Effects of Propolis on the Ovalbumin-Induced Allergic Asthma in Mice

교신저자 : 박민철, 전북 익산시 신용동 344-2 원광대학교 부속 한방 병원 안이비인후피부과(Tel : 063-859-2821, E-mail : spinx11@wonkwang.ac.kr)

∙접수 2011/03/07 ∙수정 2011/03/29 ∙채택 2011/04/05 Otolaryngology & Dermatology 2011;24(1) : 36-44

Propolis 투여가 Ovalbumin으로 유발된 마우스의 알러지성 천식에 미치는 영향

변지환¹⁾·조은희^2,3)·맹드게렐¹⁾·박민철^1,3)

1) 원광대학교 한의과대학 안이비인후피부과

2) 원광대학교 한의과대학 침구과

3) 원광대학교 한국전통의학연구소

Effects of Propolis on the Ovalbumin-Induced Allergic Asthma in Mice

Ji-Hwan Byun

·Eun-Hee Jo

·Mendgerel

·Min-Cheol Park

Objective : Propolis (PP) has been used in oriental medicine. PP has various biological activities.

However, its immunoregulatory and anti-inflammatory activities have not been well studied. In this study, I investigated these activities of PP by using ovalbumin-induced allergic asthma in mice.

Methods : To examine the effect of PP on allergic asthma, mice were sensitized with 100 ㎍ of OVA and 1

㎎ of aluminum potasssium sulfate (Alum; Sigma) intraperitoneally on day 0 and 7. On day 14, mice were challenged on consecutive 3 days with 5% OVA and AHR was assessed 24 hours after the last challenge. To examine severity of AHR, I examined the population of eosinophiles and T cells in spleen and lung and cytokine production in T cells. Futhermore, I examined histological changes during the OVA-induced allergic asthma.

Results and Conclusion : PP reduced the population of eosinophil and CD4

T cells on the OVA-induced AHR mice model. PP also inhibited IL-4 production but increased INF-g production in T cells. These results suggest that PP may be beneficial material for allergic asthma.

Key words : propolis, asthma, ovalbumin, CD4

T cell, cytokine

Ⅰ. 緖 論

알러지성 기관지 喘息은 전 세계적으로 인구의 약 10%가 앓고 있는 呼吸器의 염증질환으로서, 가역적 인 氣道閉塞과 氣管支 過敏性, 氣道의 浮腫, 好酸球

性-淋巴球性 염증을 특징으로 하고 임상적으로 발작 적인 呼吸困難, 咳嗽, 喘鳴音 등의 소견을 보이는 복 합적인 임상적 증후군을 말한다. 최근 고도의 産業 化에 따른 새로운 抗原의 출현 및 環境公害 특히 大 氣汚染, 흡연인구의 증가 등으로 인해 喘息의 유병 율은 증가하고 있는 추세이며 기관지 확장제나 항염 증제인 스테로이드, 면역조절제 등이 症狀이나 抗原 에 따른 치료제로 사용되고 있으나 획기적인 치료법 은 되지 못하고 있다^1-4).

Propolis (PP)는 꿀벌이 벌집을 보호하기 위하여 분비하는 물질로서, 식물들이 자신의 잎, 꽃, 열매 및 새싹 등을 보호하기 위해 분비하는 항균성과 방 수성, 절연성을 가진 수지성의 화합물을 꿀벌들이 채취하여 그들의 타액의 효소와 혼합하여 만든 황갈 색 또는 암갈색의 수지상 물질이다^5,6). PP는 resin, wax, esseintial oil, pollen 등의 이화학적 성분으로 구성되어 있다⁵⁾.

최근 기관지 喘息에 대한 한의학적 연구로는 이 등^7-9)의 단미 및 처방을 이용한 염증반응이나 면역 기능에 관한 동물실험이 있었고, 차 등^10-13)이 喘息 에 분자생물학적 실험기법을 도입하여 IL-6, IL-8 등의 cytokine이나 IgE, GM-CSF mRNA level 등 에 대한 여러 처방의 효과에 대한 실험연구가 이루 어져 왔다.

PP에 대한 연구로는 박 등^5,14)이 propolis의 항균, 살균, 항염증, 항바이러스, 항암, 항산화 및 항궤양 작용이 있음을 보고하였고, Leticia 등¹⁵⁾이 PP의 경 구투여가 기도저항, 폐 조직, 세포활성물질(기관지폐 포세척액내 cytokine양)에 미치는 영향에 대해 보고 하였다.

저자는 PP의 알러지성 기관지 천식 억제 효과를 조사하기 위하여 Balb/c 마우스에 ovalbumin (OVA)를 이용하여 알러지성 천식을 유발하고, 천식 이 유발된 마우스에 PP를 투여하여 폐 조직, 호산 구 비율, 비장내의 세포활성물질 및 T 세포의 분포 와 특징 등에 미치는 영향을 관찰하여 유의성 있는

결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 實驗材料 및 方法

1. 실험동물

동물은 자성인 8주령의 Balb/c 마우스를 (주)오리 엔트바이오에서 공급 받아 실험당일까지 고형사료와 물을 충분히 공급하고 실온 22 ± 2도를 유지하였다.

2. 알러지 모델 및 알러지성 기관지 천식의 유도 실험 1, 2주째 100 ㎍의 난알부민 (OVA, chicken egg ovalbumin; Sigma)과 1 ㎎의 aluminum potassium sulfate (Alum; Sigma)를 PBS (phosphate buffer saline, pH. 7.4) 0.2 ㎖에 혼합하여 마우스의 복강 내로 주입하였다. 3주째 5% OVA/PBS 20 ㎖을 분무기를 이용하여 30분 씩 3일간 노출시켜 감작시켰다. 실험은 5마리를 1군으 로 하여, 정상군, 천식유발군 (대조군, OVA- Control), 천식유발후 PP투여군 (실험군, 실험군Ⅰ;

100 ㎎/㎏, 실험군Ⅱ; 1 g/㎏) 등 4군으로 나누었다.

정상군은 40% Ethanol을 투여하였고, 대조군은 천 식 유발 후 40% Ethanol을 투여하였으며, 실험군은 천식을 유발하고 1주일간 100 ㎎/㎏, 1 g/㎏의 PP를 경구투여하였다.

3. Propolis (PP)의 제조와 투여

본 실험에 사용된 Propolis는 다까노하치라코리아 에서 제공받아 사용하였다.

Propolis 원액을 40% Ethanol로 100 ㎎/㎏과 1 g/㎏로 희석하여 PP를 제조 사용하였다.

실험군의 경우 PP (100 ㎎/㎏, 1 g/㎏)를 1회 0.2

㎖씩 경구로 투여하고, 투여기간은 면역된 마우스를 분무에 감작시키기 4일 전부터 최종 감작시까지, 즉 제 11일부터 제 17일까지 매일 1회, 총 7일 동안 투

여하였다.

4. 효소면역측정법(ELISA)을 이용한 세포활성물질 측정

최종 감작 1일 후 마우스에서 채취한 Spleen에 서 total T 세포를 분리하여 각 세포활성물질을 측 정하기 위해 ELISA kit (R&D system)를 사용하여 IL-4, INF-g의 생산량을 측정하였다. 각 antibody를 coating 완충용액에 희석하여 microwell에 coating 한 후 4℃에서 overnight하였다. 각 well을 2회 세 척 완충용액으로 세척한 후 Blocking buffer (10%

FBS in PBS)를 200 ㎕씩 분주하였다. 2시간 동안 실온에서 방치한 후 Spleen에서 분리한 total T 세 포를 100㎕ 씩 분주하였다. 다시 2시간 동안 실온에 서 방치한 후 4회 세척 완충용액으로 세척한 다음 2 차 antibody 100 ㎕를 처리하고, 1시간 실온에서 방 치한 후 다시 세척하였다. 기질 (AP; avidin peroxidase, Sigma)을 100 ㎕씩 분주하고 30분간 방치한 후 100 ㎕의 발색시약을 처리한 후 ELISA reader 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

5. 유세포분석 (Flow cytometry analysis) 제 18일째 Lung과 Spleen에서 얻은 세포로부터 다양한 세포 표면 분자들에 대한 항체를 이용하여 면역염색하기위해 2×10⁶ 세포로 조정하여 염색완충 용액 (0.5% Bovine Serum Albumin in PBS)으로 1회 세척하였다.

이를 FITC (flouresceinated isotiocyanate), PE (phycoerthrin), PerCP (perdinin chlorophyll- alpha protein), APC (allophycocyanin) 등 형광물 질이 결합된 CD4, CD8, CCR3, CD25, CD44, CD69, CD62L 등의 항체를 시료에 가하여 4℃에서 30분간 반응시키고 염색완충용액으로 1회 세척한 후 세포표면 분자들의 발현을 유세포분석기 (FACScallibur, BD Biosciences) 로 분석하였다.

6. 조직병리검사

폐를 떼어내어 즉시 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀으로 포매한 후 3 ㎛ 두께의 block을 제작하 여 Hematoxylin/eosin (H&E) 염색을 시행하였다.

7. 통계처리

다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.

Ⅲ. 實驗 結果

1. 염증 유발 마우스의 기관지 폐조직에 대한 Propolis의 효과

마우스를 OVA/Alum으로 면역한 후에 5% OVA (3 times/3 days)로 감작하고, 마지막 감작 24시간 후에 폐 조직을 H&E 염색하여 관찰하였다(Fig. 1).

Fig. 1A에서 나타난 바와 같이 정상군에서는 기 도가 선명하게 보이고, 염증세포의 침작은 보이지 않고 있다. 그러나 대조군에서는 기도의 협착과 기 도벽의 두께가 증가하였고, 염증세포의 침착이 현저 하게 증가되었다(Fig. 1B). 실험군에서는 기도의 협 착과 염증세포의 침작이 대조군에 비해 감소하였는 데, Fig. 1D에서 나타난 바와 같이 실험군Ⅱ (1 g/

㎏)에서 Fig. 1C인 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)보다 기도의 협착과 염증세포의 침작이 보다 감소하였다.

2. 기관지 천식 유발시 폐와 비장내의 호산구 비율에 미치는 영향

폐와 비장내에 PP가 호산구의 침윤을 억제하는가 를 조사하기 위하여 폐와 비장조직을 적출하여 유세 포분석기를 통해 호산구의 비율을 조사하였다.

CCR3(+), CD23(-) 인 영역이 호산구를 의미한다.

폐 내에서 각 군의 호산구의 비율을 조사한 결과,

A B

C D

A B

C D

Fig. 1. PP inhibits airway inflammation.

Lung tissues were sectioned and stained with hematoxylin and eosin (H&E). Mice (Fig. B, C, D) were immunized and challenged to OVA. Detail methods were described with materials and methods.

A: non immunized mice, B: mice that were immunized and challenged consecutive 3 days with OVA were sacrificed 24 hrs after last challenge. C, D:

mice that were immunized and treated with PP (C:

100 ㎎/㎏, D: 1 g/㎏) before challenge consecutive 3 days with OVA were sacrificed 24 hrs after last challenge. Original magnification, x400. Images are representative sections of five mice per group.

정상군에서 2.5%, 대조군은 8.0%, 실험군Ⅰ (100

㎎/㎏)에서 4.3%, 실험군Ⅱ (1 g/㎏)에서 2.8%로 농 도 의존적으로 호산구의 비율이 감소하였다(Fig. 2).

비장 내에서 각 군의 호산구의 비율을 조사한 결 과, 정상군에서 6.8%, 대조군은 12.2%, 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 11.8%, 실험군Ⅱ (1 g/㎏)에서 7.9%로 농도 의존적으로 호산구의 비율이 감소하였 다(Fig. 3).

3. 기관지 천식 유발시 비장의 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 변화에 미치는 영향

기관지 천식은 T세포가 중요한 역할을 한다. 특히 T세포가 결핍된 마우스는 OVA로 유도한 기관지

CCR3

CD23

A B

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104 100

101 102

103 104 100

101 102

103 104

2.5 8

4.3 2.8

C D

CCR3

CD23

A B

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104 100

101 102

103 104 100

101 102

103 104 100

101 102

103 104 100

101 102

103 104

2.5 8

4.3 2.8

C D

Fig. 2. PP reduced the population of eosinophiles from lung in OVA-induced airway hyper-reactivity.

Lungs were removed 24 hrs after last aerosol challenge and analyzed by flow cytometry. A: non treated grouup, B: OVA-induced airway hyper- reactivity group, C: OVA-induced airway hyper- reactivity group plus PP (100 ㎎/㎏), D: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (1 g/㎏).

CD23 CCR3

A B

100 101

102 103

104

7.9 D

100 101

102 103

104

C 6.8

100 101

102 103

104

11.8

100 101

102 103

104

12.2

CD23 CCR3

A B

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

7.9 D

100 101

102 103

104

C 6.8

100 101

102 103

104

11.8

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

12.2

Fig. 3. PP reduced the population of eosinophiles from spleen in OVA-induced airway hyper-reactivity.

spleens were removed 24 hrs after last aerosol challenge and analyzed by flow cytometry. A: non treated grouup, B: OVA-induced airway hyper-reactivity group, C: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (100 ㎎/㎏), D: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (1 g/㎏).

천식에 저항성을 나타낸다. PP가 T 세포의 유입을 억제하는가를 비장에서 적출한 T 세포를 유세포분 석기를 이용하여 조사하였다(Fig. 4).

비장에서 각 군의 CD4⁺ T 세포의 비율을 조사한 결과, 정상군에서 15.0%, 대조군은 16.7%, 실험군

Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 14.7%, 실험군Ⅱ (1 g/㎏)에서 9.4%로 농도 의존적으로 CD4⁺ T 세포의 비율이 감 소하였다.

반면 각 군의 CD8⁺ T 세포의 비율을 조사한 결 과, 정상군에서 6.5%, 대조군은 7.3%, 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 6.0%, 실험군Ⅱ (1 g/㎏)에서 5.0%

로 유의한 차이를 보이지 않았다.

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

CD4

CD8 C D

15 6.5

16.7 7.3

14.7 6

9.4 5

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

CD4

CD8 C D

15 6.5

16.7 7.3

14.7 6

9.4 5

Fig. 4. PP reduced the population of CD4⁺ T cells from spleen in OVA-induced airway hyper-reactivity.

spleens were removed 24 hrs after last aerosol challenge and analyzed by flow cytometry. A: non treated grouup, B: OVA-induced airway hyper- reactivity group, C: OVA-induced airway hyper- reactivity group plus PP (100 ㎎/㎏), D: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (1 g/㎏).

4. 기관지 천식 유발시 비장의 CD4⁺, CD8⁺ T cell 활성도 변화에 미치는 영향

Propolis가 비장의 CD4⁺ T 세포 비율을 농도 의 존적으로 감소시키는 반면, CD8⁺ T 세포 비율엔 영 향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 본 실험에서는

Propolis가 CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포의 활성도 에 미치는 영향을 조사하였다. 비장에서 적출한 조 직액을 유세포분석기를 이용하여 T 세포의 활성에 관여하는 CD25, CD69, CD44, CD62L 발현정도의 변화를 분석하였다.

CD4⁺ T 세포에서 초기 활성화 지표인 CD25의 발현정도를 조사한 결과, 정상군에서 8.7%, 대조군 은 14.0%, 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 14.5%, 실험 군Ⅱ (1 g/㎏)에서 18.6%로 농도 의존적으로 CD25 의 발현이 증가하였다. 즉, PP가 CD4⁺ T 세포를 활성화 시킨다는 것을 의미한다. 또 다른 초기 활성 화 지표인 CD69의 발현을 조사한 결과, CD25 발현 과 일치하게 PP 농도 의존적으로 증가하였다. 기억 및 활성화 지표인 CD44 발현도 역시 CD4+ T 세포 에 PP 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 5).

CD25

A B C D

100101 102103104100101 102 103104100 101 102103104100101102103104

100101102 103104

100 101102 103104

100 101 102103104

100101 102103104

100101102 103104

100101102 103104

100 101102103104

100101 102103104

100 101102103104

100 101102103104

100 101102103104

CD69

CD44

CD62L

8.7 14 14.5 18.6

14.7

12.1

13.6

20

21

19.2

14.1

22

16

22.6

22

16

100101102103104

21

CD25

A B C D

100101 102103104

100101 102103104101000101011 101022 101033101044101000 101011 101022101033101044101000101011101022101033101044

100101102 103104 100101102 103104

100 101102 103104 100 101102 103104

100 101 102103104 100 101 102103104

100101 102103104 100101 102103104

100101102 103104 100101102 103104

100101102 103104 100101102 103104

100 101102103104 100 101102103104

100101 102103104 100101 102103104

100 101102103104 100 101102103104

100 101102103104 100 101102103104

100 101102103104 100 101102103104

CD69

CD44

CD62L

8.7 14 14.5 18.6

14.7

12.1

13.6

20

21

19.2

14.1

22

16

22.6

22

16

100101102103104 100101102103104

21

Fig. 5. PP activated CD4⁺ T cells from spleen in OVA-induced airway hyper-reactivity.

spleens were removed 24 hrs after last aerosol challenge and analyzed by flow cytometry. A: non treated grouup, B: OVA-induced airway hyper- reactivity group, C: OVA-induced airway hyper- reactivity group plus PP (100 ㎎/㎏), D: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (1 g/㎏).

CD8⁺ T 세포에서 CD25의 발현정도를 조사한 결 과, 정상군에서 0.8%, 대조군은 0.6%, 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 0.5%, 실험군Ⅱ (1 g/㎏)에서 1.3%

로 유의한 차이를 보이지 않았다. CD44와 미성숙 T 세포의 활성지표인 CD62L도 유의한 차이를 보이 지 않은 반면, CD69의 발현은 정상군에서 4.1%, 대 조군은 6.3 %, 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 7.6%, 실 험군Ⅱ (1 g/㎏)에서 18.8%로 농도 의존적으로 증가 하였다(Fig. 6).

CD62L

100101 10 2103 104 100101 102 103 104100 101 102 1031010 04 101 10210 310 4

A B C D

CD25

CD69

CD44

10 0 101 10210 310 4

100 101

102 103

104

100 10110 2 103104

100 10 1 102103104 100 10110 2 103104

10 0 101102 10 310 4

100 101 102 103 104

100101 10 2 103104

100 101

102 103

104

100 10110 2 103104

10 0 101 10210 310 4

100 101

102 103

104

0.8

4.1

45.1

13.6

0.6

6.3

47.2

12.4

0.5

7.6

49

10.8

1.3

18.8

49

10.8

CD62L

100101 10 2103 104

100101 10 2103 104 100100 101011 101022 101033 101044101000 101011 101022 101033101010 010 044 101101 10210210 310 310 410 4

A B C D

CD25

CD69

CD44

10 0 101 10210 310 4 10 0 101 10210 310 4

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 10110 2 103104 100 10110 2 103104

100 10 1 102103104 100 10 1 102103104 100 10110 2 103104 100 10110 2 103104

10 0 101102 10 310 4 10 0 101102 10 310 4

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

100101 10 2 103104 100101 10 2 103104

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

100 10110 2 103104 100 10110 2 103104

10 0 101 10210 310 4 10 0 101 10210 310 4

100 101

102 103

104 100

101 102

103 104

0.8

4.1

45.1

13.6

0.6

6.3

47.2

12.4

0.5

7.6

49

10.8

1.3

18.8

49

10.8

Fig. 6. PP did not activate CD8⁺ T cells from spleen in OVA-induced airway hyper-reactivity.

spleens were removed 24 hrs after last aerosol challenge and analyzed by flow cytometry. A: non treated grouup, B: OVA-induced airway hyper- reactivity group, C: OVA-induced airway hyper- reactivity group plus PP (100 ㎎/㎏), D: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (1 g/㎏).

5. 기관지 천식 유발시 비장내 세포활성물질의 변화 기관지 천식은 Th2 타입의 자가면역질환으로 IL-4의 생산이 증가되어 있다. 따라서 저자는 T 세 포에서 INF-g와 IL-4의 생산을 조사하였다(Fig. 7).

Fig. 7A에서 보는 바와 같이 INF-g는 정상군에 서 855 pg/㎖였고, 대조군에서 270 pg/㎖로 감소하 였으나, 실험군Ⅰ (100 ㎎/㎏)에서 2373 pg/㎖로, 실 험군Ⅱ (1 g/㎏)에서는 4469 pg/㎖로 농도 의존적으 로 증가하는 양상을 보였다.

반면에 IL-4는 정상군에서 161 pg/㎖였고, 대조군 에서 613 pg/㎖로 증가하였으며, 실험군Ⅰ (100 ㎎/

㎏)에서 435 pg/㎖로, 실험군Ⅱ (1 g/㎏)에서는 247 pg/㎖로 농도 의존적으로 감소하는 양상을 보였다 (Fig. 7B).

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

b c d

a

IFN-γproduction ( pg/ml)

CD3 + CD28 A

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

b c d

a

IFN-γproduction ( pg/ml)

CD3 + CD28 A

0 200 400 600 800 1000

b c d

a

IL-4 production ( pg/ml)

CD3 + CD28 B

0 200 400 600 800 1000

b c d

a 0 200 400 600 800 1000

b c d

a

IL-4 production ( pg/ml)

CD3 + CD28 B

Fig. 7. PP increased INF-g production but reduced Il-4 production T cells from spleen in OVA-induced airway inflammation.

(A) INF-g, (B) IL-4 levels in T cells from spleen.

Spleens were removed 24 hrs after last aerosol challenge. INF-g and IL-4 production were measured by ELISA. These results are representive of two independent experiments. Detail methods were described materials and methods. a: non treated grouup, b: OVA-induced airway hyper-reactivity group, c: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (100 ㎎/㎏), d: OVA-induced airway hyper-reactivity group plus PP (1 g/㎏).

Ⅳ. 考 察

알러지성 기관지 천식은 전 세계적으로 인구의 약 10%가 앓고 있는 호흡기의 염증질환으로서 기도내 로 흡입된 항원에 의하여 체내에서 만들어진 항원 특이 항체가 비만세포 및 호염기구에 부착한 후 동 일한 항원의 공격에 의하여 이들 세포들로부터 활성 화가 유도되고, 이들 세포들로부터 활성 매개물질이 유리되어 즉시형 과민반응이 일어나며, 유리된 활성 매개 물질들에 의한 화학주성 때문에 관련된 다수의 염증세포들의 침윤이 일어나는 기도 염증성 과민반 응을 특징으로 하는 질환이다¹⁶⁾. 천식시에는 주로 알러지성 과민반응으로 인해 기관에서는 기관 상피

하 결합조직 부위에 다수의 호산구를 비롯한 염증세 포들이 밀집되어 기도가 폐쇄되며, 상피내에 존재하 는 점액생산세포인 배상세포들의 이상증식이 수반되 는 것으로 알려져 있다¹⁷⁾.

喘息은 한의학의 哮病에 해당하는 질환으로 갑작 스레 반복 발작하는 喘促上氣, 喉中有水鷄聲의 증상 을 특징으로 갖는 질병으로 반드시 喘이 겸하여 발 생하기 때문에 哮喘이라고 한다¹⁸⁾. 哮喘은 隋代 巢

19)의 《巢氏諸病源候論》에서 “上氣鳴息”, “呻嗽”라 고 칭하는데에서 그 유래를 찾아볼수 있으며, 그 병 인을 肺의 장기적인 기능실조로 보았다. 이후 唐代 의 《千金要方》²⁰⁾과 宋代의 《聖濟總錄》²¹⁾등에서 咳와 喘에 대한 논의가 있었으며, 金元代의 朱²⁰⁾에 의해 하나의 독립된 질병으로 설정되어 哮와 喘이 나뉘게 되었다. 明․淸代에 여러 의가에 의해 증상에 따라 더욱 세분화 되었으나, 오늘날에는 哮, 喘의 구 별없이 하나의 증후군으로 인식되고 있다²²⁾. 哮喘의 원인으로는 巢¹⁹⁾는 痰氣上擊이라 하였고, 孫²⁰⁾은 大逆上氣라 하였으며, 朱²³⁾는 痰으로 인하여 발생한다고 하였다. 또한 張²⁴⁾은 夙根이라 하여 그 內的素因이 痰濕한 사람이 過寒과 過勞시 나타난다 고 보았다. 그리고 근래에 정²⁵⁾ 등은 哮喘의 원인을 첫째 冷한 음료나 혹은 鹹, 酸, 甘味를 지나치게 嗜 食하게 되면 積痰蘊熱하여 발생하게 되고, 둘째 外 感病邪를 초기에 表散시키지 못하여 餘邪가 肺絡에 잠복해 있다가 다시 外邪가 침범하면 발병하게 되 며, 셋째 內在된 素因을 가지고 있는 사람이 寒冷, 疲勞 등 어떤 誘因을 만나서 발생하게 되고, 넷째 특정의 냄새에 대한 과민반응으로 발생되며, 다섯째 장기적인 원인으로 肺, 腎의 呼吸機能 低下로 발생 하게 된다고 정리하였다.

哮喘의 치료는 朱²³⁾의 補陰, 降心火, 降痰下氣의 치법과 王²⁶⁾의 《證治準繩》에서 外邪와 攝生에 대 한 주의 그리고 張²⁴⁾의 虛實판별에 의한 扶正氣, 攻 邪氣의 治法을 기본으로 하였다. 최근에는 小靑龍湯

7), 定喘化痰降氣湯⁸⁾, 麥門冬湯⁹⁾, 瀉白散²⁷⁾, 神秘湯

28), 定喘湯²⁹⁾과 淸上補下湯³⁰⁾등이 천식에 효과가 있 다는 연구보고가 있었고, 임상에서 활용되고 있다.

Propolis에 대한 기존의 연구로는 박 등¹⁴⁾은 ‘국 산 Propolis의 항균 살균효과에 대한 연구’에서 propolis가 Escherichia coli 등 5개 균에 항균작용 이 있음을 보고하였고, 송⁵⁾은 ‘Propolis의 생리활성 기능’에서 현재까지 발표된 연구결과를 정리하여 Propolis가 항산화 활성, 항균 활성, 국부마취 효과, 세포성장 촉진 작용 및 항염 효과, 항암 작용, 항바 이러스 효과 및 면역증강 효과, 항궤양 효과가 있다 고 보고하였고, Leticia 등¹⁵⁾의 ‘Propolis extracts exhibit an immunoregulatory activity in an OVA-sensitized airway inflammatory animal model’에서 Propolis extract의 경구투여가 기도저 항에서는 Penh값을 감소시키고, 폐조직에서의 염증 상태를 개선시키며, BALF내 cytokine양을 감소시 킨다고 보고하였다.

이상에서 보면 Propolis가 천식 병태 동물의 기관 및 폐의 조직학적 변화나 BALF내 세포활성물질, 기 도저항, 염증세포에 미치는 영향에 대한 단편적인 연구는 있으나, Propolis가 폐와 비장내의 호산구 비율, 비장내의 CD4⁺, CD8⁺ T cell의 분포변화와 특징, 비장내의 세포활성물질에 미치는 영향에 대해 전반적으로 연구한 보고는 없어 저자는 본 연구를 시행하였다.

기관지 과민 반응은 폐의 조직학적 검사에서 기관 지의 수축과 함께 염증세포의 침착을 수반하게 되는 데, Fig. 1A에서 보는 바와 같이 정상 군에서는 기 도가 선명하게 보이고, 염증세포의 침작은 보이지 않고 있다. 그러나 대조군에서는 기도의 협착과 기 도 벽의 두께가 증가하였으며, 염증세포의 침착이 현저하게 증가되었다(Fig. 1B). 실험 군에서는 농도 의존적으로 기관지 협착이 감소하였다. 또한 염증세 포의 침작도 OVA로 면역한 대조군과 비교할 때 감 소하였다(Fig. 1C, 1D).

알러지성 기관지 천식 반응에서 호산구 과다증은

마우스의 알러지 모델에서 나타나는 두드러진 특징 으로 알려져 있다. 따라서 PP를 처리한 실험군에서 호산구의 분포를 조사한 결과, 대조군에 비해 실험 군에서 농도 의존적으로 호산구의 비율이 감소됨을 알 수 있었다(Fig. 2, 3). 이는 PP가 호산구의 활성 화 및 증식을 억제해서 기관지 및 폐의 호산구 수를 감소시켰을 가능성이 있고, cytokine에 의한 신호전 달을 억제해서 호산구의 증식 및 활성화를 억제하였 을 가능성도 배제할 수 없다.

기관지 천식은 Th2 타입의 자가면역성 질환으로 CD4⁺, CD8⁺ T 세포의 변화와 관련이 있다. PP의 투여가 Spleen내 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 분포변화와 활성도를 조사한 결과, PP는 CD4⁺ T 세포의 비율 을 감소시킨 반면 CD4⁺ T 세포의 활성화에 관계있 는 CD25, CD69, CD44의 발현을 증가시켰다(Fig.

4, 5, 6). 이는 PP가 CD4⁺ T 세포의 활성을 증가시 킨 것을 의미한다.

IL-4는 알러지성 천식에서 특히 과다하게 분비되 는 cytokine으로 알려져 있다. PP의 투여로 인한 Spleen total T 세포내 cytokine의 양적 변화를 조 사한 결과, IL-4는 대조군과 비교할 때 실험군에서 농도 의존적으로 감소하는 양상을 보였다(Fig. 7B).

또한 CD4⁺ T 세포를 Th2 세포로 분화되는것을 억 제하는 것으로 알려진 INF-g는 실험군에서 농도 의 존적으로 증가하였다(Fig. 7A). 이는 PP를 투여한 실험군에서 INF-g의 생산을 증가시키나 IL-4의 생 산을 억제하여 기관지 천식을 억제하였음을 의미한 다.

이상의 결과, PP는 기관지 협착을 감소시키고 염 증세포의 침작을 감소시켜 기관지의 과민 반응을 감 소시키고 호산구 증식을 억제하고 CD4⁺ T 세포 분 화를 촉진하고 IL-4의 생산을 억제함으로써 천식억 제에 유효한 것으로 사료되어 알러지성 천식에 치료 보조제로 가능성이 있을 것으로 사료된다. 향후 약 물 독성 평가(in vivo) 등의 안정성에 관한 연구가 필요하리라 사료된다.

Ⅴ. 結 論

PP가 마우스의 알러지성 기관지 천식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 마우스에 알러지성 기관지 천식을 유발하고 PP를 투여한 후 폐조직의 상태를 관찰하고, Lung과 Spleen내의 호산구의 변화를 조 사하였으며, Spleen내 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 분포 변 화와 활성도를 조사하고, Spleen내 total T 세포에 서 cytokine 생산 변화를 관찰하여 다음과 같은 결 론을 얻었다.

1. PP는 폐조직에서 기도협착과 염증세포의 침윤을 억제하였다.

2. PP는 폐와 비장내 호산구 비율을 감소시켰다.

3. PP는 비장내 CD4⁺ T 세포의 비율을 감소시킨 반면 그 활성도는 증가시켰다.

4. PP는 비장내 total T 세포에서 INF-g의 생산은 증가시키고, IL-4의 생산은 감소시켰다.

이상의 결과로 보아 PP는 마우스에 유발된 알러 지성 기관지 천식을 억제시키는 효과가 있었다.

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