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A Nematode Infection in the Epithelial Tissue of Cultured Rockfish Sebastes schlegeli in Cheonsu Bay, Western Korea

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603

Copyright © 2014 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

서 론

조피볼락

(Sebastes schlegeli)

넙치와더불어국내해산어 류양식을대표하는중요한양식대상어종으로서몸과지느러미 흑갈색

,

배는회색을띄는난태생어종이다

.

수심

10-100 m

암초지대에서생활하며한국연안

,

일본중국등의 서태평양지역에서식한다

.

양식초기에는양식생산량보다 면어업량이많았으나

1990

년대후반부터양식생산량이 격이증가하였고

, 2007

년에는

35,564

톤까지생산량이증가하 였다

.

하지만이후로감소증가를반복하면서

2013

년에

23,757

톤을생산하였고

,

현재는넙치와함께주요해산양식 어종으로서자리를잡았다

(KOSIS, 2013).

하지만연중빈번하

발생하는질병과사육환경의급변화에의해양식장에서의 폐사가지속적으로발생하고있는실정이다

.

조피볼락에서 견되는세균성질병으로는활주세균병

,

연쇄구균병

,

비브리오 병이있으며

,

바이러스성질병으로는림포시스티스병이있다

.

또한조피볼락에기생하는기생충으로는

Microcotyle sebastis, Benedenia sp., Trichodina sp., Scutica, caligus

등이보고되어 있으며

(National Fisheries Research & Development Institute,

2012),

현재까지조피볼락에감염되는선충에대한보고는

.

그러나캐나다

British Columbia

해안에서어획된자연산 볼락류

(Sebastes spp.)

에서

Trichosomoidid

Huffmanela

spp.

선충이 감염된사례가유일하게 보고되어 있으며

,

자연

볼락류에감염된

Huffmanela spp.

볼락의진피에감염되

서해안 천수만 일대 양식 조피볼락(Sebastes schlegeli)의 상피 선충 감염현황

서한길·서정수·류민경·이은혜·권세련

1

·강종순

2

·노윤산

2

·최혜승·정승희·한현자*

국립수산과학원 병리연구과, 1선문대학교 수산생명의학과, 2충청남도 수산관리소

A Nematode Infection in the Epithelial Tissue of Cultured Rockfish Sebastes schlegeli in Cheonsu Bay, Western Korea

Han-Gill Seo, Jung Soo Seo, Min-Kyung Ryu, Eun Hye Lee, Se Ryun Kwon

1

, Jong Soon Kang

2

, Yun-San No

2

, Hye-Sung Choi, Sung Hee Jung and Hyun-Ja Han*

Pathology Division, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-902, Korea

1

Department of Aqualife Medicine, Sun Moon University, Asan 336-708, Korea

2

Chungnam Fisheries Management Office, Boryoung 355-943, Korea

We investigated a nematode infection in the epithelial tissue of rockfish Sebastes schlegeli cultured in Cheonsu Bay, western Korea, from May 2013 to April 2014. Nematodes infected the epithelial tissues of various external organs, including the fins, operculum, nares, mouth, and head. Over a 1-year period, the overall nematode infection rate in rockfish was 55% ( n =89/163): 56.7% ( n =17/30) in May 2013, 88% ( n =29/33) in August 2013, 0% ( n =0/30) in October 2013, 70% ( n =21/30) in January 2014, and 55% ( n =22/40) in April 2014. During this study, the only mass mortality of cultured rockfish in Cheonsu Bay was in August 2013, when we identified skin wounds on the rockfish caused by the nematodes escaping from their hosts. During this period, the accumulated mortality for 2 weeks was 1.4–22.4% in different farms. In addition, several pathogenic bacteria ( Photobacterium damselae , Vibrio spp., and Streptococcus iniae ) were isolated from the moribund rockfish; these were thought to be transmitted through the skin wounds caused by the nematodes.

Key words: Rockfish, Seabastes schlegeli , Nematodes, Cheonsu Bay

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/)which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

http://dx.doi.org/10.5657/KFAS.2014.0603 Kor J Fish Aquat Sci 47(5) 603-610, October 2014

Received 9 June 2014; Revised 5 August 2014; Accepted 8 August 2014

*Corresponding author: Tel: +82. 51.720.2483 Fax: +82. 51.720.2498

E-mail address: [email protected]

(2)

Speare 2002, Moravec et al., 2005).

어류는선충

(Nematode)

중간숙주혹은종숙주가되며

,

재까지

650

이상의선충이어류에감염되는것으로보고 되어있다

.

일반적으로선충은자연산어류에서주로감염보고 많으며

,

생활사에서중간숙주를필요로하기때문에 폐된양식환경의양식어류에서는선충류에감염되는경우는 많지않다

.

담수어에서는

Camallanoidea

Ascaroidea

목의 선충류가

,

해산어에는 일반적으로

Ascaridoidoiea (Contrace- cum, Pseudoterranova, Anisakis), Camallanoidea (Camalla- nus, Culcullanus), Dracunculoidea (Philonema, Philometra), Spiruroidea (Metabronema, Ascarophis)

목의선충류의감염 보고되어있다

(Edward, 1996).

일반적으로선충의몸은 늘고길며원통모양또는모양으로서체절적구분은없다

.

부분의종은몸의끝이점차가늘어지는형태를하고있으며

,

좌우대칭의내부구조를하고있다

.

외피는표피에서분비한 티클로덮여있기때문에성장하기위해서는탈피가필요하다

.

선충은성충이되기까지

4

탈피하고

,

5

기가성충이된다

(Egusa, 2006; Park and Oh, 2009).

선충은자웅이체로

,

대부분 어류에기생하는선충은난생으로일반적으로물에서알이 부화하여

,

자유유영하는 자충을방출하지만

, Camallanus

Philometra

선충의경우태생으로

,

암컷이새끼를수중으로 방출한다

.

이후선충의자충은갑각류와같은중간숙주에먹히 되며

,

이를종숙주가되는어류가먹으면어류에서성충이

,

어류가중간숙주인경우중간숙주가되는어류에서포낭 형성

,

어류를종숙주가되는

,

포유류혹은다른어류에 먹으면안에서성충으로성장한다

(Edward, 1996).

2012

7

서해안충청남도천수만

(126.42°N, 36.60°E)

매항가두리양식장곳에서사육되는조피볼락에서지느러

,

아가미뚜껑의상피조직에감염되는선충이최초로확인되 었으나

,

당시여러가지이유로선충특성피해량등에대한 조사가이루어지지못했다

.

그래서연구에서는천수만일대 가두리양식장의조피볼락에서해당선충감염피해현황을 정확히파악하기위하여

2013

5

월부터

2014

4

월까지

1

5

회에걸쳐천수만일대조피볼락을대상으로해당선충 감염에대한피해조사를실시하였다

.

선충의감염특성을 히기위하여샘플링한조피볼락에대한일반적인질병검사인 기생충

,

세균바이러스검사를수행하였으며

,

계절별선충 염율조피볼락폐사율의관계를조사하여조피볼락선충 염에대한기초자료를수집하고자하였다

.

재료 및 방법

조피볼락 양식 현황 조사 및 시료 채취

2013

5

, 8

, 10

, 2014

1

4

,

5

회에걸쳐

1

년간서해안천수만일대의해상가두리

6

지점

(Fig. 1)

조피

볼락을대상으로양식현황어류폐사율을조사하였다

.

각양 식장마다조피볼락을각각

3-10

마리씩샘플링하였으며

(Table 1),

시험어는샘플링

2

시간이내에일반적인질병검사를 시하였고검사전까지냉장상태로보관하였다

.

기생충 검사

샘플링조피볼락의기생충검사를위하여체표아가미 광학현미경을사용하여외부기생충을검경하였다

.

모든 피볼락의내부장기외부기관에서해부용가위와핀셋을 용하여선충감염부위의확인분리를실시하였다

.

어류당 충의감염개체수를확인하였으며또한분리된선충의크기를 측정하였다

.

세균 검사

세균검사를위하여신장과비장조직을무균적으로적출한

1.5% NaCl

포함된

Brain Heart Infusion Agar (BHIA, Gibco, USA)

평판배지에도말한

25℃

항온배양기에배양 하였다

.

배양된세균은계대배양을실시하여순수분리하였으

,

동정을위해

16S rRNA

유전자에대한염기서열분석을 실시하였다

.

분리균의

genomic DNA

추출과

PCR

분석은상기 동일하게

High pure template preparation kit (Roche, Ger-

West sea

Cheonsu-bay Taean-gun

Seosan-si

Hongseong-gun

Anmyeondo

Boryeong-si Wonsando

Sabsido

E

D C A B F

Fig. 1. Map of sampling sites in Korea.

A, Wonsando; B, Sodo; C, Tangye; D, Gumae; E, Daeyado; F, Dangamri.

(3)

Table 1. Diagnosis results of this study Sampling Date (year

.month) Sampling Site

Fish Size (A vg.) Tested fish No. (n)

Mortality rate for Nematodes sp. infection Major sings 2 weeks (%)

rate (%) Microcotyle sebastis in - fection rate (%)

Bacterial infection rate (%)

NCBI blast result of 16S rRNA sequencing (% homology) Length (cm) W eight (g) 2013. 05.

A 18.3 93.7 10 0 - 100 100 0 - C 15.4 68.5 10 0 - 40 100 0 - C 13.3 45.3 10 0.2 Skin ulcer 30 40 60 Photobacterium sp (99%). Aeromonas salmonicida (99%) 2013. 08.

A 19.6 171.2 5 12 Hole of go through abdomen, Skin and fin injury 100 60 100 Photobacterium damselae (98%) B 21.2 180.0 3 5.4 Snout, skin and fin injury Anal and operculum hemorrhage 100 66 100 Vibrio sp.(99%) C 26.2 329.0 3 2.1 Skin and fin injury 100 0 100 Vibrio sp (99%) D 23.0 257.3 6 6.02 Snout, skin and fin injury 100 100 100 Vibrio sp. (99%) D 21.3 150.5 2 1.4 Skin and fin injury , Operculum, eyes hemorrahge 100 100 100 Streptococcus iniae (99%) E 26.2 276.3 4 22.4 Skin and fin injury 100 0 100 Vibrio sp. (99%) E 26.7 300.0 6 5.6 Skin and fin injury 100 0 100 Vibrio sp. (99%) F 22.3 161.3 4 0 Skin and fin injury , Exophthalmos 0 0 50 Lactococcus garviae (99%) 2013. 10. C 24.8 243.3 10 0.35 Eyes hemorrahge, Operculum and abdominal wall hemorrhage 0 0 100 Streptococcus iniae (99%) E 26.2 289.8 10 0 - 0 20 0 - E 29.2 350.5 10 0 - 0 0 0 - 2014. 01.

C 17.8 120.6 5 0 - 100 40 0 - 28.1 436.4 5 0 - 100 0 0 - E 22.9 228.8 5 0 - 20 40 0 - 28.3 41 1.2 5 0 - 20 0 0 - E 13.8 48.6 5 0 - 100 0 0 - 23.8 240.0 5 0 - 80 0 0 - 2014. 04.

A 24.1 213.7 10 0 - 80 100 0 - C 27.4 423.2 5 0 - 60 100 0 - 19.2 132.0 5 0 - 40 100 0 - D 22.5 198.3 10 0 - 40 100 0 - E 25.9 331.0 10 0 - 50 100 0 - * No fish virus was detected with RSIV , VHSV , VNNV , MBV and HR V. RSIV , red seabream iridovirus; VHSV , viral hemorrhagic septicaemia virus; VNNV , viral nervous necrosis virus; MBV , marine birnavirus; HR V, hirame rhabdovirus.

(4)

전자는

Table 2

조건으로

PCR

수행하였고

,

증폭된

PCR

산물은전기영동으로

band

확인한

, Gel SV kit (GeneAll, Korea)

정제하고

Topo TA cloning

(Invitrogen, USA)

용하여

cloning

하여염기서열을확인하였다

.

염기서열의분석

에는

Genetyx Ver. 8.0 (SDC Software Development, Japan)

사용하였으며

, NCBI

에서제공되는

BLAST program

정보를 이용하여상동성을비교하였다

.

바이러스 검사

시험어의신장과비장조직을적출하여마쇄한

High pure

PCR template preparation kit (Roche, Germany)

사용하여

DNA

추출하였고

, Easy-spin Total RNA Extraction Kit (In- tron, Korea)

사용하여

RNA

추출한

SuperScript

TM

Ⅱ Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)

사용하여

cDNA

합성하였다

. PCR

분석은

Ex Taq

(TaKaRa, Japan)

용하여매뉴얼에따랐으며

,

사용된

primer set

PCR

조건은

Table 2

나타내었다

.

증폭된산물은전기영동으로확인하였

으며

,

모든

PCR

분석은양성대조음성대조를함께비교하

였다

.

해산어에서주로검출되는바이러스인참돔이리도바이 러스

(Red sea bream irido virus; RSIV),

바이러스성출혈성패 혈증바이러스

(Viral hemorrhagic septicaemia virus; VHSV),

바이러스성신경괴사증바이러스

(Viral nervous necrosis virus;

VNNV),

마린버나바이러스

(Marine birna virus; MBV),

히라 메랩도바이러스

(Hirame rhabdo virus; HRV)

검사 대상으 하여

polymerase chain reaction (PCR

)

으로검사하였다

(Table 1).

증폭된산물은

1.5% Agarose gel (Bioneer, Korea)

사용하여전기영동을실시하였으며

UV

상에서

band

인하였다

.

선충에감염된조피볼락은육안적으로특별한외상이없었으

,

지느러미나아가미뚜껑부위가붉게보였다

(Fig. 2A, 2B,

2C).

그러나이것을핀셋등으로조심스럽게긁어보면붉은색

선충을확인있는데

(Fig. 2F),

연구에서최초로확인 양식조피볼락의선충은대부분가슴지느러미연골과연골 사이의상피부위에가장많이감염되어있었으며

,

외에도 가미뚜껑

,

주둥이연골주위

,

지느러미의상피에감염되어 있는것이확인되었다

.

조피볼락에서분리한선충은붉은색의원통형으로서현미경 으로관찰하였더니표면이매끈하였다

.

연구에서는선충의

동정을위하여어체에서분리한선충의

genomic DNA

분리

하여

18S rRNA

유전자

(1,483 bp)

염기서열을분석

, NCBI

에서

제공되는

BLAST program

정보를이용하여상동성을비교였

.

분석결과금붕어에서분리되는선충류인

Philometroides carassii

97%

가장높은상동성을나타내었으나

(Data not

shown),

정확히일치하는선충유전정보는없었으며

,

현재까지

Genbank

등록된선충관련유전정보가한정적이기때문에

유전학적으로는명확히동정없어

,

현재조피볼락선충의 동정을위하여형태학적특성연구를진행중에있다

.

2013

5

월부터

2014

4

월까지

1

년간천수만일대

6

(A-F)

지역의

(Fig. 1)

가두리양식장에서사육하는조피볼락의 질병검사결과를

Table 1

나타내었다

.

조사기간동안의천수 일대의연간수온은

2013

5

10-12℃, 2013

8

25- 27℃, 2013

10

18-19℃, 2014

1

3-4℃, 2014

4

9-10℃

나타났다

. 2013

5

10

월에조사한각각

1

개소 양식장

2013

8

고수온기를제외하고

,

대부분의조피 볼락양식장에서질병으로인한폐사가발생하지않았다

.

고수

Table 2. Oligonucleotide primers used in PCR amplification

Gene Nucleotide sequence of primer PCR condition Size (bp)

RSIV Forward 5´-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3´ 94℃ (30 s)-58℃ (1 min)-72℃ (1 min)

〔30 cycle〕 570

Reverse 5´-GCACCAACACATCTCCTATC-3´

VHSV Forward 5´-ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG-3´ 95℃ (30 sec)-55℃ (30 s)-72℃ (45 sec)

〔30 cycle〕 505

Reverse 5´-GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC-3´

VNNV Forward 5´-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3´ 95℃ (40 s)-50℃ (40 s)-72℃ (40 sec)

〔25 cycle〕 427

Reverse 5´-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3´

MBV Forward 5´-GCACCACGAAGGTACGAAAT-3´ 94℃ (1 min)-55℃ (1 min)-72℃ (1 min)

〔30 cycle〕 430

Reverse 5´-GTACGTTGCCGTTTCCTGAT-3´

HRV Forward 5´-TGAGGTAGAGCAAGCCAACA-3´ 94℃ (30 s)-58℃ (1 min)-72℃ (1 min)

〔30 cycle〕 553

Reverse 5´-ACATGACTGGCCGAAAAGAG-3´

16S rRNA Forward 5´-CTGAGCCAGGATCAAACTCT-3´ 95℃ (30 s)-49℃ (30 s)-72℃ (90 s)

〔35 cycle〕 1,404

Reverse 5´-CGTTACCTTGTTACGACTT-3´

RSIV, red seabream iridovirus; VHSV, viral hemorrhagic septicaemia virus; VNNV, viral nervous necrosis virus; MBV, marine birnavirus;

HRV, hirame rhabdovirus.

(5)

온기인

7

말부터

8

초까지

2

주간조피볼락의폐사율이 기간중에가장높았으며해당기간조피볼락누적폐사율은

0-22.4%

나타났다

.

조사지역별로는

2013

10

월에조사

해역당암리

(F

지역

)

제외하고

,

모든조사지역과조사 시기에선충감염이확인되었으며

(Table 1),

모든검사개체에서 바이러스는검출되지않았다

.

Fig. 2. Rockfish Sebastes schlegeli infected by Nematodes.

A, Nematodes infected rockfish; B, Pectoral fin; C, Head; D, Oral cavity; E, Base of pectoral fin; F, Extracted Nematodes.

A

C

E

B

D

F

(6)

선충의 감염률은

2013

5

양식장

3

개소에서

56.7%

(n=17/30), 8

월에는양식장

8

개소에서

88% (n=29/33), 10

Fig. 3. Rockfish Sebastes schlegeli infected by Nematodes and pathogenic bacteria.

A, Died rockfish in cultured cage; B, Fin and operculum injury; C, Hole in fin; D, Hole in abdomen; E, Lost of the caudal fin; F, Skin hem- orrhage.

에는 양식장

3

개소에서

0% (n=0/30), 2014

1

양식장

3

개소에서

70% (n=21/30)

4

월에는양식장

4

개소에서

55%

A

C

B

D

F

E

(7)

(n=22/40)

나타났다

.

특이적으로

2013

8

조사시에조피 볼락에폐사가확인되었으며

(Fig. 3A),

선충이감염된어체 외부로빠져나가면서생긴다수의상처가확인되었다

.

조피볼 락의지느러미상처구멍

(Fig. 3B, 3C),

지느러미기부구멍

(Fig. 3D),

지느러미일부탈락

(Fig. 3E)

등의증상과함께상처 통한

2

세균감염으로추정되는외부궤양출혈등을 수반하였다

(Fig. 3F).

조피볼락의대량폐사가확인된

, 2013

8

월에는선충뿐만 니라조사한모든조피볼락의내부장기에

1-2

종의병원성세균 같이분리되었다

(Table 1).

분리된세균의

16S rRNA

유전자 염기서열분석결과

Photobacterium damselae, Vibrio spp.

Streptococcus iniae

동정되었으며

,

조사한양식장마다 리된병원세균종이차이가있는것으로확인되었다

(Table 1).

연구에서분리된균종은모두조피볼락에병원성이있는 으로알려져있어

(Vendrell et al., 2006; Won et al., 2008; Jung et al., 2012),

조피볼락의대량폐사는연구에서분리된병원 세균감염이주요원인인것으로추정되었다

.

조사한모든조피볼락에서어류개체당감염된선충의마리수 확인하지못하였으나

, 2013

5

월에샘플링을실시한조피 볼락에서는어류한마리

1-209

마리의선충이분리되었으며

, 2014

1

월에는

1-93

마리가

, 4

월에는

1-262

마리의선충이 리되었다

.

위의결과로부터선충의감염정도는조피볼락의 체별로크게차이가나는것을확인할있었다

. 2014

4

월에 조사한선충의길이무게를측정한결과

2

년간양식한조피 볼락에서는

15.5±3.5 mm, 29±15 mg

선충이

, 3

년간양식 조피볼락에서는

19.5±2.5 mm, 37±8 mg

선충이분리되 었다

.

선충의크기와어류연령간의연관성이있어보여통계학 적으로

(t-test)

연관성을분석하였으나

,

연령과선충크기사이 에는통계학적으로유의적인연관성이없는것으로나타났다

(

선충길이

, P=0.43;

선충무게

, P=0.22).

이전의많은연구결과

,

어류에선충감염자체가숙주의직접 적인폐사를유발하는경우는거의없었다

(Park and Oh, 2009).

연구에서도이와마찬가지로선충단독감염시에조피볼락 폐사가확인되지않았으며

,

육안적으로도지느러미나 가미뚜껑에선충이감염된조피볼락에서도유영호흡의 증상이확인되지않았다

.

이러한결과로조피볼락의 감염자체가숙주에직접적인폐사를유발한다기보다는 충이빠져나간부위에생긴상처를통하여

2

병원세균의 염이발생하여폐사가발생한것으로추정된다

.

생활사가가장알려진선충류인잉어의사상충병의원인 체인

Philometroides cyprini

경우어체외부로방출된자충 중간숙주인물벼룩에먹혀체강내에서

6-7

후에감염 충이되고

,

물벼룩을잉어가먹으면감염자충이잉어의장벽 통과하게된다

.

이후감염자충은체강으로이동하여부레

,

신장

,

생식소등에기생하다가성숙되어수정한후에암컷은 어의비늘주머니로이동성장하여자충을생산하는것으로

알려져있다

(Egusa, 2006; Park and Oh, 2009).

연구에서도

2013

10

월의조피볼락의선충감염을조사한결과육안적

기생충검사에는선충감염이확인되지않았으나

, 2014

1

월에는육안적으로선충감염이확인되었다

.

선충류는생활환 에서종숙주로어류에감염되기이전의단계에서

,

성숙을위하 대개갑각류인요각류

(copepod)

중간숙주로한다

(Wang,

2002).

어류에기생하는선충의일반적인생활사로추정해

8-10

월까지는어체에서빠져나가는선충이중간숙주에

염되는기간이거나

,

선충이중간숙주감염기간을지나종숙주 어류에감염되었지만일반적인외부감염이아닌다른조직 감염이되어육안적으로감염이확인되지않는등의가능성 생각해필요가있겠다

.

서해안천수만일대의조피볼락가두리양식장의경우대부분 수심

5 m

이하로

,

비교적수심이깊은남해안동해안의가두 양식장과는환경적인특성이많이다르다

.

현재까지남해안 동해안에서양식되는조피볼락에서는이와같은선충감염 보고가되지않는점에서천수만의지역적인특성이선충감염 연관성이있을가능성도있어

,

천수만이외의지역의 피볼락의선충감염에대한추가적인조사가필요할것으로 인다

.

또한선충류의특성상숙주로부터선충을제거하기가 실상불가능하므로

,

감염환의단계에서종숙주로의선충의 염을차단하여야한다

.

따라서선충의중간숙주혹은운반숙주 탐색하여감염경로를제거하는방법에대한연구가필요할 것으로생각된다

.

세계적으로조피볼락에기생하는선충은현재까지보고된 적이없기에이번연구에서분리한선충이신종일가능성이 으나

,

전자현미경을통한형태학적분석유전학적특성분석 통한정확한분류가필요하여현재연구중에있다

.

,

후의연구로선충의근본적인구제를위해서는선충생활사 명이필요할것이다

.

사 사

연구는 국립수산과학원

(

수산생물질병 특성 연구

; RP- 2014-AQ-072)

지원에의해서운영되었습니다

.

References

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Blackwell, Iowa state university Press, USA, 166-170.

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http://dx.doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.08.013.

수치

Fig. 1. Map of sampling sites in Korea.
Table 1. Diagnosis results of this study Sampling Date (year
Table 2 에 나타내었다 .  증폭된 산물은 전기영동으로 확인하였
Fig. 2. Rockfish Sebastes schlegeli infected by Nematodes.
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참조

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