저작자표시

저작자표시-비영리-변경금지 2.0 대한민국 이용자는 아래의 조건을 따르는 경우에 한하여 자유롭게

l 이 저작물을 복제, 배포, 전송, 전시, 공연 및 방송할 수 있습니다. 다음과 같은 조건을 따라야 합니다:

l 귀하는, 이 저작물의 재이용이나 배포의 경우, 이 저작물에 적용된 이용허락조건 을 명확하게 나타내어야 합니다.

l 저작권자로부터 별도의 허가를 받으면 이러한 조건들은 적용되지 않습니다.

저작권법에 따른 이용자의 권리는 위의 내용에 의하여 영향을 받지 않습니다. 이것은 이용허락규약(Legal Code)을 이해하기 쉽게 요약한 것입니다.

Disclaimer

저작자표시. 귀하는 원저작자를 표시하여야 합니다.

비영리. 귀하는 이 저작물을 영리 목적으로 이용할 수 없습니다.

변경금지. 귀하는 이 저작물을 개작, 변형 또는 가공할 수 없습니다.

이학 석사학위 논문

HDAC6 및 유비퀴틴 매개 신호전달경로에서

NEDD8의 기능적 특성 규명

아 주 대 학 교 대 학 원

의생명과학과/신경과학전공

권 미 라

HDAC6 및 유비퀴틴 매개 신호전달경로에서

NEDD8의 기능적 특성 규명

지 도 교 수 강 호 철

이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.

2018년 8월

아 주 대 학 교 대 학 원

의생명과학과/신경과학전공

권 미 라

권미라의 이학 석사학위 논문을 인준함

심사위원장 강 호 철 인

심 사 위 원 백 은 주 인

심 사 위 원 이 상 윤 인

아 주 대 학 교 대 학 원

2018년 7월 6일

i

국문요약

HDAC6 및 유비퀴틴 매개 신호전달경로에서 NEDD8의 기능적 특성 규명

NEDD8(Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down- Regulated 8)은 81개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질로서, 전사체의 조절 및 유전체 손상/복구(DNA damage response, DDR) 기작을 포함한 세포 내의 다양한 신호전달체계에서 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 12개의 유비퀴틴유사체(ubiquitin like modifiers, ULMs)중 NEDD8은 유비퀴틴의 아미 노산 서열과 60%가 완전히 일치하며 80%의 아미노산서열은 물리화학적 및 기능적 특징이 유사하다. 또한 NEDD8은 유비퀴틴과 유사하게 카르복실기 말 단에 di-glycine motif를 보유하고 있다. 이러한 구조적 유사성에도 불구하고 세포 내 유비퀴틴과 NEDD8간의 기능적 차이점은 명확히 규명되어 있지 않다.

이에 본 연구에서는 human protein micro array system을 활용하여 NEDD8 과 특이적으로 결합하는 단백질들(NEDD8 Interacting Proteins, SNIPs)을 동 정하였으며, 이를 통해 histone deacetylase 6(HDAC6) 및 BAG3 등과 같은 선택적 autophagy와 연관된 NEDD8 결합 단백질들을 동정하였다. 이들 중 HDAC6는 프리유비퀴틴체인의 수용체로써 세포 내 유비퀴틴화된 aggregate들 의 분해를 유도하는 과정에서 aggresome의 형성에 관여하는 주요 단백질로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 NEDD8이 HDAC6와의 특이적 상호작용을 통 해 어떻게 세포 내 주요 신호 전달 과정에 관여하는지에 대한 연구를 진행하였

ii

다. NEDD8과 HDAC6간의 상호 결합능 분석을 위해 HDAC6 및 NEDD8의 돌연변이체들을 제작하여 실험을 진행하였으며, 이를 통해 NEDD8이 유비퀴틴 과 유사한 방식으로 카르복실 말단의 di-glycine motif를 통해 HDAC6와 결 합하고 있으며, HDAC6는 프리유비퀴틴체인의 결합도메인으로 알려진 BUZ/ZnF-UBP도메인을 매개로 NEDD8과 결합하고 있음을 확인하였다. 이러 한 연구결과는 프리유비퀴틴체인 및 NEDD8이 HDAC6의 BUZ/ZnF-UBP도 메인을 매개로 상호 경쟁적으로 결합할 수 있음을 의미하는 연구 결과이다. 이 후, 프리유비퀴틴체인, NEDD8 및 HDAC6간의 상호작용에 대한 연구를 진행 한 결과, 흥미롭게도 HDAC6는 프리 유비퀴틴체인 중 K63 프리유비퀴틴체인 보다 K11 프리유비퀴틴체인과 보다 강하게 결합하고 있음을 확인하였으며, 이 들 간의 결합이 NEDD8의해 저해되는 것을 관찰하였다. 이와 같은 결과는 NEDD8과 K11 프리유비퀴틴체인이 HDAC6와 동일한 부위에 결합하고 있음 을 의미하는 것으로, 세포 내 특정 환경에 따른 각 단백질들의 양적 변화양상 이 이들 단백질 간의 결합을 특이적으로 조절할 수 있다는 것을 시사하는 것이 다. 또한 이러한 연구결과는 NEDD8이 K11 프리유비퀴티체인과 HDAC6에 의해 매개되는 세포 내 신호전달체계에서 중요한 저해제로서 작용할 수 있음을 제시하고 있다. 종합적으로 본 연구 결과는 NEDD8이 HDAC6 과 프리유비퀴 틴체인의 결합을 매개로 나타나는 다양한 세포 내 신호전달 과정에서 중요한 negative regulator(음성조절자)로써 작용할 수 있음을 제시하고 있다.

핵심어 : NEDD8, 프리유비퀴틴체인, HDAC6, aggresome, 댠백질 분해

iii 차 례

국 문 요 약 ... ⅰ 차 례 ... ⅲ 그 림 차 례 ... ⅴ 표 차 례 ... ⅵ 사 용 약 어 ... ⅶ

Ⅰ. 서 론 ... 1

Ⅱ. 실험재료 및 방법 ... 6

2.1. 시약 및 재료 ... 6

2.1.1. 동물세포 및 곤충세포 배양 ... 6

2.1.2. 유전자 재조합 vector의 제작 ... 6

2.1.3. 재조합 단백질의 생산 및 정제 ... 7

2.1.4. 단백질 마이크로어레이 ... 7

2.1.5. 항체 ... 8

2.1.6. Western blotting ... 9

2.2 클론 제작 및 단백질의 정제 ... 10

2.3 NEDD8유전자의 돌연변이 제작 ... 12

2.4 마이크로어레이(Micro array)를 통한 binding 단백질의 스크리닝 ... 12

2.5 면역침강반응(immunoprecipitation) ... 13

2.6 Western Blotting ... 13

iv

2.7 Dot blot assay ... 14

2.8 Pull down assay ... 15

Ⅲ. 결과 ... 16

3.1. 단백질 마이크로어레이를 통한 NEDD8 특이적 결합단백질들의 동정 16 3.2 단백질 마이크로어레이를 통해 동정된 NEDD8 결합단백질들의 검증 19 3.3 NEDD8과 HDAC6간의 결합 특이성 검증 ... 22

3.4 NEDD8과 HDAC6간의 결합력 분석 ... 27

3.5 NEDD8에 의한 HDAC6의 활성조절능 분석 ... 30

3.6 HDAC6와 NEDD8간의 상호 결합 부위 분석. ... 33

3.7 NEDD8에의한 HDAC6-프리유비퀴틴체인 신호전달경로 저해기전 분석 ... 36

Ⅳ 고찰 및 결론 ... 39

Ⅴ. 참고문헌 ... 44

영문요약 ... 49

v 그 림 차 례

Figure 1. NEDD8 has the most similar structure with ubiquitin ... 5

Figure 2. Schematic illustration for gateway cloning and purification of protein using vaculovirus ... 11

Figure 3. Schematic illustration for identification of specific NEDD8 Interacting proteins (SNIPs). ... 17

Figure 4. The validation of protein microarray data ... 21

Figure 5. NEDD8 strongly interacts with HDAC6 among of 12 ULMs. ... 25

Figure 6. NEDD8 is a novel HDAC6 binding partner ... 29

Figure 7. NEDD8 interaction between HDAC6 and unanchored K11 ubiquitin chains. ... 32

Figure 8. HDAC6 interacts with NEDD8 via di-glycine motif. ... 35

Figure 9. NEDD8 interrupts interaction between HDAC6 and unanchored K11 ubiquitin chains. ... 38

vi 표 차 례

Table 1. Identification of NEDD8 binding proteins using a 22K human protein microarray ... 18

vii

사 용 약 어

NEDD8 : Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down- Regulated 8

HDAC6 : Histone deacetylase 6 PQC : protein quality control GST : glutathione S-transferase UPS : Ubiquitin Proteasome System HRP : Horseradish peroxidase

1

Ⅰ. 서론

유비퀴틴(Ubiquitin)은 세포 내에 많은 양으로 존재하는 76개의 아미노산으 로 구성된 작은 단백질이다(Swatek and Komander, 2016). 대표적인 기능으 로는 세포 내 불필요한 단백질을 제거하는 역할을 담당하고 있으며, 이를 위해 유비퀴티네이션(ubiquitination)과정을 이용하는 것으로 알려져 있다(Sun and Chen, 2004). 유비퀴티네이션은 ATP 의존적인 반응으로써 ubiquitin activating enzyme E1, ubiquitin conjugating enzyme E2, ubiquitin ligase E3 의 연쇄적인 반응에 의해 유비퀴틴 C말단의 존재하는 glycine이 기질 단백질 의 lysine과 isopeptide결합으로 연결되는 반응으로 단백질의 전사 후 변형 (post translational modification)중 한 가지 기작에 해당한다(Wilkinson, 1987; Pickart, 2001; Weissman, 2001; Li and Ye, 2008). 세포 내 정상 또는 비정상 단백질들의 제어(protein quality control, PQC)시스템은 주로 유비퀴티 네이션 과정을 통해 조절되고 있으며, 이외에도 유비퀴틴 유사 단백질들에 의 한 PQC시스템도 사용되어지는 것으로 보고되어져 있다. 이러한 유비퀴티네이 션은 PQC의 조절 외에도 유전체 손상 복구 및 전사체 조절 등 다양한 세포 내 생리학적 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(Wilkinson, 1999). 유비퀴티 네이션의 결과물들은 기질단백질에 유비퀴틴 단량체 혹은 유비퀴틴체인이 결합 한 형태로 나타나며, 유비퀴틴체인들은 유비퀴틴에 존재하는 7개의 lysine(K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63)과 N말단의 methionine(M1)을 이용하여 형 성된다. 단독 또는 혼합된 형태의 유비퀴틴체인들은 다양한 길이로 형성될 수

2

있으며(Adhikari A, and Chen ZJ, 2009 (Adhikari and Chen, 2009; Grice and Nathan, 2016; Saeki, 2017), 이 중 K48 유비퀴틴체인의 경우 UPS에 의한 단백질 분해에 관여하는 것으로 보고되어져 있다. 반면 K63 유비퀴틴체인의 경우 주로 단백질의 분해가 아닌, 단백질들의 기능조절을 통한 세포 내 신호전 달과정에 관여하는 것으로 알려져 있었으나, 최근 연구를 통해 K63 유비퀴틴 체인이 selective aggresome autophagy에 관여하여 단백질의 분해를 유도하 는 주요조절인자임이 새롭게 보고되었다(Grice and Nathan, 2016). 이와 같이 유비퀴틴은 기질단백질에 연결되는 유비퀴티네이션 체인들의 타입에 따라 다양 한 방식으로 단백질의 기능 및 세포 내 신호전달 체계를 정교하게 조절한다.

이러한 유비퀴틴의 다양성에도 불구하고 세포에는 유비퀴틴과 구조적으로 유사 한 다양한 종류들의 유비퀴틴유사체(Ubiquitin like modifier, ULM)들을 보유하 고 있다. 유비퀴틴유사체들로는 NEDD8, ATG8, ATG12, FAT10, ISG15, URM1, UFM1, FAU, SUMO1, SUMO2 및 SUMO3등을 포함하여 약 12종류의 ULM들이 존재하며(van der Veen and Ploegh, 2012), 이중 NEDD8(Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 8)은 유비퀴 틴과 가장 유사한 단백질로서 유비퀴틴과 비교하여 아미노산 서열이 60%가 일치하는 단백질이다(Fig. 1). NEDD8은 81개의 아미노산으로 구성되어 있으 며 세포내에서 전사조절, DNA 손상/복구 및 단백질의 분해 조절능을 포함한 다양한 기능을 수행한다고 알려져 있다(Kamitani et al., 1997; Schwertman et al., 2016). 하지만 이러한 구조적 유사성에도 불구하고 유비퀴틴과 NEDD8간 의 세포 내 뚜렷한 기능 차이는 아직 불분명한 상태이다. 또한 NEDD8이 왜

3

세포내에서 유비퀴틴과 함께 존재해야 하는 지에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 아직 밝혀져 있지 않은 세포 내 NEDD8과 유비퀴틴의 기능적 차이에 연구를 진행하고자 하였다. 이러한 연구를 위한 NEDD8과 특이적 결합하는 단백질을 동정하고자 22만개의 인간단백질이 집적 되어 있는 단백질칩을 이용한 마이크로어레이 실험을 진행하였으며 이를 통해 총 104개의 NEDD8 결합 단백질을 동정하였다. 이러한 NEDD8 결합 단백질 들 중 흥미롭게도 유비퀴틴체인에 결합하여 다양한 세포 내 신호전달에 관여하 는 것으로 알려진 HDAC6(Histone deacetylase 6)가 높은 친화성으로 NEDD8 단백질과 결합하는 것으로 확인되었다.

HDAC6는 1,215개의 아미노산으로 구성된 단백질로 HDAC family ClassⅡ 에 속하며, HDAC family중 가장 많이 연구가 진행된 효소이다. 본래 HDAC family는 주로 히스톤의 탈아세틸레이션(deacetylation)을 통해 전사 조절을 한다고 알려져 있으나, 이 중 HDAC6는 특이하게도 세포 골격 중 하나인 알파 -튜블린의 K40을 탈아세틸화하여 세포의 이동을 조절하는 효소로써 알려져 있으며, 이외에도 염증반응 등과 같은 세포의 생존 및 사멸과 관련된 주요 기 능을 담당하고 있는 것으로 보고된 바 있다. 이러한 HDAC6의 기능은 주로 탈 아세틸화 과정 및 유비퀴틴 연관 신호전달체계와 관련되어 있으며, 이 중 유비 퀴틴화 과정은 HDAC6의 C말단에 존재하는 ZnF-UBP (zinc-finger ubiquitin binding domain)영역에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. ZnF-UBP도메인 은 유비퀴틴 단량체, 프리유비퀴틴체인 및 유비퀴틴화된 단백질과 결합하는 친

4

화성이 매우 높은 도메인으로, HDAC6를 매개로 이루어지는 세포 내 aggregates(유비퀴틴과 비정상단백질들의 복합체)처리에 매우 중요하게 작용 한다(Boyault et al., 2007; Li et al., 2013). 세포 내에서 발생한 비정상 단백질 들은 그 크기 및 성격에 따라 UPS 및 autophagy를 통하여 처리되며, UPS시 스템을 통해 처리되지 못하는 일정 이상 크기의 aggregate들은 aggresome을 형성하고 autophagy를 통해 제거될 수 있다. 이러한 aggresome은 aggregate 들이 모여 생성되는 것으로, HDAC6와 모터단백질인 dynein 및 세포골격유지 에 필요한 tubulin의 활성을 요구한다. 모터단백질인 dynein과 결합한 HDAC6 는 ZnF-UBP도메인을 매개로 aggregate의 유비퀴틴을 인지함과 동시에 tubulin의 탈아세틸화를 유도하여 aggregate들이 aggresome으로 형성되는 것 을 돕는다고 알려져 있다((Kawaguchi et al., 2003; Boyault et al., 2007);

Boyault C et al, 2007).

따라서 본 연구에서는 HDAC6-유비퀴틴을 매개로 나타나는 신호전달경로와 HDAC6-NEDD8 신호전달경로간의 연관성 및 차별성을 연구하고자 하였다.

5

Figure 1. NEDD8 has the most similar structure with ubiquitin (A) Sequence similarity between NEDD8 and ubiquitin.

6

Ⅱ. 실험재료 및 방법

2.1. 시약 및 재료

2.1.1. 동물세포 및 곤충세포 배양

본 연구에 사용된 동물세포(HEK293FT), 곤충세포(SF9), 대장균세포(E.coli) 들은 각각 DMEM(High Glucose, Pyruvate, Gibco. Grand Island, NY, USA), Sf-900™ II SFM(Gibco), LB broth(Duchefa Biochemie. Netherlands)룰 사 용하여 배양하였다.

2.1.2. 유전자 재조합 vector의 제작

HEK293FT세포의 과발현, 단백질 정제 등을 위해 제조된 vector들은 다음과 같으며, LR gateway 클로닝 시스템을 사용하여 제조하였다. HEK293FT세포 과발현을 위해 pcDNA6.2 N-EmGFP-DEST(Invitrogen. Carlsbad, CA, USA)vector가 사용되었으며, SF9세포 유래 재조합 단백질의 생산을 위해서는 pDEST20(Invitrogen), E.coli 유래 재조합 단백질의 생산을 위해서는 pDEST15(Invitrogen)를 사용하였다. 유전자 재조합을 위한 시약은 대부분 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)사에서 구매하였다. LR gateway 클로닝에 필 요한 LR clonase II (11791-100) 및 MAX Efficiency DH10Bac competent cell(10361012)을 구매하였다.

재조합 단백질의 생산 및 정제를 위해 제조된 bacmid들은 PhasePrep™

BAC DNA Kit(NA0100)(Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO, USA)를 사용하여

7

추출하였으며, 일반 vectors들의 유전자 추출은 HiGene™ Plasmid Mini Prep Kit (Ver.2.0)(BioFact, 한국)를 이용하였다.

2.1.3. 재조합 단백질의 생산 및 정제

SF9세포 및 E.coli 유래 단백질의 정제는 GE Healthcare Life Sciences사 (Little Chalfont, UK)의 Glutathione Sepharose 4B GST-tagged protein purification resin을 이용하여 정제하였다. 면역침강반응(Immunoprecipitation) 을 위한 HEK293FT세포 과발현을 위한 형질감염(Transfection)은 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(11668-500)(invitrogen)을 사용 하여 transfection하였고, ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel(A2220)(Sigma- Aldrich)를 사용하였다.

Pull down assay에서 사용한 NEDD8과 ubiquitin recombinant 단백질은 Boston Biocam(Cambridge, MA, UK)사에서 각각 UL-812와 U-530을 사용 하였고, 유비퀴틴 K11 체인은 UBP Bio(Aurora, CO, USA)사에서 K11-Ub(n

≥3) (D3301)을 사용하였다.

2.1.4. 단백질 마이크로어레이

마이크로어레이 실험에 시용된 22K Human protein chip은 CDI사(Mayaguez, PR, USA의 HuProt™ Human Proteome Microarray v3.0를 사용하였으며, 마 이크로어레이 실험의 결과분석은 Molecular Devices사의 GenePix 4000B Microarray Scanner 및 GenePix Pro 7.0. 프로그램을 사용하여 분석하였다.

8 2.1.5. 항체

마이크로어레이, western blotting, dot blotting assay, pull down assay 및 immunoprecipitation 실험에 사용한 항체는 다음과 같다. GeneTex(Irvine, CA, USA)사의 NEDD8 antibody[Y297] (GTX61205), Millipore사 (Burlington, MA, USA)의 Anti-Ubiquitinylated proteins Antibody, clone FK2(04-263), anti-ubiquitin K11 linkage, clone2A3/2E6(#MABS107-I) 및 Anti-Glutathione-S-Transferase Antibody S. japonicum form(AB3282), Invitrogen사의 anti-V5-HRP(R960-25), Sigma-Aldrich 사의 monoclonal anti-FLAG M2-perocidase(HRP)clone M2(A8592), Cell signaling technology(Danvers, MA, USA)사의 anti-HDAC6(D2E5 rabbit mAb(#7588), abcam(Cambridge, CB, UK)사의 anti-β-actin(ab6276)을 사용하였다. 마이크로어레이의 2차 항체로 invitrogen사의 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody-Alexa Fluor® 647 conjugate(A21245), Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 647 (A-21236) 및 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 546(A-11030) 을 사용하였다. Western blotting의 2차 항체로는 Jackson ImmunoResearch 사(West Grove, PA, USA) 의 Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(111-035-003), Cell signaling technology사의 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)을 사용하였다.

9 2.1.6. Western blotting

Western blot에 사용된 sample buffer는 Bio-Rad(Hercules, CA, USA) 사 의 2X Laemmli Sample buffer(161-0737)를 사용하였다. 단백질의 detection Reagent은 Thermo사(Waltham, MA, USA) 의 Super signal west pico chemiluminescent substrate(#NCL4080KR)를 사용하였으며 필름은 Agfa사(Mortsel, Belgium)의 CP-BU NEW(EA8EC)을 사용하였다.

10 2.2 클론 제작 및 단백질의 정제

마이크로어레이 및 in vitro실험을 위해 유전자를 Gateway 클로닝이 가능한 Entry벡터에 클로닝 후 LR clonase II (Invitrogen) 를 이용하여 pDEST20, pDEST15, pDEST TEV/V5, pDEST-N-FLAG, pDEST-EmGFP등과 같은 DSET벡터로 클로닝 후 TOP10 competent cell에 형질전환을 통해 플라스미 드 DNA를 추출하였다(Fig.2).

단백질은 SF9세포의 vaculovirus를 통한 단백질발현 시스템을 활용하여 정 제되었다. pDEST20벡터에 클로닝한 유전자를 MAX Efficiency DH10Bac competent cell 에 형질전환하여 tetracyclin, kanamycin, gentamycin을 포함 한 LB배지에 배양하여 Bacmid를 BAC DNA Kit를 이용하여 정제하였다.

Bacmid는 SF9세포에 Cellfectin® II Reagent를 이용하여 transfection후 28℃

에서 5일간 배양하여 생성된 vaculovirus를 회수하여 SF9세포에 infection시 킨 후 28℃에서 3일간 배양 후 세포를 회수하여 NETN buffer(25 mM Tris- Cl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 % NP-40, 0.1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 X Protease inhibitor cocktail)로 세포를 lysis 한 후 4℃에서 30분 incubation후 원심분리(14000rpm, 4℃, 15min)하였다.

상층액을 분리하여 GST-tagged protein purification resin을 첨가한 후 inverting(4℃, 3시간)한 후 resin을 column에 모은 후 NETN buffer로 세 차 례 washing후 Elution buffer(50mM HEPES (pH 7.5), 100 mM NaCl, 30 % Glycerol, 40mM RGE)로 elution하였다.

11

Figure 2. Schematic illustration for gateway cloning(A) and purification of protein using vaculovirus(B)

12 2.3 NEDD8유전자의 돌연변이 제작

NEDD8은 C말단의 di-glycine(G)을 Alanine(A)으로 치환하였다. 프라이머 를 NEDD8_G75G76A_Forward: 5’TCT GAG AGC AGC AGG TGG TCT TAG 3’(GC 54%, Tm 66.9), NEDD8_G75G76A_Reverse: 5’ CTA AGA CCA CCT GCT GCT CTC AGA 3 ’ (GC 54%, Tm 66.9)로 제작하여 mutazyme을 사용하여 PCR(중합효소연쇄반응)을 실시하여 돌연변이DNA를 얻은 후 PCR8/GW/TOPO vector를 이용하여 클로닝하여 entry클론을 제작 하였다.

2.4 마이크로어레이(Micro array)를 통한 binding 단백질의 스크리닝

22K인간단백질칩(22K Human protein chip)을 5% skim milk(in TBST)로 blocking을 실온에서 30분동안 진행하였으며 정제된 단백질을 10ug을 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 2 mM DTT, 2.5 mM MgCl2 조성의 버퍼에 overlay 한 후 4℃에서 16동안 반응시켰다. 1X PBS(phosphate buffer saline(pH 7.3), 1.4 M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4, 18mM KH2PO4)로 washing을 하였으며, 1차 항체를 1X PBS에 희석하여 4℃에서 16시간 반응시킨 후

HRP(Horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 2차 항체(Alexa 488, Alexa546)를 1X PBS에 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 1X PBS를 이 용하여 칩을 몇 차례 washing한 후 GenePix 4000B Microarray Scanner를 사용하여 detection하였으며 binding 단백질의 intensity분석은 GenePix Pro

13 7.0. 프로그램을 사용하여 분석하였다.

2.5 면역침강반응(immunoprecipitation)

HEK293FT세포를 Plate에 2Ⅹ10⁶로 Seeding하여 5% CO2가 포함된 37℃

배양기에서 24시간 배양하였다. 실험군의 Plasmid DNA를 Lipo 2000 reagent 와 함께 실온에서 15분간 반응하여 세포에 transfection시킨 후 48시간 더 배 양하였다. 실험군의 세포를 15ml tube에 모아 원심분리(1500rpm, 3min) 하여 상층액을 제거한 후 세포들을 1X PBS로 washing후 다시 한번 원심분리를 하 여 세포만 취해 IP buffer(1X PBS, 1% Triton X-100, 1% NP-40, Protease inhibitor Cocktail, 1X PMSF)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 4℃에서 한 시 간동안 교반하여 용해하였다. 그 후 원심분리(12000rpm, 10min, 4℃)하여 상 층액을 분리하여 전체 상층액 양의 10%를 취하여 2X Sample buffer을 동량으 로 희석한 후 100℃에서 10분간 가열하여 대조군으로 사용하였다. 나머지 상 층액에 FLAG affinity gel을 혼합한 후 4℃에서 16시간 교반 후 13000rpm으 로 1분간 spin down하여 affinity gel을 침전시켜 상층액을 제거하였고 affinity gel을 1X PBS로 washing을 세번 반복하였다. affinity gel에 1X sample buffer 를 50ul넣어 100℃에서 10분간 끓여 실험군으로 사용하였다.

2.6 Western Blotting

단백질 샘플을 Sample buffer를 첨가한 후 100℃에서 10분간 가열하여 denaturation시킨 샘플을 5-20% gradient SDS-PAGE gel을 사용하여

14

running buffer(pH8.3, 25mM Tris, 192mM Glycine, 0.1% SDS)에서 120V의 전압으로 단백질의 크기에 따라 분리하였다 분리가 끝난 Gel을 NC(nitrocellulose) membrane로 transfer buffer(pH8.3, 25mM Tris, 192mM Glycine)에서 100V로 한 시간 동안 단백질을 membrane으로 이동시켰다.

Membrane을 5% skim milk(in 0.05% PBST(pH 7.3, 1.4 M NaCl, 27mM KCl, 100mM Na2HPO4, 18mM KH2PO4, 0.05% Tween20)로 실온에서 30분동안 blocking을 한 후 1차 항체를 1% skim milk(in 0.05% PBST)에 희석 (α- HDAC6(1:2000), α-NEDD8(1:2000), α-GST(1:2000), α-V5(1:4000), α-FLAG(1:2000))하여 4℃에서 16시간동안 반응시켰으며, 1%PBST를 이용 하여 membrane을 실온에서 10분간 washing을 세 번 반복하였다. 2차 항체인 HRP를 1% skim milk에 희석(mouse-HRP(1:5000), rabbit-HRP(1:5000)) 하여 membrane에 실온에서 한 시간 이상 반응시켰다. 1차 항체를 washing한 방법과 동일하게 2차 항체를 washing하였으며, detection Reagent를 membrane에 적신 후 암실에서 X선 필름에 detection하였다.

2.7 Dot blot assay

NC membrane 또는 methanol에 의해 activation된 PVDF(polyvinylidene difluoride) membrane 에 정제한 단백질을 1-5ul 떨어뜨려 상온에서 건조 후 membrane을 5% skim milk(in 1X PBST)로 실온에서 30분동안 blocking을 한 후 western blotting과 동일한 방법으로 단백질을 detection하였다.

Dot blotting후 다른 단백질의 overlay의 경우 버퍼(50 mM Tris-Cl(pH 7.5)

15

2 mM DTT, 2.5 mM MgCl2)에 단백질 3ug을 녹여 membrane과 4℃에서 16 시간동안 반응시킨 후 western blotting과 동일한 방법으로 단백질을 detection하였다.

2.8 Pull down assay

GST가 표지된 표적 유전자로 infection된 SF9 세포를 harvest하여 NETN buffer를 이용하여 부유시킨 후 4℃에서 30분동안 교반하여 lysis후 원 심분리(12000rpm, 15min, 4℃)를 통해 상층액을 분리하였 으며, GST- tagged protein purification resin을 50ug 첨가하여 4℃에서 세 시간동안 inverting 하였다. Spin down하여 resin을 침전시킨 후 1X PBS로 세번 washing한 후 binding여부를 확인하고자 하는 단백질을 버퍼(50mM Tris-Cl (pH 7.5) 2mM DTT, 2.5 mM MgCl2)에 희석하여 첨가하였다. 4℃에서 16시간 동안 inverting한 후 spin down하여 침전된 resin을 1X PBS로 세번 washing 후 1X sample buffer를 50ul넣어 100℃에서 10분간 가열하여 실험군으로 사 용하였다.

16

Ⅲ. 결과

3.1. 단백질 마이크로어레이를 통한 NEDD8 특이적 결합단백질들의 동정

유비퀴틴은 세포의 성장, 유지 및 사멸 조절에 필요한 주요 단백질로써 수많 은 신호전달체계를 조절하며 세포운명 결정에 관여하는 주요 인자로 알려져 있 다. 이러한 유비퀴틴은 특이적인 β-grasp의 구조적 특성을 나타내고 있으며, 유비퀴틴유사체들로 알려진 대부분의 단백질 또한 이러한 β-grasp의 구조적 특성에 따라 분류되었다. 이 중 NEDD8은 유비퀴틴과 가장 유사한 유비퀴틴유 사체로써 아미노산의 서열의 약 60%가 유비퀴틴과 일치한다(Fig 1A).

본 연구에서는 유비퀴틴과 NEDD8간의 기능적 유사성 및 차별성을 분석하 기 위해 22K human protein micro array system을 활용하여 NEDD8 특이적 결합단백질들을 동정하였다(Fig 3). 실험군으로 동일한 두 개의 칩을 각각 Human recombinant NEDD8 단백질과 Human recombinant 유비퀴틴 단백질 을 overlay하여 α-NEDD8 항체 및 α-유비퀴틴 항체를 반응시킨 후 형광이 표지된 2차 항체를 사용함으로써 NEDD8단백질과 특이적인 결합을 보이는 단 백질들을 동정하였다. 단백질칩에 집적되어 있는 모든 GST-융합단백질들은 α-GST항체를 이용하여 signal intensity검출하였다. 그 결과 55개의 NEDD8 특이적 결합단백질들과 26개의 유비퀴틴 특이적 결합단백질들을 동정하였으며, NEDD8과 유비퀴틴 모두 결합하는 단백질로는 23개의 단백질들을 검출하였다 (Table 1).

17

Figure 3. Schematic illustration for identification of Specific NEDD8 Interacting Proteins (SNIPs).

18

Table 1. Identification of NEDD8 binding proteins using a 22K human protein microarray.

ACRC NXPH2 CABP7 ANKRD13A

ANAPC11 OLFML2B CCDC14 ANKRD13D

BAG3 OTUB1 CFAP36 DNAJB2

c6orf95/ZC3H12D OTUD6B CLUL1 FAM188A

c8orf59 PBK DESI1 FBXO2

CALCOCO2/NDP52 PEX19 EPN1 MUC21

DDIAS PKM GGA3 N4BP1

DDX58 QDPR HES1 NSFL1C

DNAJB6 RPL37A HGS OPTN

FAF1 RPS6KA2 ITCH PSMD4

FAM114A1 SCYL1 KHDC1L RAD23A

FFAR2 SET LAPTM4A RAD23B

FGF1 SHFM1 MS4A15 SFMBT1

FGF2 SLC7A6OS NEDD4L SPRTN

GDI1 SPANXN2 PTPN5 STAM

GTF3C3 TEX264 RHBDD3 STAM2

HDAC6 THAP5 RNF126 TOLLIP

HSCB THYN1 RNF5 TOM1

HSPBP1 TMEM129 RPS27A TOM1L2

KCNAB1 TRIM49L2 SFTPC UBL7

KCNAB2 TUBB1 SQSTM1 UBQLN1

KCTD2 UBAP1 TCAF1 UBQLN2

NASP UBAP2 TMEM52B USP5

NCC/SLC12A3 UBL7 UBE3A

NEDD8 UBQLN4 WWP1

NFS1 YARS WWP2

NOSTRIN ZDHHC5

NPM1

mono Ubiquitin Common NEDD8

19

3.2 단백질 마이크로어레이를 통해 동정된 NEDD8 결합단백질들의 검증

Human protein micro array의 결과를 검증하기 위해 NEDD8결합단백질로 예측된 전체 단백질 중 12%에 해당하는 10개의 유전자들을 (STAM1, STAM2, DNAJB2, ANKRD13D, THAP5, BAG3, RAD23A, UBQLN1, UBQLN4, UBAP1) 무작위로 선별하였으며, 이후 이들을 대상으로 GST가 표지된 pDEST15 벡터에 모두 서브클로닝하여 안정적으로 유전자들이 삽입된 재조합 벡터들을 제작하였다. 제작된 재조합 벡터들이 보유한 유전자들로부터 재조합 단백질들을 생산하기위해 클로닝된 벡터들을 E.coli로 형질전환 후, IPTG(Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 단백질의

발현을 유도하였다. 이후, 대장균으로부터 정제된 10개의 NEDD8 결합 예측단백질들과 NEDD8 및 유비퀴틴과의 결합력 분석을 위해 정제된 단백질들을 in vitro NEDD8 및 유비퀴틴 overlay 실험에 이용하였다. 실험을 진행한 결과 단백질 마이크로어레이를 통해 예측된 NEDD8 특이적 결합단백질들이 NEDD8 단백질과 상당히 강한 결합력을 나타내는 것으로 분석되었으며, 아주 일부의 단백질들만 유비퀴틴과 동시에 결합하는 것으로 나타났다. 이러한 연구결과는 NEDD8결합 단백질 스크리닝을 위한 수행한 단백질 마이크로어레이 방법이 실험적으로 매우 유효했음을 시사하는 것이다 (Fig 2). 상기 연구결과들은 재조합 단백질을 정제하여 세포외부 조건에서 실험을 수행한 것으로 NEDD8과 이들 결합 예측 단백질들 간의 직접적 결합을 검증하는 실험이었다. 이러한 연구결과들이 세포 내에서 실질적으로

20

나타나는 현상인지를 확인하기 위하여 동물세포를 활용하여 2차 스크리닝을 진행하였다. 본 실험을 위해 NEDD8 및 4개의 NEDD8 결합단백질들(HDAC6,

DDIAS, THAP5, BAG3)에 대한 유전자들을 동물세포 발현용 벡터들로 제조하였으며, 유전자 발현 시 NEDD8은 EmGFP와 융합하여 발현하며, NEDD8 결합단백질들들은 Flag으로 표지되어 발현하도록 디자인하였다.

이처럼 제작된 유전자들을 HEK293FT세포에서 형질주입(transfection)하여 NEDD8과 결합단백질들 간의 결합 특이성을 세포내에서 검증하였다. 각 유전자들이 형질 주입된 세포들을 용해하여 cell lysate를 얻은 후 Flag affinity beads를 활용한 면역침강반응(immunoprecipitation)을 통해 이들 상호간의 결합력을 분석하였다. Input sample은 Flag affinity beads를 반응시키기 전의 전체 cell lysate의 약 2%에 해당하는 양을 loading하였으며, NEDD8과 결합단백질과의 세포 내 결합여부는 GFP항체를 활용하여 검증하였다. Figure 1에서 나타난 바와 같이, 세포내 NEDD8 단백질은 단백질 마이크로어레이를 통해 예측된 4개의 NEDD8 결합단백질들과(HDAC6, DDIAS, THAP5, BAG3)과 강하게 결합하고 있음을 확인하였으며, 이들 중 HDAC6의 경우 아주 강하게 NEDD8과 결합하고 있음이 확인되었다. (Fig 4).

21

Figure 4. The validation of protein microarray data. (A) Among 78, 12% of proteins were randomly selected, and the NEDD8 or ubiquitin binding activity of these proteins was evaluated by a NEDD8 or ubiquitin overlay assay in vitro. (B) To validate protein microarray data, four NEDD8 binding proteins were subjected to immunoprecipitation.

22 3.3 NEDD8과 HDAC6간의 결합 특이성 검증

NEDD8과 HDAC6간의 결합 특이성을 검증하기 위해 재조합 단백들의 대량 생산을 위한 SF9(곤충세포) 시스템을 도입하여 실험에 활용하였다. SF9 시스 템은 baculovirus를 활용하여 재조합 단백질들을 생산하는 시스템으로 baculovirus를 생산할 수 있는 재조합 벡터들과 곤층세포가 요구된다 (Fig 2B). Baculovirus를 생산할 수 있는 재조합 벡터들은 GST(glutathione S- transferase) 표지벡터로써, 재조합유전자들이 곤충세포에서 단백질로 생산될 경우 모두 GST-융합단백질로 발현되며, GST-affinity beads를 활용하여 쉽 게 정제될 수 있다(Fig5A). 본 실험에서는 NEDD8과 HDAC6간의 결합 특이 성을 검증하기 위해 HDAC6 및 NEDD8을 포함한 11종의 유비퀴틴유사체들을 (NEDD8, ATG8B, ATG12, FAT10, FAU, ISG15, SUMO1, SUMO2, SUMO3, UFM1, URM1)을 모두 baculovirus 생산용 벡터인 pDEST20 vector 클로닝 하였다. GST표지 단백질을 생산할 수 있는 pDEST20 vector에 HRV 3C Protease (3C)에 의한 절단사이트(Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-↓-Gly-

Pro)와 또다른 표지 단백질인 V5 아미노산서열을 GST 단백질의 카르복실 말 단에 클로닝 하여 GST 융합단백질의 정제 시 쉽게 타겟 단백질만을 분리할 수 있도록 벡터를 제작하였다(Fig 5B). 제작된 벡터들은 E.coli를 이용하여 baculovirus의 생산에 필요한 bacmid로 전환되었으며, 이후 정제된 bacmid들 을 SF9세포로 형질전환하여 baculovirus 생산을 통한 단백질 과발현을 유도하 였다. 이 후, GST-affinity beads를 활용하여 발현된 재조합 단백질들을 정제

23

하였으며, 순수한 재조합 단백질들의 정제를 위해 HRV 3C Protease를 이용하 여 V5만이 표지된 재조합 단백질들을 정제하였다(Fig 5C). 이처럼 분리 정제 된 유비퀴틴유사체들과 HDAC6 단백질들 간의 결합력 분석을 위해 dot blot assay를 수행하였다. PVDF membrane에 V5가 표지 된 각각의 유비퀴틴유사 체들을 약1ug씩 집적한 후 GST-HDAC6 3ug을 반응용액에 희석하여 membrane과 반응시켜 HDAC6와 유비퀴틴유사체들간의 결합력을 분석하였 다(Fig 5D).

그 결과 흥미롭게도 NEDD8 단백질이 유비퀴틴유사체들 중에서 가장 높은 결합력으로 HDAC6와 상호작용하는 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 기존 HDAC6와 강하게 결합하는 것으로 보고된 유비퀴틴 단량체보다도 훨씬 높은 결합력으로 NEDD8 과 HDAC6가 상호작용하고 있음을 의미하는 것이다. 또한 본 실험을 통해 HDAC6는 NEDD8 이외에도 FAT10, FAU, ISG15와도 결합 하고 있음을 확인하였다. 이들 중 ISG15(ubiquitin-like interferon (IFN)- stimulated gene 15)의 경우 C말단 영역의 LRLRGG부분이 HDAC6의 ZnF- UBP영역과 상호작용하여 autophagic pathway에 관여한다고 이미 보고된 바 있으며(Nakashima et al., 2015), FAT10의 경우도 세포내 프로테아좀 시스템 의 저해 시 HDAC6와 상호작용하여 aggresome에 존재한다고 보고된 바 있다 (Kalveram et al., 2008). 그러나 현재까지 NEDD8과 HDAC6간의 상호작용에 대한 연구는 보고되어 있지 않다.

24

유비퀴틴유사체들 중 NEDD8이 기존에 알려진 유비퀴틴이나 FAT10, ISG15 보다 더 강하게 HDAC6와 결합한다는 것은 NEDD8이 HDAC6 매개의 세포신 호전달에 있어 주요조절 인자로 작용할 수 있음을 의미하고 있다.

25

Figure 5. NEDD8 strongly interacts with HDAC6 among of 12 ULMs. (A) GST and GST-HDAC6 loaded in 8-16% SDS-PAGE were separately visualized by Coomassie Brilliant Blue. (B) Schematic illustration of subcloning of 3C site and V5 tag into pDEST20 vector. (C) Schematic illustration for purification process of cleavage 3C site by HRV 3C protease. (D) V5 tagged 12ULMs are dropped on

26

NC(nitrocellulose)membrane and incubate with GST-HDAC6 protein at 4℃ for 16hr. These protein are detected with indicated antibody.

27 3.4 NEDD8과 HDAC6간의 결합력 분석

HDAC6는 세포골격을 구성하는 알파-튜블린을 탈아세틸화시키는 효소로서 유비퀴틴 단량체, 유비퀴틴체인 및 유비퀴틴화된 단백질과 결합하는 ZnF- UBP도메인을 포함하고 있다. Aggresome형성과정에 있어 HDAC6의 활성은 ZnF-UBP영역과 유비퀴틴의 C말단에 존재하는 di-glycine motif와 결합에 의 존한다고 한다고 알려져 있다(Ryan L. Hard et al, 2010 (Hard et al., 2010;

dos Santos Passos et al., 2016). 유비퀴틴과 가장 구조적 유사성을 나타내는 NEDD8이 HDAC6와 특이적으로 결합하는 것은 세포내에서 HDAC6를 매개로 나타나는 다양한 세포내 신호전달과정이 유비퀴틴 뿐만 아니라 NEDD8에 의 해 조절될 수도 있음을 의미하는 것이다. 현재까지 HDAC6에 대한 연구는 유 비퀴틴과의 상호작용을 통한 aggresome형성에 관여하는 기전 이외에도 HDAC6를 매개로 나타나는 다양한 세포 내 신호전달 기전은 크게 HDAC6의 두 가지의 효소적 기능에 의해 조절될 수 있다. 첫째는 HDAC6의 탈아세틸화 와 관련된 효소적 기능으로 대부분 타겟 단백질들의 활성조절에 관여하는 것으 로 알려져 있으나, 유비퀴틴과의 연관성은 보고된 바 없다. HDAC6의 두번째 기능은 세포 내 효소반응을 위해 다른 단백질들과 결합하여야 하며, 이때 유비 퀴틴단량체나 유비퀴틴체인을 인지하여 기질을 선별하는 기능을 HDAC6의 ZnF-UBP영역을 통해 수행하는 것이다. 본 실험에서는 상기 언급한 HDAC6 와 유비퀴틴과의 상호작용이 매개하는 세포내 신호전달 과정에 있어 NEDD8 의 역할을 분석하고자 하였다. HDAC6에 대한 NEDD8의 역할은 NEDD8이 보

28

유한 유비퀴틴과의 구조적 유사성에 미루어 볼 때 상호 경쟁관계에 있을 것으 로 판단된다. 이러한 연구가설을 입증하기위해 유비퀴틴단량체, 유비퀴틴체인, NEDD8 및 HDAC6 재조합 단백질을 이용하여 이들 간의 결합력을 분석하였 다. SF9에서 baculovirus를 통한 단백질 발현 시스템을 활용하여 정제된 GST-HDAC6를 NC membrane에 집적 후, NEDD8, 유비퀴틴단량체 및 유비 퀴틴체인들과의 결합 여부를 dot blot assay를 통해 분석한 결과, 앞서 검증한 연구결과들과 동일하게 HDAC6는 NEDD8과 아주 강한 결합력을 나타냈으나, 기존 보고된 연구결과와는 상이하게도 HDAC6는 K63 프리유비퀴틴체인보다 도 K11 프리유비퀴틴체인과 더 강하게 결합하는 것으로 나타났다(Fig 6A). 이 러한 연구결과는 HDAC6가 프리유비퀴틴체인과 상호작용한다는 기존 연구 보 고와는 일치하는 것이며, 더 나아가 HDAC6가 이러한 프리유비퀴틴체인들의 타입 중 K11과의 결합을 선호한다는 새로운 연구결과에 해당한다. 이에 대한 또 다른 정량적 분석방법으로 SPR(Surface plasmon resonance)assay를 활용 하여 HDAC6와 NEDD8간의 상호 결합력을 분석하였다 (Fig 6B). 분석 결과 HDAC6에 대한 NEDD8의 결합력은 1.18x10E^-9의 KD 에 해당하는 것으로 분석되었다. 이러한 연구결과는 HDAC6가 유비퀴틴과 상호작용시 나타내는 KD=60nM의 결합력(Boyault et al., 2006)보다 훨씬 더 강하게 NEDD8과 결 합하고 있음을 의미하는 것이다 (Fig 6C).

29

Figure 6. NEDD8 is a novel HDAC6 binding partner (A)Indicated proteins overlay assay with native HDAC6 protein using a dot-blot system. GST and GST-HDAC6 put a dot onto nitrocellulose membrane and were incubated with indicated proteins.

NEDD8 or ubiquitin chains binding proteins were detected by each antibody. (B) Schematic illustration for SPR analysis. (C) NEDD8 and HDAC6 were subjected

into Surface plasmon resonance (SPR) analysis and identified that NEDD8 showed

direct interaction to HDAC6 with 1.8 x 10 ^-9 nM scale.

30

3.5 NEDD8에 의한 HDAC6의 활성조절능 분석.

앞선 연구결과에서 검증된 바와 같이 HDAC6는 NEDD8 뿐만 아니라 K11 유비퀴틴체인과도 강하게 결합하고 있음을 확인하였다(Fig 6B). 이러한 연구결과는 세포내 HDAC6를 매개로 나타나는 신호전달과정이 하기 제시된 4가지 과정에 의해 조절될 수 있음을 시사하고 있다. 1) HDAC6- 프리유비퀴틴체인에 의한 신호전달 경로 2) HDAC6-NEDD8 상호작용을 통한 신호전달 경로 3) 프리유비퀴틴체인과 NEDD8이 HDAC6와 결합하는 부위가 상이함을 가정할 경우 나타날 수 있는 NEDD8-HDAC6-프리유비퀴틴체인 복합체에 의해 조절될 수 있는 신호전달경로 4) 프리유비퀴틴체인과 NEDD8이 HDAC6에 결합하는 부위가 동일할 경우 NEDD8과 프리유비퀴틴체인이 서로 경쟁적으로 HDAC6의 신호전달경로를 조절하는 경로 등 상기 제시된 4가지 신호전달경로의 연구 가설들을 증명하기 위해 본 실험에서는 in vitro 상에서 K11 프리유비퀴틴체인과 NEDD8이 각각 또는 함께 존재할 때 HDAC6와의 결합력이 어떻게 변하는 지를 관찰하기 위해 실험을 고안하였다(Fig 7A). 실험결과, 흥미롭게도 NEDD8 단백질이 HDAC6와 K11 프리유비퀴틴체인과의 상호작용을 강하게 저해하고 있음을 확인하였다. 이러한 연구결과는 4가지 연구가설 중 기존에 연구 보고된 HDAC6와 프리유비퀴틴체인에 의해 조절되는 다양한 세포내 신호전달경로를 NEDD8 단백질이 조절할 수 있음을 의미하는 것이다. 또한 이러한 연구결과는

31

유비퀴틴에 의해 나타나는 세포내 다양한 신호전달 과정들이 NEDD8에 의해 경쟁적으로 저해될 수 있음을 시사하고 있다.

32

Figure 7. NEDD8 interaction between HDAC6 and unanchored K11 ubiquitin chains.

(A) Schematic illustration of experimental procedures. (B) NEDD8, K11 chains or

NEDD8 along with K11 chains are incubated with HDAC6, respectively. NEDD8 inhibits that HDAC6 interacts with K11 ubiquitin chains.

33

3.6 HDAC6와 NEDD8간의 상호 결합 부위 분석

상기 연구결과들은 NEDD8이 유비퀴틴과 유사하게 HDAC6와 동일한 결합부위에 결합할 수 있음을 시사하였다. 기존 연구를 통해 HDAC6의 ZnF- UBP영역이 프리유비퀴틴체인과 결합하는 부위임이 이미 보고되었다. 이러한 연구결과는 NEDD8에 의한 HDAC6의 결합부위도 ZnF-UBP영역이 될 수 있음을 의미한다. 따라서 이러한 가설을 검증하기 위해 HDAC6와 NEDD8의 돌연변이를 제작하였다. HDAC6는 두개의 catalytic 도메인과 ZnF- UBP도메인이 존재한다. 이를 바탕으로 HDAC6의 돌연변이로는 catalytic활성을 위한 핵심 도메인으로 알려진 histidine H216과 H611번 잔기를 alanine A으로 치환한 돌연변이체들과 ZnF-UBP도메인이 결손 된 돌연변이체들을 FLAG이 표지 된 벡터에 삽입하여 제작하였다(Fig 8A). 또한 유비퀴틴 C말단에 존재하는 di-glycine motif가 HDAC6의 ZnF- UBP도메인에 결합하는 데이터를 기반으로 NEDD8의 glycine G75와 G76의 di-glycine motif를 알라닌으로 치환하여 V5가 표지 된 돌연변이를 제작하였다(Fig 8B). 제작한 돌연변이를 HEK293FT 세포에서 형질주입을 시킨 후 cell lysate에서 Flag affinity beads를 반응시킨 후 면역침강반응(immunoprecipitation)을 통해 얻은 샘플을 대상으로 western blotting을 실시하였다. 이들 간의 결합력을 확인하기위해 각 유전자가 표지 된 Flag과 V5항체로 각 단백질들 간의 결합력을 검증하였으며, 이를 통해 제기했던 가설과 동일하게 정상체의 NEDD8단백질은 HDAC6 정상체와

34

유비퀴틴 결합부위의 돌연변이체 중 돌연변이체와는 결합하지 않는 것으로 확인되었으며, NEDD8 돌연변이체의 경우 HDAC6 정상체와도 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 연구결과는 NEDD8과 HDAC6의 결합은 세포 내에서 NEDD8의 di-glycine motif와 HDAC6의 ZnF-UBP도메인을 통해 이루어지며, 유비퀴틴과 서로 경쟁적으로 HDAC6와 결합할 수 있는 것을 의미하는 것이다 (Fig 8B).

35

Figure 8. HDAC6 interacts with NEDD8 via di-glycine motif. (A) Schematic

illustration of domain structure of HDAC6 WT and mutants. (B) Schematic illustration of domain structure of NEDD8 WT and mutants (C) HEK293FT cells were transfected with V5-NEDD8 WT, GGAA, Flag-HDAC6 WT and its mutants.

After 48 hr, cells were harvested and lysed, and then samples were subjected into immunoblotting with anti-V5 or anti-FLAG antibody.

36

3.7 NEDD8에의한 HDAC6-프리유비퀴틴체인 신호전달경로 저해기전 분석

앞선 실험을 통해 NEDD8의 di-glycine motif가 유비퀴틴체인과 마찬가지로 HDAC6의 ZnF-UBP도메인에 결합할 수 있음을 확인하였다(Fig 8B). 또한 이러한 연구결과들을 통해 HDAC6가 세포내에서 유비퀴틴단량체, 유비퀴틴화된 단백질 또는 프리유비퀴틴체인 및 NEDD8에 대해 같은 결합부위를 공유하고 있음을 확인하였다. 본 실험에서는 상기 연구결과들을 모두 종합하여, NEDD8이 이미 결합하고 있는 K11 프리유비퀴틴체인과 HDAC6간의 결합을 저해할 수 있는가를 in vitro competition assay를 이용하여 실험을 진행하였다 (Fig 9A). 간략히 앞서 HDAC6와 NEDD8 및 K11 프리유비퀴틴체인과의 결합력을 검증했던 실험과 동일한 방식으로 GST- HDAC6를 Glutathione Sepharose 4B resin에 결합시킨 후 K11 프리유비퀴틴체인을 2ug 첨가하여 HDAC6와 K11 프리유비퀴틴체인간의 결합체를 미리 생성한 후, NEDD8 단백질 2ug 첨가하여 competition assay를 수행하였다. 실험결과 K11 프리유비퀴틴체인의 양이 모든 GST-HDAC6와 결합할 수 있는 충분한 양이었음에도 불구하고 NEDD8의 첨가 후 GST- HDAC6에 결합하는 양이 현저히 줄어드는 현상을 관찰하였다. 이러한 연구결과는 앞선 실험결과와 동일하게 NEDD8이 HDAC6의 ZNF-UBP 도메인에 경쟁적으로 결합하여, 이미 결합된 K11 프리유비퀴틴체인과 HDAC6간의 결합을 저해할 수 있음을 확인한 결과이며, NEDD8이 세포내에서

37

K11 프리유비퀴틴체인과 HDAC6에 의해 매개되는 신호전달경로를 저해할 수 있음을 의미하는 실험연구 결과이다.

38

Figure 9. NEDD8 interrupts interaction between HDAC6 and unanchored K11 ubiquitin chains. (A) Schematic illustration of experimental procedures. (B) HDAC6

is incubated with K11 chains. And then, NEDD8 is added in the sample. Samples were stained Coomassie Blue Brilliant or Immunoblotted with indicated antibodies.

39

Ⅳ 고찰 및 결론

본 연구에서는 왜 세포는 유비퀴틴 외에 12종류의 유비퀴틴유사체를 발현하 고 있으며, 특히 왜 세포는 이러한 유비퀴틴유사체 중 60% 이상으로 유비퀴틴 과 동일한 아미노산 서열을 보유한 NEDD8을 발현시키고 있는지에 대한 의문 점을 제기하였다. 이러한 의문점을 해결하기 위해 NEDD8의 기능이 유비퀴틴 과 비교하여 무엇이 동일하며, 어떤 점이 상이한가에 대한 근본적인 질문에 대 답하기 위해 연구를 진행하였다.

이러한 연구를 위해 NEDD8과 직접적으로 결합하는 단백질들을 단백질 마 이크로어레이 기법을 이용하여 동정하였으며, 이러한 NEDD8 결합 단백질 중 이미 수많은 연구를 통해 유비퀴틴과 결합하여 다양한 세포의 신호전달을 조절 하는 단백질로 알려진 HDAC6 단백질을 중심으로 NEDD8과의 연관성을 분석 하고자 심도 있게 실험을 진행하였다.

HDAC6는 카르복실 말단 영역의 ZnF-UBP도메인을 통해 K63 프리유비 퀴틴체인과 상호작용함으로써 세포 내 aggregate의 처리에 관여한다고 보고된 바 있다(Hao et al., 2013). 본 연구에서는 흥미롭게도 기존 여러 연구결과들과 는 상이하게도 HDAC6가 K63 프리유비퀴틴체인보다도 K11 프리유비퀴틴체 인과 더 강하게 결합하고 있음을 확인할 수 있었다. 이는 HDAC6가 프리유비 퀴틴체인중 K11로 연결된 체인들과의 결합을 더 선호한다는 것을 의미하는 것이다. K11 프리유비퀴틴체인은 단백질들의 막수송과 TNF(Tumor necrosis factor)에 의한 신호전달 및 세포의 유사분열과정에서 단백질의 프로테아좀으

40

로 인한 분해의 신호전달을 조절한다고 알려져 있다(Wickliffe et al., 2011;

Bremm and Komander, 2012). 따라서 HDAC6와 K11 프리유비퀴틴체인의 강한 결합은 HDAC6와 K11 프리유비퀴틴체인을 매개로 나타나는 세포 내 신 호전달경로의 존재를 의미하는 연구결과이다. 또한 NEDD8의 유비퀴틴과의 구 조적 유사성으로 미루어 볼 때, NEDD8이 HDAC6 및 K11 프리유비퀴틴체인 을 매개로 나타나는 주요 신호전달과정들을 특정환경에서 조절할 수 있음을 의 미하는 것이다. 실제로 본 연구결과에서는 NEDD8이 프리유비퀴틴체인과 마찬 가지로 di-glycine motif를 통해 HDAC6와 매우 강하게 결합을 하는 것을 확 인할 수 있었다. NEDD8의 고유기능은 NEDDylation을 통해 DNA손상/복구기 전, 전사조절 등의 역할을 담당하며, Cullin-RING 유비퀴틴 ligase E3의 활성 에 매우 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 기존에 보고된 연구결과 에 따르면 세포 내에 과도한 스트레스가 유발될 경우 급격히 유비퀴틴의 소모 량이 증가하고 이에 따라 사용할 수 있는 유비퀴틴의 양이 부족한 상황이 발생 하게 되며, 이러한 상황에서 유비퀴틴 E1 효소들이 유비퀴틴을 대신하여 NEDD8을 이용할 수 있음을 보고한 바 있다(Leidecker et al., 2012; Enchev et al., 2015). 이러한 연구보고들은 NEDD8이 세포 내에서 유비퀴틴의 역할을 대체할 수 있다는 근거를 제시하고 있다. 그러나 본 연구결과에서는 NEDD8이 HDAC6 매개 신호전달경로에서 프리유비퀴틴체인과 경쟁적으로 결합하여 이 들의 경쟁적 저해제로 작용할 수 있음을 제시하였다. 이는 유비퀴틴유사체 중 유비퀴틴과 가장 유사한 NEDD8이 유비퀴틴을 대체할 수 있다는 가설과 반대 되는 결과이다. 임상연구 결과들에 따르면 UPS의 결함이 발생하면 재 사용할

41

수 있는 모노 유비퀴틴의 총양이 줄어들고, 이러한 현상이 Alzheimer's disease(AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD) 및 amyotrophic lateral sclerosis (ALS)등과 같은 다양한 neurodegenerative disease들이 발생에 주요원인이 될 수 있음이 보고된 바 있다. 이러한 질환들 의 발생시 뇌의 특정 부위에서 HDAC6 매개의 aggregate들이 발견되는데 (Ross and Poirier, 2004; Li et al., 2011; Simões-Pires et al., 2013; Yan,

2014), 특히 이 중 PD환자의 Lewy bodies (LBs)와 Lewy neurites에 NEDD8이 다량으로 축적되어 있음이 보고되어져 있다 (Mori et al., 2005).

그러나 왜 HDAC6 매개 신호전달과정에서 NEDD8이 프리유비퀴틴체인의 결합을 저해하는지, 또한 그 결합을 저해함에도 불구하고 왜 내인성 유비퀴틴 의 양의 감소에 따라 NEDD8의 양이 증가하는 지에 대한 연구는 더 필요하다.

세포 내 유비퀴틴이 결핍이 되는 상황은 크게 두 가지 환경으로부터 유추해 볼 수 있다. 첫 번째는 유비퀴틴 유전자로부터의 직접적인 발현의 감소이며, 두 번 째는 유비퀴틴의 발현 양에 비해 소모량이 과하게 많아진 경우이다. 유비퀴틴 은 대표적인 기능으로 세포 내 불필요한 단백질의 제거에 관여하므로 유비퀴틴 의 소모량이 많아진 상황은 세포 내에 불필요한 단백질이 많이 쌓인 상황으로 유추가 가능하다. UPS에 의한 단백질의 제거 기작은 유비퀴틴체인과 결합된 불필요한 단백질들이 프로테아좀을 통해 분해되는 것으로, 이때 유비퀴틴체인 들은 프로테아좀의 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinaing enzyme, DUB)에 의해 모노 유비퀴틴으로 변화하며, 세포 내에서 바로 재사용 되어질 수 있다. 따라서

42

만약 UPS에 결함이 발생시 제거 대상의 단백질들에 유비퀴틴화가 일어난 상 태로 처리되지 못한 상황에서 계속 존재하게 되는데, 이 때 세포는 HDAC6를 매개로 하여 유비퀴틴화된 단백질들을 핵 주변으로 이동시켜 aggresome을 형 성한다고 보고 되어져 있다. 하지만 불필요한 단백질이 aggregate을 형성하여 선택적 autophagy로 제거되는 기작은 UPS시스템과는 다르게 유비퀴틴을 아 미노산 단위로 분해하여 세포 내에서 재사용 가능한 모노 유비퀴틴의 결핍을 유발 시킬 수 있다. 따라서 본 연구의 결과들을 기반으로 유추해 보면, 특정 환 경에서 일시적으로 세포 내에 불필요한 단백질들이 과량으로 축적되게 되면 UPS의 기능에 과부하를 유발시킬 수 있으며, 이때 유비퀴틴의 소모량이 급격 히 증가되지만 재사용 가능한 모노 유비퀴틴의 양은 현저히 감소하게 된다. 이 와 동시에 UPS의 일시적 과부하를 해결하기 위해 HDAC6 매개의 선택적 autophagy가 활성화되게 되지만, UPS를 통해 재사용이 가능하였던 모노 유비 퀴틴은 모두 autophagy에 의해 아미노산 단위로 분해되어 재사용 가능한 모노 유비퀴틴의 양은 더 현저히 감소시키게 된다. 이처럼 UPS의 일시적 기능적 이 상은 autophagy의 활성 유발과 더불어 가중적으로 세포 내 재사용 가능한 모 노 유비퀴틴의 양을 현저히 감소시키게 된다. 그러나 본 연구에서 밝힌 바와 같이 NEDD8이 UPS의 일시적 기능이상이 정상적으로 복원되는 시점까지 autophagy를 매개로 유발되는 유비퀴틴의 분해를 일시적으로 막아 준다면 세 포는 급격히 감소되는 유비퀴틴의 양을 일시적으로 저해할 수 있다. 본 연구에 서는 NEDD8의 기능이 유비퀴틴과 비교하여 무엇이 동일하며, 어떤 점이 상이 한가에 대한 근본적인 질문에 대답하기 위해 연구를 진행하였다. 상기 제시된

43

연구결과들의 해석과 가설들을 종합해보면, UPS에 일시적인 기능이상이 발생 할 경우 NEDD8은 autophagy과정에서 HDAC6와 강하게 결합하여 autophagy를 통해 분해되는 유비퀴틴 양을 감소시킴으로써, UPS의 기능이 정 상적으로 복원되는 시점까지 내재적 유비퀴틴 저해제로 작동할 수 있음을 시사 하고 있다.

44

Ⅴ. 참고문헌

1. Adhikari A, Chen ZJ: Diversity of polyubiquitin chains.

Developmental cell

16: 485-486, 2009

2. Boyault C, Gilquin B, Zhang Y, Rybin V, Garman E, Meyer‐Klaucke W, Matthias P, Müller CW, Khochbin S: HDAC6–p97/VCP controlled

polyubiquitin chain turnover.

The EMBO journal

25: 3357-3366, 2006

3. Boyault C, Sadoul K, Pabion M, Khochbin S: HDAC6, at the crossroads between cytoskeleton and cell signaling by acetylation and ubiquitination.

Oncogene

26: 5468, 2007

4. Bremm A, Komander D: Synthesis and analysis of K11-linked ubiquitin chains. In Ubiquitin Family Modifiers and the Proteasome, Springer, pp.219-228, 2012

5. dos Santos Passos C, Simões-Pires CA, Carrupt P-A, Nurisso A:

Molecular dynamics of zinc-finger ubiquitin binding domains: a comparative study of histone deacetylase 6 and ubiquitin-specific protease 5.

Journal of Biomolecular Structure and Dynamics

34:

2581-2598, 2016

6. Enchev RI, Schulman BA, Peter M: Protein neddylation: beyond

45

cullin–RING ligases.

Nature Reviews Molecular Cell Biology

16: 30, 2015

7. Grice GL, Nathan JA: The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.

Cellular and Molecular Life Sciences

73: 3497- 3506, 2016

8. Hao R, Nanduri P, Rao Y, Panichelli RS, Ito A, Yoshida M, Yao T-P:

Proteasomes activate aggresome disassembly and clearance by producing unanchored ubiquitin chains.

Molecular cell

51: 819-828, 2013

9. Hard RL, Liu J, Shen J, Zhou P, Pei D: HDAC6 and Ubp-M BUZ domains recognize specific C-terminal sequences of proteins.

Biochemistry

49: 10737-10746, 2010

10. Kalveram B, Schmidtke G, Groettrup M: The ubiquitin-like modifier FAT10 interacts with HDAC6 and localizes to aggresomes under proteasome inhibition.

J Cell Sci

121: 4079-4088, 2008

11. Kamitani T, Kito K, Nguyen HP, Yeh ET: Characterization of NEDD8, a developmentally down-regulated ubiquitin-like protein.

Journal of Biological Chemistry

272: 28557-28562, 1997

12. Kawaguchi Y, Kovacs JJ, McLaurin A, Vance JM, Ito A, Yao T-P:

The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.

Cell

115: 727-738,

46 2003

13. Leidecker O, Matic I, Mahata B, Pion E, Xirodimas DP: The ubiquitin E1 enzyme Ube1 mediates NEDD8 activation under diverse stress conditions.

Cell cycle

11: 1142-1150, 2012

14. Li G, Jiang H, Chang M, Xie H, Hu L: HDAC6 α-tubulin deacetylase:

a potential therapeutic target in neurodegenerative diseases.

Journal of the neurological sciences

304: 1-8, 2011

15. Li W, Ye Y: Polyubiquitin chains: functions, structures, and mechanisms.

Cellular and Molecular Life Sciences

65: 2397-2406, 2008

16. Li Y, Shin D, Kwon SH: Histone deacetylase 6 plays a role as a distinct regulator of diverse cellular processes.

The FEBS journal

280: 775-793, 2013

17. Mori F, Nishie M, Piao YS, Kito K, Kamitani T, Takahashi H, Wakabayashi K: Accumulation of NEDD8 in neuronal and glial inclusions of neurodegenerative disorders.

Neuropathology and applied neurobiology

31: 53-61, 2005

18. Nakashima H, Nguyen T, Goins WF, Chiocca EA: Interferon- stimulated gene 15 (ISG15) and ISG15-linked proteins can associate with members of the selective autophagic process, histone deacetylase 6 (HDAC6) and SQSTM1/p62.

Journal of Biological

47

Chemistry

290: 1485-1495, 2015

19. Pickart CM: Mechanisms underlying ubiquitination.

Annual review of biochemistry

70: 503-533, 2001

20. Ross CA, Poirier MA: Protein aggregation and neurodegenerative disease.

Nature medicine

10: S10, 2004

21. Saeki Y: Ubiquitin recognition by the proteasome.

The Journal of Biochemistry

161: 113-124, 2017

22. Schwertman P, Bekker-Jensen S, Mailand N: Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.

Nature Reviews Molecular Cell Biology

17: 379, 2016

23. Simões-Pires C, Zwick V, Nurisso A, Schenker E, Carrupt P-A,

Cuendet M: HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?

Molecular neurodegeneration

8: 7, 2013

24. Sun L, Chen ZJ: The novel functions of ubiquitination in signaling.

Current opinion in cell biology

16: 119-126, 2004

25. Swatek KN, Komander D: Ubiquitin modifications.

Cell research

26:

399, 2016

26. van der Veen AG, Ploegh HL: Ubiquitin-like proteins.

Annual review

of biochemistry

81: 323-357, 2012

48

27. Weissman AM: Ubiquitin and proteasomes: themes and variations on ubiquitylation.

Nature reviews Molecular cell biology

2: 169, 2001 28. Wickliffe KE, Williamson A, Meyer H-J, Kelly A, Rape M: K11-

linked ubiquitin chains as novel regulators of cell division.

Trends in cell biology

21: 656-663, 2011

29. Wilkinson K: Protein ubiquitination: a regulatory post-translational modification.

Anti-cancer drug design

2: 211-229, 1987

30. Wilkinson KD: Ubiquitin-dependent signaling: the role of ubiquitination in the response of cells to their environment.

The Journal of nutrition

129: 1933-1936, 1999

31. Yan J: Interplay between HDAC6 and its interacting partners:

essential roles in the aggresome-autophagy pathway and neurodegenerative diseases.

DNA and cell biology

33: 567-580, 2014

49 Abstract

Functional characterization of NEDD8

in HDAC6 and ubiquitin mediated signaling pathway

Mira Kwon

Department of Biomedical sciences

The Graduate School, Ajou university

(Supervised by Professor Ho-chul Kang)

NEDD8 (Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down- Regulated 8) is a small protein composed of 81 amino acids that has been known to play vital roles for versatile cellular processes including transcriptional regulation and DNA damage response (DDR). It is the most ubiquitin-like protein of 12 ULMs(ubiquitin like modifiers) with 60%

identity and 80% similarity with the amino acid sequences of ubiquitin and also has di-glycine motif in its c-terminus as ubiquitin. However, it still remains unclear what is the distinct role of NEDD8 compare to function of ubiquitin in cells. To address this point, we screened NEDD8 binding proteins using a human protein microarray system and identified Specific

50

NEDD8 Interacting Proteins (SNIPs) including histone deacetylase 6 (HDAC6) and BAG3 involving in the selective autophagy. Intriguingly, HDAC6, the member of class II HDAC, is well known as one of acceptor of unanchored ubiquitin chains and regulates aggresome formation triggering autophagic degradation of ubiquitinated aggregates. However, it has not been elucidated whether it binds to NEDD8 or not. To dissect the interaction mechanism between HDAC6 and NEDD8, we generated several deletions and point mutations of HDAC6 or NEDD8 and found that NEDD8 binds to the BUZ /Znf-UBP domain on the C-terminus of HDAC6 via its di-glycine motif as ubiquitin. Intriguingly, we also identified that HDAC6 prefers to bind unanchored K11 ubiquitin rather than unanchored K63 chains, which has been known to strong binding target of HDAC6 in the process of aggresome formation. Next, we proceeded to analyze how the NEDD8, K11 unanchored ubiquitin chains and HDAC6 proteins interact with each other.

Remarkably, we observed that NEDD8 inhibited interaction between HDAC6 and unanchored K11 ubiquitin chains via its BUZ/zf-UBP domain.

This result suggested that the binding site for HDAC6 by NEDD8 or unanchored K11 ubiquitin chains is the same, indicating that the binding between these proteins can be controlled by the binding affinity of each protein or their protein levels in certain conditions of cells. The more important implication of these results is that NEDD8 may act as an