NEDD8과 HDAC6간의 결합력 분석

HDAC6는 세포골격을 구성하는 알파-튜블린을 탈아세틸화시키는 효소로서 유비퀴틴 단량체, 유비퀴틴체인 및 유비퀴틴화된 단백질과 결합하는 ZnF-UBP도메인을 포함하고 있다. Aggresome형성과정에 있어 HDAC6의 활성은 ZnF-UBP영역과 유비퀴틴의 C말단에 존재하는 di-glycine motif와 결합에 의 존한다고 한다고 알려져 있다(Ryan L. Hard et al, 2010 (Hard et al., 2010;

dos Santos Passos et al., 2016). 유비퀴틴과 가장 구조적 유사성을 나타내는 NEDD8이 HDAC6와 특이적으로 결합하는 것은 세포내에서 HDAC6를 매개로 나타나는 다양한 세포내 신호전달과정이 유비퀴틴 뿐만 아니라 NEDD8에 의 해 조절될 수도 있음을 의미하는 것이다. 현재까지 HDAC6에 대한 연구는 유 비퀴틴과의 상호작용을 통한 aggresome형성에 관여하는 기전 이외에도 HDAC6를 매개로 나타나는 다양한 세포 내 신호전달 기전은 크게 HDAC6의 두 가지의 효소적 기능에 의해 조절될 수 있다. 첫째는 HDAC6의 탈아세틸화 와 관련된 효소적 기능으로 대부분 타겟 단백질들의 활성조절에 관여하는 것으 로 알려져 있으나, 유비퀴틴과의 연관성은 보고된 바 없다. HDAC6의 두번째 기능은 세포 내 효소반응을 위해 다른 단백질들과 결합하여야 하며, 이때 유비 퀴틴단량체나 유비퀴틴체인을 인지하여 기질을 선별하는 기능을 HDAC6의 ZnF-UBP영역을 통해 수행하는 것이다. 본 실험에서는 상기 언급한 HDAC6 와 유비퀴틴과의 상호작용이 매개하는 세포내 신호전달 과정에 있어 NEDD8 의 역할을 분석하고자 하였다. HDAC6에 대한 NEDD8의 역할은 NEDD8이 보

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유한 유비퀴틴과의 구조적 유사성에 미루어 볼 때 상호 경쟁관계에 있을 것으 로 판단된다. 이러한 연구가설을 입증하기위해 유비퀴틴단량체, 유비퀴틴체인, NEDD8 및 HDAC6 재조합 단백질을 이용하여 이들 간의 결합력을 분석하였 다. SF9에서 baculovirus를 통한 단백질 발현 시스템을 활용하여 정제된 GST-HDAC6를 NC membrane에 집적 후, NEDD8, 유비퀴틴단량체 및 유비 퀴틴체인들과의 결합 여부를 dot blot assay를 통해 분석한 결과, 앞서 검증한 연구결과들과 동일하게 HDAC6는 NEDD8과 아주 강한 결합력을 나타냈으나, 기존 보고된 연구결과와는 상이하게도 HDAC6는 K63 프리유비퀴틴체인보다 도 K11 프리유비퀴틴체인과 더 강하게 결합하는 것으로 나타났다(Fig 6A). 이 러한 연구결과는 HDAC6가 프리유비퀴틴체인과 상호작용한다는 기존 연구 보 고와는 일치하는 것이며, 더 나아가 HDAC6가 이러한 프리유비퀴틴체인들의 타입 중 K11과의 결합을 선호한다는 새로운 연구결과에 해당한다. 이에 대한 또 다른 정량적 분석방법으로 SPR(Surface plasmon resonance)assay를 활용 하여 HDAC6와 NEDD8간의 상호 결합력을 분석하였다 (Fig 6B). 분석 결과 HDAC6에 대한 NEDD8의 결합력은 1.18x10E^-9의 KD 에 해당하는 것으로 분석되었다. 이러한 연구결과는 HDAC6가 유비퀴틴과 상호작용시 나타내는 KD=60nM의 결합력(Boyault et al., 2006)보다 훨씬 더 강하게 NEDD8과 결 합하고 있음을 의미하는 것이다 (Fig 6C).

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Figure 6. NEDD8 is a novel HDAC6 binding partner (A)Indicated proteins overlay assay with native HDAC6 protein using a dot-blot system. GST and GST-HDAC6 put a dot onto nitrocellulose membrane and were incubated with indicated proteins.

NEDD8 or ubiquitin chains binding proteins were detected by each antibody. (B) Schematic illustration for SPR analysis. (C) NEDD8 and HDAC6 were subjected

into Surface plasmon resonance (SPR) analysis and identified that NEDD8 showed

direct interaction to HDAC6 with 1.8 x 10 ^-9 nM scale.

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