쑥 추출물 준비 쑥 250g을 1주일간 1.7L의 ethanol에 담궈 놓았다가 여과하였다. 여과한 재료를 rotatory evaporator를 이용하여 감압농축하여 5.72g의 농축액을 얻었으며, 그 수율은 2.2% 였다.. 2) 강황 추출물 준비 강황 300g을 1주일간 1.5L의 ethanol에 담궈 놓았다가 여과하였다. 여과한 재료를 rotatory evaporator를 이용하여 감압농축하여 8.73g의 농축액을 얻었으며, 그 수율은 2.91% 였다.. 3) 균주 및 배양 실험에 사용된 균주는 치면세균막 형성과 치아우식증을 일으키는 대표적인 균주인 S. mutans. 138. 2013년 기초연구과제총서.

(6) 를 사용하였다. ATCC 25175를. Brain heart infusion (BHI, Difco, USA) 액체배지에 1~2차. 계대배양 후 같은 배지에 식균하여 37℃의 항온기에서 24시간 배양하였다.. 2.3.2. 연구방법 - 치면세균막 형성억제 활성물질 추출 및 활성검사 1) S. mutans의 성장과 산생성 억제 실험 1%의 glucose가 들어 있는 BHI 액체배지에 강황 또는 쑥 에탄올 추출물을 첨가한 후 균을 8. 1×10 CFU/ml이 되게 접종하였다. 37 ℃의 항온기에서 24시간 배양한 후 BHI 액체배지를 기 준으로 ELISA reader (Molecular Devices Co., CF., U.S.A.)를 이용하여 550 nm에서 흡광도 를 측정하였으며, pH meter (ORIONSA 720, U.S.A.)를 이용하여 pH를 측정하여 산 생성 억제 효과를 관찰하였다. 대조군은 추출물을 넣지 않고 시행하였다.. 2) S. mutans biofilm형성 억제효과 측정 1% sucrose를 첨가한 BHI 액체배지와 강황 또는 쑥 추출물을 35mm dish에 첨가한 후 S. mutans 를 5×105CFU/ml/dish 균이 되도록 접종하였다. 37 ℃ incubator에서 24시간 배양후 상청액을 모두 제거하였다. 각각의 dish에 증류수 1.5ml씩 넣어서 washing 하였다. 0.1%의 safranin으로 30초 동안 염색한 후 증류수로 두 번 세척하고 건조하여 사진 촬영을한 다음,. 30% acetic acid. 로 safranin stain을 용해시켜 96well plate에 100λ씩 분주 후 ELISA reader (Molecular Devices Co., CF., U.S.A.)를 이용하여 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 추출물을 넣지 않은 군을 대조군으로 하였다.. 3) Scanning electron microscopy(SEM)을 이용한 S. mutans biofilm 생성 억제 효과 실험 1% sucrose를 첨가한 BHI 액체배지와 쑥 추출물을 35mm dish에 첨가한 후 S. mutans를 5×105 CFU/ml/dish 균이 되도록 접종하였다. 37 ℃ incubator에서 24시간 배양 후 상청액을 모 두 제거하였다. 각각의 dish에 증류수 1.5ml씩 넣어서 washing 하였다. 2.5% glutaraldehyde 용 액 (0.1M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, 4 ℃)에서 2시간 동안 고정시켰다. Ethanol 70% 를 시작으로 80%, 95%, 100%로 농도를 높여 탈수하였다. Freeze-dry 한 후 gold로 coating하여, SEM (Scanning Electron Microscopy)를 이용하여 사진을 촬영후 관찰하였다. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 139.

(7) 4) 인공치 표면에 형성되는 S. mutans biofilm 억제효과 측정 1% sucrose를 첨가한 BHI 액체배지와 쑥 추출물을 첨가한 배지에 인공치 (Endura, Shofu Inc., Kyoto, Japan)를 넣은 후 S. mutans 5×105CFU/ml/dish균이 되게 도포하였다. 37 ℃ incubator에서 24시간 배양후 여액을 모두 제거하였다. 각각의 인공치에 증류수 1.5ml씩 넣어서 washing 하였다. 0.1%의 safranin으로 30초 동안 염색한 후 증류수로 두 번 세척하고 건조하여 사진 촬영을 시행하였다.. 5) Confocal laser microscopy를 이용한 S. mutans 살균효능 측정 BHl 액체배지에 S. mutans를 접종하여 incubator에서 24시간 배양후 쑥 추출물을 고농도 (0.4 - 3.2mg/ml)로 첨가한 후 S. mutans 1×107CFU/ml로 접종하여 약 30분 동안 incubator에 배양한다. 배양 후 1×PBS로 세척한 후 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit를 이용 하여 S. mutans를 염색한다. 염색한 균을 Confocal laser microscopy를 이용하여 염색된 균의 살균효과를 관찰하였다. 살아있는 세포는 SYTO에 염색되어 green color를 띠고, 죽은세포는 PI에 염색되어 red color를 띤다.. 6) Real-time PCR을 이용한 구강세균 독력인자 발현억제에 미치는 영향 쑥의 sub - mininal inhibitory concentration(sub-MIC) 0.05-0.2mg/ml로 처리한 후 S. mutans 균을 24시간 배양한 다음, Trizol 시약 (Gibco-BRL)을 사용하여 Total RNA을 추출하였다. 그런 다음, cDNA는 역전사 효소반응 (Gibco-BRL)을 사용하여 합성하였다. DNA의 분석은 ABI-Prism 7,000 사용하였고, qPCR SYBR Green Mixes (Applied Bio systems Inc., Foster City, CA, USA)을 사용하여 실시간 중합연쇄반응에 의해서 시행하였고, 반응조건은 95℃에서 15초간 초기 denatration 후 60℃에서 1분간 annealing과 extension 과정을 거치도록 구성하였다. 모든 유 전자들의 발현 정도는 내부 standard로써, S. mtans의 16S rRNA를 사용해서 normalization 하였으며, 분석은 적어도 두 개의 독립적인 RNA 샘플을 duplicate로 시행하였다.. 140. 2013년 기초연구과제총서.

(8) 2.3.3. 연구방법 - 치면세균막 억제 물질이 함유된 가공식품 및 구강위생용품 개발 1) 가공식품(스무디) 얼음 350ml을 믹서컵에 넣고 시중에 판매중인 요거트 50ml과 강황(1mg/ml) 및 쑥(0.4mg/ml) 추출물을 첨가하여 믹서기로 약 1분동안 가동시킨다. 시제품용으로 제작한 컵에 담는다.. 2) 가공식품(쿠키) 시중에 판매중인 쿠키 믹스 가루 100g에 식용유 5ml을 넣고, 강황(1mg/ml) 및 쑥(0.4mg/ml) 추출물을 넣어 약 5분 동안 반죽한다. 반죽한 덩어리를 넓게 편 후 쿠키 모양틀을 이용하여 모양 을 찍어낸다. 찍어낸 쿠키를 오븐에 넣어서 180℃ 15분동안 구워낸다.. 3) 구강용품(쑥 성분 구강스프레이) 주정 10ml에 멘톨 0.5g 넣은 후 잘 녹인 후 자일리톨 4.5g을 첨가하여 다시 잘 녹인다. 쑥 추 출물 (0.4mg/ml)을 넣고 음용수 50ml을 넣어 잘 섞이도록 흔들어준 다음 시제품용으로 제작한 용기에 담아서 완성한다.. 3. 연구의 결과 3.1. 쑥 추출물의 치아우식 활성 억제효능 3.1.1. 쑥 에탄올 추출물의 S. mutans 성장억제에 미치는 효과 쑥의 농도별 S. mutans에 대한 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지에 쑥 추출물을 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml의 농도로 첨가한 후, S. mutans를 접종하여 37도 항온기에서 24시 간 배양한 후 S. mutans 성장억제에 미치는 효과를 관찰하였다. 흡광도를 측정한 결과와 대조군 을 기준으로 한 상대성장률은 그림 2와 같다. 쑥은 농도 의존적으로 S. mutans의 성장억제을 억 제함을 관찰할 수 있었다. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 141.

(9) Fig. 2. The optical density of S. mutans by the various concentration of ethanol extract of Artemisia princeps. *p<0.05 was statistically significant as determined by independent sample t-test for the mean values different from the control group.. 3.1.2. 쑥 에탄올 추출물의 S. mutans 산 생성 억제에 미치는 효과 쑥 에탄올 추출물 첨가에 따른 S. mutans 에 의한 유기산 생성 억제 효과를 알아보기 위해 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 농도의 시료에 S. mutans 를 접종하여 24시간 배양 후에 pH meter로 pH를 측정한 결과는 표 1와 같다. 세균을 접종하지 않은 배양액의 pH는 약 7.3이나 세균만을 접 종한 대조군에서는 pH가 5.33까지 떨어졌다. 쑥을 첨가한 실험군에서는 농도 의존적으로 pH의 강하가 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다. 따라서 쑥은 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 농도에서 농도 의존적으로 S. mutans의 유기산 생성억제 효과를 보인다.. 142. 2013년 기초연구과제총서.

(10) Table 1. The pH of S. mutans by the various concentration of ethanol extract of. Artemisia princeps. Conc.(mg/ml) Control 0.05 0.1 0.2 0.4 0.1% NaF. pH(before incubation). pH(after incubation). 7.24±0.01 7.23±0.01 7.30±0.01* 7.25±0.00* 7.27±0.01* 7.30±0.01*. 5.33±0.01 5.33±0.01 5.34±0.02 6.43±0.13* 7.22±0.01* 7.29±0.00*. Date(pH) are represented as mean± standard deviation. * p<0.05 when compared with the control group after incubation.. 3.1.3. S. mutans biofilm 억제효과 측정 쑥을 S. mutans biofilm 억제효과를 알아보기 위하여 쑥 추출물을 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 농도별로 처리한 후 S. mutans 를 접종하여 24시간 배양 한 다음, biofilm 생성 억제 효과를 본 결과 쑥을 넣지 않은 대조군에서 S. mutans biofilm이 많이 형성 된 것을 볼 수 있으며, 쑥의 농도가 높아질수록 S. mutans biofilm 생성이 억제하는 효과를 보였다.(그림 3). Fig. 3. Safranin staining of Streptococcus mutans biofilm A) Control (B) 0.05 mg/ml (C) 0.1 mg/ml (D) 0.2 mg/ml (E) 0.4 mg/ml (F) positive control(0.1% NaF). 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 143.

(11) 3.1.4. 인공치아 표면에 형성되는 S. mutans biofilm 형성 억제효과 측정 인공치아 (Endura, Shofu Inc., Kyoto, Japan)에 1%sucrose를 첨가한 BHI 액체배지와 쑥 추출물을 첨가한 후 치아표면에 S. mutans biofilm 형성 억제효과를 알아보기 위하여 쑥 추출물 을 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 농도별로 처리한 후 biofilm 형성을 확인한 결과 쑥을 넣지 않은 대조군에 부착하는 균수가 유의하게 많아졌으며, 쑥의 농도가 높아질수록 부착하는 균수가 적어졌 음을 확인하고, 쑥 추출물이 바이오 필름 형성이 억제됨을 관찰하였다.(그림 4). Fig. 4. S. mutans biofilms on resin tooth surface, which were incubated in Artemisia princeps. A) Control (B) 0.05 mg/ml (C) 0.1 mg/ml (D) 0.2 mg/ml (E) 0.4 mg/ml (F) positive control(0.1% NaF).. 3.1.5. Scanning electron microscopy(SEM)을 이용한 S. mutans biofilm 생성 억제 효과 실험 쑥 추출물의 S. mutans biofilm 생성 억제 효과를 관찰하기 위해 전자현미경을 이용하여 촬영 한 결과는 그림 5와 같다. 쑥을 처리하지 않는 대조군은 S. mutans biofilm이 많이 형성된 것을. 144. 2013년 기초연구과제총서.

(12) 볼 수 있으며, 쑥의 농도가 높아질수록 전자현미경상으로도 현저히 S. mutans biofilm 생성이 억 제됨이 관찰되었다. 특히 0.2 mg/ml 이상 농도에서는 S. mutans biofilm 생성 억제 효과가 더 욱 뛰어남을 알 수 있으며, 0.4mg/ml 농도에서는 양성 대조군(0.1% NaF)과 유사한 억제효과를 관찰하였다.. Fig. 5. Scanning electron microscopy of Streptococcus mutans mutans biofilms grown in of Artemisia princeps (A) Control (B) 0.05mg/ml (C) 0.1mg/ml (D) 0.2mg/ml (E) 0.4mg/ml (F) positive control (0.1% NaF), bar=10㎛.. 3.1.6. Confocal laser microscopy를 이용한 S. mutans 살균효능 관찰 Confocal laser Microscopy를 이용하여 S. mutans 살균 효능을 측정한 결과는 그림 6과 같 다. 쑥 추출물을 처리하지 않는 대조군은 S. mutans 살균효과가 나타나지 않았으며, 쑥 추출물의 농도가 높아질수록 살아있는 세균 (SYTO염색;green color)에 비하여 죽어있는 세균 (PI염색;red color)이 증가하는 것이 관찰되어 쑥 추출물이 살균효과가 있다는 것이 밝혀졌으며 0.4 mg/ml 농도이상에서는 거의 모든 세균이 살균되는 것으로 확인되었다.. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 145.

(13) Fig. 6. Scanning electron microscopy of Streptococcus mutans mutans biofilms grown in of Artemisia princeps. (A) Control (B) 0.4mg/ml (C) 0.8mg/ml (D) 1.6mg/ml (E) 3.2mg/ml (F) positive control (0.1% NaF), bar=10㎛.. 3.1.7.Real-time PCR을 이용한 구강세균 독력인자 발현억제에 미치는 영향 쑥을 sub-minimal inhibitory concentration (sub-MIC) 이하의 농도 (0.05 - 0.2 mg/ml) 로 처리한 후 구강세균의 독력인자 발현을 real-time PCR을 이용하여 관찰한 결과 GTFase B, C, D를 합성하는 유전자 gtfB, gtfC, gtfD 의 발현이 sub-MIC 수준에서 감소하였고, 부착에 관 여하는 유전자 spaP, gbpB의 발현도 역시 sub-MIC 수준에서 감소하였고 (그림 7). 구강세균의 glucose uptake system인 glucose phosphotransferase system(PTS)의 조절 및 acid tolerence 에도 기여하는 유전자 relA가 sub-MIC 수준에서 감소하였고, acid tolerence에도 기여하는 유전 자 brpA도 sub-MIC 수준에서 감소하였다. gbpB, gtfB, gtfC, gtfD, ftf 의 발현을 조절하는 유전자 virR도 발현이 sub-MIC 수준에서 감소하였다.. 146. 2013년 기초연구과제총서.

(14) Fig 7. Gene expression of virulence factors of oral bacteria which were incubated in. Artemisia princeps.. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 147.

(15) 3.2. 강황 추출물의 치아우식활성 억제효능 3.2.1. 강황 에탄올 추출물의 S. mutans. 성장억제에 미치는 효과. 강황의 농도별 S. mutans 에 대한 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지에 각 추출물을 0, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/ml의 농도로 첨가한 후, S. mutans 를 접종하여 37도 항 온기에서 24시간 배양한 후 S. mutans 성장억제에 미치는 효과를 관찰하였다. 흡광도를 측정한 결과와 대조군을 기준으로 한 상대성장률은 그림 8와 같다. 강황은 농도 의존적으로 S. mutans의 성장을 억제함을 관찰할 수 있었다.. Fig. 8. The optical density of S. mutans by the various concentration of ethanol extract of Curcuma longa. *p<0.05 was statistically significant as determined by independent sample t-test for the mean values different from the control group.. 3.2.2. 강황 에탄올 추출물의 S. mutans 산 생성 억제에 미치는 효과 강황 에탄올 추출물 첨가에 따른 S. mutans 에 의한 유기산 생성 억제 효과를 알아보기 위해 0, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1mg/ml 농도의 시료에 S. mutans 를 접종하여 24시간 배양 후 에 pH meter로 pH를 측정한 결과는 표 2와 같다. 세균을 접종하지 않은 배양액의 pH는 약 7.07이나 세균만을 접종한 대조군에서는 pH가 5.60까지 떨어졌다. 강황을 첨가한 실험군에서는 농도 의존적으로 pH가 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다. 따라서 강황은 0, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/ml 농도에서 농도 의존적으로 S. mutans의 유기산 생성억제 효과를 보인다.. 148. 2013년 기초연구과제총서.

(16) Table 2. The pH of S. mutans by the various concentration of ethanol extract of. Curcuma longa. Conc.(mg/ml) Control 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 0.1% NaF 1). pH(before incubation) 7.07±0.11 7.07±0.11 7.17±0.05 7.17±0.05 7.20±0.00 7.20±0.00 7.17±0.05. pH(after incubation) 5.60±0.10 5.60±0.10 5.77±0.058 5.37±0.058 6.30±0.10* 7.17±0.153* 7.20±0.346*. Value represent the Mean±SD obtained from triplicate experiment. 3.2.3. S. mutans biofilm 억제효과 측정 강황의 S. mutans biofilm 억제효과를 알아보기 위하여 각각의 추출물을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1mg/ml 농도별로 처리한 후 S. mutans 를 접종하여 24시간 배양 한 다음, biofilm 생성 억 제 효과를 본 결과 쑥을 넣지 않은 대조군에서 S. mutans biofilm이 많이 형성 된 것을 볼 수 있 으며, 쑥의 농도가 높아질수록 S. mutans biofilm 생성이 억제하는 효과를 보였다. (그림 9). Fig. 9. Safranin staining of Streptococcus mutans biofilm A) Control (B) 0.0625 mg/ml (C) 0.125mg/ml (D) 0.25 mg/ml (E) 0.5 mg/ml (F) 1mg/ml (G) positive control(0.1% NaF). 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 149.

(17) 3.3. 치면세균막 억제 물질이 함유된 가공식품 및 구강용품 개발 3.3.1. 치면세균막 형성 예방용 스무디 및 쿠키. 1) 쑥 스무디 ① 350ml 의 얼음을 믹서컵에 담는다. ② 시판되고 있는 요거트를 사서 스푼을 이용하여 50ml를 정확히 잰다. ③ 250g 쑥을 70%에탄올 2500ml(시료 중량의 10배)를 가하여 3일 동안 냉침 후 여과지 (Whatman No 2)로 여과한 다음 감압농축기(Eyela 2Cs-50, Rikakikai Ltd., Tokyo, Japan)로 농 축시킨 다음에 Centra vac으로 돌려서 최종 5.72g(2.2%)의 에탄올 추출물을 얻었다. 최종 에 탄올 추출물은 EP tube에 담는다. 쑥 항균시험(MIC)에서 쑥 추출물 농도 0.4mg/ml 의 항균효 과가 있으므로 스무디도 동일한 농도로 첨가하기로 한다. ④ 350ml의 얼음에 쑥 추출물140mg을 스푼 으로 준비한다.. ⑦ 쑥 추출물을 넣는다. ⑧ 빙수와 쑥 추출물에 요거트를 넣는다.. ⑤ 모든 재료들을 다 준비한 사진.. ⑨ 믹서기를 약 1분 동안 가동시킨다.. ⑥ 믹서기에 얼음을 먼저 넣는다.. ⑩ 플라스틱 컵에 담아 쑥 스무디를 완성한다.. 150. 2013년 기초연구과제총서.

(18) 2) 강황 스무디 ① 350ml 의 얼음을 믹서컵에 담는다. ② 시판되고 있는 요거트를 사서 스푼을 이용하여 50ml를 정확히 잰다. ③ 300g강황을 70%에탄올 2500ml(시료 중량의 10배)를 가하여 3일 동안 냉침 후 여과지 (Whatman No 2)로 여과한 다음 감압농축기(Eyela 2Cs-50, Rikakikai Ltd., Tokyo, Japan)로 농축시 킨 다음에 Centra vac으로 돌려서 최종 8.73g(2.91%)의 에탄올 추출물을 얻었다. 최종 에탄 올 추출물은 EP tube로 담는다. ④ 강황 항균시험(MIC)에서 쑥 추출물 농도 1mg/ml 의 항균효과가 있으므로 스무디도 동일한 농도로 첨가하기로 한다. 350ml의 얼음에 강황추출물 350mg을 스푼으로 준비한다. ⑤ 모든 재료들은 다 준비한 사진. ⑥ 빙수와 강황추출물을 넣는다. ⑦ 빙수와 시료를 혼합하여 노란색으로 보이는 사진. ⑧ 요거트와 강황 추출물을 넣는다. ⑨ 믹서기를 약 1분 동안 가동시킨다. ⑩ 플라스틱 컵으로 담아 강황 스무디를 완성한다.. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 151.

(19) 3) 쑥 쿠키 ① 250g 쑥을 70%에탄올 2500ml(시료 중량의 10배)를 가하여 3일 동안 냉침 후 여과지 (Whatman No 2)로 여과한 다음 감압농축기( Eyela 2Cs-50, Rikakikai Ltd., Tokyo, Japan)로 농축 시킨 다음에 Centra vac으로 돌려서 최종 5.72g(2.2%)의 에탄올 추출물을 얻었다. ② 시판되고 있는 쿠키용 믹서가루를 사서 그릇을 이용하여 100g을 정확히 재고 일반용 식용유를 계량스푼으로 5ml를 잰다. 쑥 항균시험(MIC)에서 쑥 추출물농도 0.4mg/ml 의 항균효과가 있 으므로 쿠키도 동일한 농도로 첨가하기로 한다. 100g의 믹서가루에 쑥 추출물 40mg을 스푼으 로 준비한다. ③ 큰 그릇에서 믹서가루를 넣고 식용유랑 쑥 추출물을 넣는다. ④ 약 5분 정도 반죽한다. ⑤ 잘 반죽된 재료을 넓게 펴 준다. ⑥ 넓게 편 반죽을 모양 틀로 찍어낸다. ⑦ 찍어낸 쿠키 반죽. ⑧ 오븐 그릇위에 넣는다. ⑨ 오븐 180 ℃ 에서 15분 동안 구워낸다. ⑩ 구운 쿠키를 식혀서 쑥 쿠키를 완성한다.. 152. 2013년 기초연구과제총서.

(20) 4) 강황 쿠키 ① 300g강황을 70%에탄올 2500ml(시료 중량의 10배)를 가하여 3일 동안 냉침 후 여과지 (Whatman No 2)로 여과한 다음 감압농축기(Eyela 2Cs-50, Rikakikai Ltd., Tokyo, Japan)로 농축시 킨 다음에 Centra vac으로 돌려서 최종 8.73g(2.91%)의 에탄올 추출물을 얻었다. ② 시판되고 있는 쿠키용 믹서가루를 사서 그릇을 이용하여 100g을 정확히 재고 일반용 식용유를 계량스푼으로 5ml를 잰다. 강황 항균시험(MIC)에서 강황추출물 농도 1mg/ml 의 항균효과가 있으므로 쿠키도 동일한 농도로 첨가하기 로 한다. 100g의 믹서가루에 강황 추출물 100mg을 스푼으로 준비한다. ③ 큰 그릇에서 믹서가루를 넣고 식용유와 강황 추출물을 넣고. ④ 약 5분 정도 반죽한다. ⑤ 잘 반죽된 재료들을 도마에 넓게 펴 준다. ⑥ 넓게 편 반죽을 모양 틀로 찍어낸다. ⑦ 모양 틀을 이용하여 찍어낸 쿠키 반죽. ⑧ 오븐 그릇위에 넣는다 . ⑨ 오븐 180 ℃ 에서 15분 동안 구워낸다. ⑩ 구운 쿠키를 식혀서 강황 쿠키를 완성한다. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 153.

(21) 3.3.2. 치면세균막 형성을 억제 할 수 있는 구강용품. 1) 쑥성분 구강청결제 ① 멘톨 0.5g을 준비한다. ② 자일리톨 4.5g 을 준비한다. ③ 주정 10ml를 준비한다. ④ 음용수 40ml을 준비한다. ⑤ 250g 쑥을 70%에탄올 2500ml(시료 중량의 10배)를 가하여 3일 동안 냉침 후 여과지 (Whatman No 2)로 여과한 다음 감압농축기(Eyela 2Cs-50, Rikakikai Ltd., Tokyo, Japan)로 농축시 킨 다음에 Centra vac으로 돌려서 최종 5.72g(2.2%)의 에탄올 추출물을 얻었다. ⑥ 50ml tube에 멘톨을 0.5g을 측정하여 넣는다. ⑦ 10ml주정을 넣고 잘 섞는다. ⑧ 자일리톨을 4.5g을 넣는다. ⑨ 쑥 에탄올 추출물을 20mg을 넣는다. ⑩ 음용수을 넣고 50ml까지 맞춘다. ⑪ 시제품용으로 제작한 병에 담아 쑥성분 구강스프레이를 완성한다.. 154. 2013년 기초연구과제총서.

(22) 4. 연 구 성 과 • 강황의 치아우식 활성 억제효능 연구 (Studies on anti-cariogenic activity of Curcuma. longa)Bok-im Park, Sun-ju Park, Sun-Young Kang, Yong-Ouk You. 생활과학회 2013년 5월 31일 충남대학교.. • 애엽(쑥)의 치아우식 활성 억제 효능 연구 (Studies on anti-cariogenic activity of Artemisia. princeps) Yang-Yang, Bok-im Park, Sun-ju Park, Sun-Young Kang, Eun-Hee Hwang, Yong-Ouk You. 생활과학회, 2013년 5월 31일 충남대학교.. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 155.

(23) • Anticariogenic properties of Artemisia princeps against Streptococcus mutans. Bok-im Park, Yang-Yang, Sun-Young Kang, Sun-ju Park, Eun-Hee Hwang, Kang-ju Kim, Yong-Ouk You, 2013년 8월 21일~23일 국제치과연구학회 아시아태평양지역 (International Association for Dental Research, Asia Pacific Region; IADR-APR). • Inhibitory effect of Curcuma longa extract on Streptococcus mutans biofilm. Bok-im Park, Sun-Young Kang, Sun-ju Park, Kang-ju Kim, Yong-Ouk You, 2013년 8월 21일~23일 국제치과연구학회 아시아태평양지역 (International Association for Dental Research, Asia Pacific Region; IADR-APR). 156. 2013년 기초연구과제총서.

(24) • 쑥 추출물을 첨가한 치면세균막 억제용 가공식품 - 쑥 쿠키 개발. • 강황 추출물을 첨가하여 치면세균막 억제용 가공식품 - 강황 쿠키 개발. • 쑥 추출물을 이용하여 치면세균막용 가공식품 - 쑥 스무디 개발. 한방식품을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 및 구강용품 개발. 157.

(25) • 강황 추출물을 이용하여 치면세균막 억제용 가공식품 - 강황 스무디 개발. • 쑥 추출물을 이용하여 치면세균막 억제용 구강위생용품 - 쑥 구강스프레이 개발. 158. 2013년 기초연구과제총서.

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