총 설
HCI 프로그램을 이용한 HPLC의 최적화 조건
김춘화·이주원·노경호† 인하대학교화학공학과
402-751 인천광역시남구용현동 253
인하대학교초정밀생물분리기술연구센터
402-751 인천광역시남구 용현동 253 (2006년 6월 30일접수, 2006년 8월 30일채택)
Optimum Condition of HPLC by HCI Program
Chun Hua Jin, Ju Weon Lee and Kyung Ho Row†
Center for Advanced Bioseparation Technology and
Department of Chemical Engineering
,Inha University
,253
,Yonghyun-dong
,Nam-gu
,Incheon
402-751,Korea
(Received 30 June 2006; accepted 30 August 2006)요 약
최근액체크로마토그래피는의학상이나천연물질분리에많이사용되고있다. 특히혼합물에서유용성분을분취하 기위해서는우선분석용크로마토그래피의조업조건이결정되어야한다. 때문에정확한수학적모델링과시뮬레이션 은크로마토그래피의발전과디자인과정에서필요한부분이다. 인하대학교고순도분리연구실에서는크로마토그래피
의최적화를목적으로 HCI 프로그램을개발하였다. 이과정에서최소한의실험으로보다정확하고빠른최적조업조
건을 HCI 프로그램을이용하여구할수있다. 즉이론단수를이용하여체류인자를예측하는세가지모델식으로부터
용출곡선을계산할수있으며분리도와분리시간을기준으로최적이동상의조건을계산할수있다.
Abstract −Recently, liquid chromatography (LC) has been used more frequently to separate drugs and natural sub- stances. Especially, to selection of the solutes from the products, the operation condition of analytical chromatography should be necessarily determined. So accurate computer modeling and simulation of chromatographic performances has become a necessary part of the development and design of processes. High-Purity Separation Lab. Inha University developed the resulting HCI software for the purpose of the optimization of chromatographic performances. The HCI program was utilized to find the optimum operating condition more accurately and rapidly, reducing the number of many possible experiments. The elution profiles were calculated by the plate theory based on the three retention mech- anism of capacity factor.
Key words:Plate Theory, Retention Mechanism, Capacity Factor, HCI Program
1. 서 론
최근에건강식품에대한사람들의날로늘어나는욕구와수요를 만족하기위하여천연물에포함된유용성분을분석하거나정제하 는방법으로크로마토그래피를많이사용한다. 물질의휘발성, 분자 량등많은요인이있기때문에물질의분리및분석에는주로액 체크로마토그래피가사용되며그중에서도고성능액체크로마토
그래피(HPLC)가널리사용되고있다. 따라서분리기술뿐만아니라
생산을위한제조용공정에도많이사용되고있다[1]. 분리능력이
우수하고작은양의시료로도정밀한정성, 정량분석을할수있어 서대표적인분석기기로사용될뿐만아니라, 초고순도제품을생
산하기위한공정까지상용화가활발하게진행되고있다. 크로마토 그래피는예전부터석유, 정밀화학에서, 최근생명공학에이르기까 지가장우수한분리기술로이용되고있다[2-5]. 분석용및분취용 고성능액체크로마토그래피(preparative HPLC)의사용이급증함 에따라생산성을극대화시킬목적으로인하대학교화학공학과고 순도분리연구실에서는 HCI 프로그램을개발하였다[6]. 이프로그 램은크로마토그래피분리의수학적인도구로서제안되어지고만 들어진소프트웨어이다. 특정고부가가치물질을정제하여고순도
로얻기위한 preparative HPLC의이용은의학산업을위한생물
학적인분리연구에그사용이증가하고있으며이를위한많은실 험이요구된다. 분석및분리조건을신속하고경제적으로최적화하 기위하여개발된이프로그램은최소한의실험데이터를이용하 여분석조건의최적화에서부터제조용공정의기본설계및경제
†To whom correspondence should be addressed.
E-mail: [email protected]
성분석에이르기까지초보자도일반 PC에서쉽게사용할수있도 록고안되었다. 일반적으로, 액체크로마토그래피는역상과정상방 법으로사용되며이동상에는일정한조성을갖는일정용매조성법 과시간에따라이동상의조성을변화시키는구배용매조성법이있 다. 이프로그램의특징은정상, 역상칼럼에서사용이가능하고일 정용매조성법과구배용매조성법에사용이가능하며이동상의조성 과물질의체류인자와의상관관계를이용하여물질의체류시간을 예측할수있으며, 주어진이동상조성에서단이론을이용한시료 의용출곡선과최적의분리조건을얻을수있다[7-15]. 계산된결과 를모니터와 PC에보여줄수있으며텍스트파일로변환이쉽다.
즉최소한실험으로분리하고자하는물질의용출곡선을예측하고 최적분리조건을계산할수있는소프트웨어의개발을통하여보 다정확하고최적화된분석및분리조건을결정할수있다.
2. HCI 프로그램 개요
본프로그램은시료의양이적은분석용(analytical) HPLC에대 하여역상및정상방법에모두적용할수있고이동상의조성을 일정하게유지하는일정용매조성법(isocratic mode)과이동상의조 성을시간에따라변화시키는구배용매조성법(gradient mode)에서 이동상의조성과물질의체류인자의상관관계를이용하여물질의 체류시간을예측할수있다[16-23]. 또한 plate theory를이용하여 임의의조업조건에서용출곡선을예측할수있으며이동상의조성 과 operating mode(isocratic and gradient mode)에대하여최적화 를수행하여분리도와분리시간이고려된최적조업조건을계산할 수있다[24-26].
2-1. Plate Theory
Plate theory는크로마토그래피용 column은 column의길이를이
론단수로나눈단을가지고있는 plate column과수학적으로동일
하다는이론으로, 이동상이단과단을연속적으로통과할때각단 내에서흡착평형상태에있으며(local equilibrium), 각단에서의이 동상의부피(vm)와고정상의부피(vs)는일정하다. 이러한가정에서 각단과단사이의물질수지식으로부터다음과같은결과식을얻 을수있다.
(1) cN은 N단에서물질의농도이고 c0는주입한물질의농도이며, r은 주입된물질이차지하게되는단의수이다. a는평형상수를포함하 는상수로다음과같다.
(2)
을고정상의부피에대한이동상의부피의비율로나타내면평형 상수와체류인자는다음과같은관계를가진다.
(3)
체류인자로부터계산된평형상수와이론단수를 plate theory식에대 입하여크로마토그래피 column 출구에서물질의용출곡선을예측
할수있다. 2-2. 체류인자
이동상내의유기용매의조성과체류인자와의상관관계는그동 안많은연구가이루어졌다. 다음의세가지관계식이가장많이사 용되는체류인자와유기용매의조성과의관계식이다.
(4) (5) (6) kw는이동상이순수한물일때에물질의체류인자이다. F는이동상 내에포함된유기용매의부피비율이다. (4)-(6)식은역상크로마토 그래피에서이동상이물과단일유기용매의이성분계로이루어져 있을때에만사용할수있다.
2-3. Gradient elution
구배용매조성법에서물질의체류시간을예측하기위해서는
column 내에서의물질의이동은일정한이동상의조성하에서는일
정한속도를가지고이동한다고가정한다. Fig. 1에서와같이 Y축
은 column의길이로서물질이이동하는구간을나타내며, X축은
column을통과하여지나가는이동상의부피를나타낸다[27]. 일정
한유속에서는이동상의부피를시간으로나타낼수있다. 구배용 매조성법에서체류인자를계산하기위해서다음과같은가장을하
였다. (1) column을지나가는물질은고정상과평형상태를유지하
면이동한다. (2) 각각다른조성의이동상은 column 내에서서로
섞이지않고이동한다. (3) 이동상의조성이변하면서나중이동상
은 column 내에평형을유지하며이동한다. 계단함수형구배용매
조성법(step-wise gradient mode)에서는물질이일정한조성의이동
상에서 column을통과할때에물질의이동은직선으로나타낸다.
즉, 첫번째이동상의조성에서는 Y1, 두번째이동상의조성에서는
Y2이다(Fig. 1)[27]. 구배용매조성법에서의물질의체류부피(VRg)는
cN c0 (aV)r
---i!
i N r= – n–1
∑ e–aV
=
a 1
vm–Kvs
---
=
K = βk v= ---kvms
logk logk= w–SF k A BF----= –
logk = L MF NF+ + 2
Fig. 1. Solute migration in step-wise gradient mode.
다음과같이계산할수있다.
(7) Vm은 column의 dead volume이고, k1과 k2는각각첫번째이동 상과두번째이동상에서의물질의체류인자이며, Vg,1은첫번째
이동상이 column에들어간부피이다. (7)식을이용하여선형구배
용매조성법에서의물질의체류부피를계산할수있다.
3. HCI 프로그램의 응용
HCI 프로그램의상용화를위하여인하대학교고순도분리연구실 에서는 Deoxyribonucleosides[27, 28], Phospholipids[29], Aromatic Compounds[30], Peptides[31], Isoflavones[32], Catechine[33], Purine
compounds[34] 등부동한종류의물질들의분리에본프로그램을
적용하였다.
3-1. Deoxyribonucleosides 분리
분석시간등을기준으로일정용매조성법에서는많은제한성이존 재하기에물질분석에서구배용매조성법을많이사용하고있다. 일 정용매조성법에서는각물질의용량인자와이동상에서유기용매의 조성의관계는 Snyder식으로주로표시된다[1, 3]. 그러나구배용매 조성법에서는시간에따라이동상의조성이변하기때문에용량인 자도변하게된다. 그러므로구배용매조성법에서물질의용량인자 를예측하기위해서는용량인자를시간에따른함수로표시하는새
로운모델식을결정해야한다[16, 18]. 이를위하여역상액체크로
마토그래피를이용하여 다섯가지 데옥시리보뉴클레오사이드
2-deoxycytidine(dCyd), 2-deoxyuridine(dUrd), 2-deoxyguanosine (dGuo), thymidine(dThd), 2-deoxyadenosine(dAdo)를분리하기위 한최적의이동상조건을계산에의해서구한후이의유용성을실
험 data와비교하였다. 이다섯가지물질들을분리하기위하여물
/아세토나이트릴, 물/메탄올이성분계이동상을사용하였으며각물 질의용량인자를이성분계의이동상의조성의함수로나타내기위 해서각각메탄올과아세토나이트릴의유기용매에대해서 (4)-(6)식 과회귀식을계산하였다. 사용한용량인자의모델식에따라서각 물질간의분리도의차이가있다. 그러나유기용매의양이적게첨 가되는이동상의경우의역상액체크로마토그래피에서는 (5), (6)
식이 snyder의 (4)식보다더잘일치하였고[9], (4)식의상관계수
가 (5), (6)식보다좋지않았고계산된농도분포곡선은실험값과
차이가있게된다. 때문에단이론에서는선형평형흡착식을가정 하여비교적주입양이작은경우에잘일치하지만용량인자는이 동상의조성에의하여크게변하기때문에정확한함수관계를제 시하여야이동상의조성에대한최적화가가능하며 (6)식은이러한 목적에부합된다. 따라서유기용매인메탄올의조성과구배용매조 성법에서의구배시간에대해서최적화한결과는첫번째이동상의 조성은순수한물을사용하고구배시간이 7분후에두번째이동 상의조성은 19％메탄올이포함되고계단함수로변하게하는것
이다. 이경우 Fig. 2에서보여주다시피계산과실험에의한용출곡
선이잘맞음을확인할수있었다[28]. 물질을분리하기위한최적
이동상의조성과구배시간을실험적으로구하기위해서는많은실 험을시행오차적으로수행해야되지만이동상의조성에따른체
류인자를 (6)식에의한이동상조성의함수로나타내고계단함수인 경우단이론에의하여용출곡선을예측할수있다. 즉실험횟수를 크게줄일수있기때문에신속히최적분리조건을얻을수있었다.
3-2. Phospholipids 분리
분석조건의최적화는분리도와분석시간을사용자가정한범위
내에서 HCI 프로그램이반복적으로계산하여최적화된결과를얻
게된다. 인지질은세포막을구성하는물질로생체세포내에서물 질의전달에관여하기때문에생의학, 약학등의분야에서중요하 게 연구가 진행되고, 그 중 유용 성분으로 대두되는 것이
phosphatidylethanolamine(PE), phosphatidylinositol(PI), phosphatidy
lcholine(PC)으로이물질들은대두에많이존재하며식물성기름
의제조에서부산물로쉽게얻을수있다. 이세가지인지질을분 리하기위하여정상액체크로마토그래피를사용하였다. 이동상으로 는핵산(hexane), 이소프로페놀(isopropanol), 메탄올(methanol) 삼 성분계를사용하였고, 이동상의극성을변화시키기위해서극성이 큰메탄올의양을변화시켰으며핵산과메탄올이서로극성차이 가크기때문에이소프로페놀을첨가하여균일한조성을갖는삼 성분계이동상을사용하였다. 일정용매조성법에서분리한인지질
인 PE, PI, PC의극성은각각큰차이를보이고있기때문에이들
을분리하기위해서는구배용매조성용출법을이용하였다. 일정용 매조성용출법과구배용매조성용출법의 실험 data를이용하여식
logk = A + BF+ CF2+ DG +EG2에서쓰이는상수 A, B, C, D, E를
PE, PI, PC에대하여구하였고단이론으로부터용출곡선을계산
하였다. 우선계산에 의한 일정용매조성법(hexane/isopropanol/
methanol = 90/5/5vol％)으로 Nneutral lipids(PI와 PC)와 PE를분리 하고 PI와 PC를분리하기위해서는 10분의구배시간과두번째이 동상을 hexane/isopropanol/methanol = 50/20/30(vol％)으로계단함 수의구배용매조성법을사용하는것이다. 계산된최적분리조건을 실험데이터와비교한결과잘일치하였고이제시된방법은구배 용매조성법에서최적분리조건을구하는데이용될수있었다.
3-3. Aromatic Compounds 분리
일곱 가지의방향족화합물 benzene(BZ), chlorobenzene(CB), toluene(TO), styrene(ST), o-dichlorobenzene(o-DCB), p-dichlorobenzene VRg=Vm(1 k+ 2) Vg,1 k1–k2
k1
---
⎝ ⎠
⎛ ⎞
+
Fig. 2. Separation of deoxyribonucleosides by RP-HPLC(solid line:
calculated, dotted line: experimental).
(p-DCB), and m-xylene(m-XY)을역상액체크로마토그래피로물에 에탄올과이세토나이트릴을각각첨가하는이성분계이동상을사 용하여최소한의실험으로부동한이동상에서의최적조건을 HCI
프로그램을통하여계산하였다. 체류모델식(5)을이용하여매개변 수와상관계수를계산한결과두가지이동상에서각물질에대한 상관계수는 1에접근하였으며체류인자 k에대해서실험값과계산
값을비교하여보았다. Fig. 3에서보여주다시피계산값과실험값
이잘맞음을확인할수가있었다[30]. 따라서 HCI 프로그램으로
두가지이동상에서최적분석조건을찾았고실험에적용하여계
산된용출곡선과비교를하였으며, HCI 프로그램은이동상이시
간에따라변하는구배용매조성법의용출곡선도잘예측하고있음 을알수있었다.
3-4. peptide분리
분석기기용으로널리이용되는크로마토그래피가생명공학에 의한제품들에대한분리, 정제의방법으로서연구및산업화가급 속히진행중이다. 따라서연구자들은실제수요에만족시키기위한 목적으로생화학상중요한 4가지펩타이드(peptide) Angiotensin II
(Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe), [Val4]-Angiotensin III(Arg-Val- Try-Val-His-Pro-Phe), Bradykinin(Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg), [d-Ala2]-Leucine encephalin(Tyr-d-Ala-Gly-Phe-Leu)을역상액체크 로마토그래피로분리하는실험을하였다. 본실험에서는이동상으 로물과아세토나이트릴에각각 0.1％의 trifluoroacetic acid(TFA)
완충액을첨가하여사용하였다. 용출곡선은이론단수와일차선형 식 lnk = A + BF, 이차방정식 lnk = A + BF+ CF2를기초로하여각각 계산하였다. Table 1에서는두가지방정식을이용하여계산한실 험상수와상관계수를보여주고있고, 이차방정식의상관계수가선 형식의상관계수보다 1에더접근함을알수있으며, 따라서이차 방정식이체류인자를더잘예측할수있다는것을알수있었다
[31]. 두가지부동한체류모델식에대하여각각일정용매조성법과
구배용매조성법에서의최적조건을계산하였고실험에적용시켜그 맞음정도를확인하였다. 결과완충액을사용한이동상조건에서도 실험데이터와계산데이터가잘맞는다는것을확인할수있었다.
3-5. Isoflavones 분리
이뿐만아니라 8가지의이소플라본(isoflavones) daidzin, glycitin, Fig. 3. Comparison of the cakulated and experimental retention factors under isocratic elution(a: ethanol, b: acetonitrile, straight line: y = x).
Table 1. Empirical constants and regression coefficients of peptides by a linear and a quadratic relationship
Material Lnk = A + BF Regession
coefficient Lnk = A + BF + CF2 Regession
coefficient
A B A B C
Angiotensin III 3.974 −0.137 0.9855 5.829 −0.279 0.0025 0.9994
Leucine encephalin 3.840 −0.119 0.9842 5.522 −0.248 0.0023 0.9993
Bradykinin 4.955 −0.164 0.9829 7.342 −0.348 0.0032 0.9987
Angiotensin II 5.091 −0.161 0.9772 7.840 −0.372 0.0037 0.9989
genistin, 6’-o-acetyl daidzin, 6’-o-malonyl genistin, daidzein, glycitein
and genistein도 HCI 프로그램을이용하여일정용매조성법에서최
적분리조건을찾는데성공하였다. 역상액체크로마토그래피로물 과아세토나이트릴에각각 0.1％초산을첨가하는이동상을사용하 였으며이여덟가지물질의분리도와체류시간을기준으로최적 조건을결정하였다. 용출곡선을제일잘예측할수있는체류모델
(6)식 lnk = A + BF + CF2와단이론을이용하여 HCI 프로그램에 의하여최적조건을계산하였다. Fig. 4에서보여주다시피일정용매 조성법에서각각 0.1％초산을첨가한이동상물/아세토나이트릴
85/15(vol％)로하였을때여덟가지물질들이전부분리가되지만
용출시간이매우길었다[32]. 때문에분리시간의단축을위하여비 교적늦게용출되는 6’-o-malonyl genistin, daidzein, glycitein,genistein
네가지물질을같은이동상에서유기용매의함량을 15％에서 27％ 로변화시켜보다빠른시간내에용출될수있게하였다. 일정용매 조성법의제한성을극복하고여덟가지물질을분리도가 1.5이상이 고보다짧은분리시간에용출하기위하여구배용매조성법으로최 적화조건을계산하였다. 즉첫번째이동상의조성은 0.1％초산을
포함한물/아세토나이트릴 88/12을사용하고구배시간이 9분후에 두번째이동상의조성을유기용매함량이 15％로계단함수로변하게 하며, 19분때 27％로계단함수로변하게하며 30분때 65/35(vol％)
로계단함수로변하게한다. Table 2에서보여주다시피위의세가 지부동한이동상조성에서계산된분리도와같은조건에서의실
험에의한분리도는잘맞음을확인할수가있었다[32].
3-6. Catechin 분리
건강과보건품에대한요구가날로증가함에따라우리는녹차 에많은항암성, 항산화작용의물질들이들어있다는것을알았다.
차에 함유되어있는다섯가지 카테킨화합물 Epicatechin(EC),
Gallate(EGCG), Epigallocatechin(EGC), Epicatechin gallate(ECG), Catechin(+C)은십이지장, 피부, 심장등에대하여생리학적작용이 있다. 때문에이유용성분들을녹차에서분리하기위하여이동상 으로물/아세토나이트릴, 물/메탄올에각각초산을첨가하는방법으 로역상액체크로마토그래피를사용하였다. 용출곡선은단이론으 로부터 lnk = Inkw+ SF, lnk = L + MF + NF2, k = A + B/F를이용하 여각각계산하였다. 그중에서용출곡선을제일잘예측하는 2차
방정식 lnk = L + MF + NF2를이용하여일정용매조성법과구배용
Fig. 4. Comparison of the experimental and calculated profiles in isocratic condition(F: 15％).
Fig. 5. Compare the experiment and calculated chromatogram of the catechin compounds in acetonitrile modifier.
Table 2. Comparison of retention times between experimental data and calculated values.
Resolutiona Lnk=A+BF+CF2
Isocratic (case 1)Experimental Calculated Error (％) Isocratic (case 2)Experimental Calculated Error (％) Gradient (case 3)Experimental Calculated Error (％)
Rt1 13.25 13.42 1.3 - - - 23.83 19.64 17.6
Rt2 17.23 16.95 1.6 - - - 26.10 24.74 5.2
Rt3 34.88 34.97 0.2 - - - 29.00 28.11 3.1
Rt4 59.13 61.10 3.3 - - - 30.98 30.19 2.6
Rt5 113.18 113.40 0.2 8.13 8.07 0.7 31.52 31.27 0.8
Rt6 133.17 132.28 0.7 15.53 15.33 1.3 37.53 37.36 0.5
Rt7 178.38 177.92 0.3 16.73 16.70 0.2 38.38 38.01 1.0
Rt8 329.45 329.02 0.1 35.08 34.43 1.9 44.62 45.19 1.3
Case 1: separation of eight isoflavones on isocratic mode.
Case 2: separation of aglycones (daidzein, glycitein, genistein) on isocratic mode.
Case 3: separation of eight isoflavones on gradient mode.
Rt1: daidzin, Rt2: glycitin, Rt3: genistin,Rt4 : 6’-o-acetyl daidzin, Rt5 : 6’-o-malonyl genistin, Rt6 : daidzein, Rt7 : glycitein,Rt8: genistein
매조성법에대해서최적조건을계산하였으며분리도와분리시간을 기준으로두가지부동한이동상조건에서의최적분리조건을계산 한결과구배용매용조성의조건으로이다섯가지물질을분리할 수있었다. 따라서같은조건하에실험을진행하여계산에의한용 출곡선과비교를하였다. 그결과 Fig. 5와 Fig. 6에서보여주다시 피이두부동한이동상에서계산을통한용출곡선과실험을통한 용출곡선이잘맞음을확인할수있었다[33].
3-7. 퓨린유도체분리
물질분석에서기초로사용되고있는것이일정용매조성법이다.
연구자들은세가지체류모델식 Snyder, Langmuir, Binary polynomial
을사용하여가장적합한모델식을결정하고, 단이론(plate theory)을
사용하여 생화학상 여섯 가지 중용한 퓨린 유도체(adenine,
hypoxanthine, purine, theobromine, theophylline, caffeine)를분리 하기위한최적이동상조건과용출곡선을 HCI 프로그램으로계산 하고같은조건에서얻은실험결과와예측한용출곡선이잘일치 하는지를 검증하였다. 체류모델로는 snyder, langmuir, binary polynomial 중에서체류인자를가장장예측한 binary polynomial
를사용하였고분리하기어려운 purine과 adenine의분리도를기준
으로일정용매조성에서최적분리조건은물과메탄올의조성비가
93/7(v/v)일때두물질의분리도가 1.5이상으로나타났었다. 이조 건을실험에적용시켰고실험과계산에의한체류시간은그오차 가 9％이내로나타냄을보여주고 purine과 adenine의분리도가 1.5
이상으로나타내었다(Table 3)[34]. 하지만일정용매조성법은분석 시간이긴등의제한성이존재한다. 퓨린유도체에대해서도일정 용매조성법의제한성을극복하기위하여구배용매조성법을사용하 였다. 분리하기어려운 purine과 adenine의분리도와제일늦게용 출되는카페인의체류시간을기준으로계산한결과이동상의조성 을물/메탄올 93/7(v/v)에서 5분후에 75/25(v/v)로변경하는것이 다. 위의조건에서실험을수행하여계산용출곡선과실험값을비 교하였으며, 두용출곡선이매우잘일치함을알수있었고일정용 매조성법에서의오차보다작은 5％로나타났다(Fig. 7)[34].
4. 결 론
현재는다양한종류의분리기술이개발되어각기고유한특성을 가지고있다. 합성에의한생성물, 생명공학에서파생되는생리활 성물질, 천연물에포함된많은성분은혼합물로구성되어있고이
Fig. 6. Compare the experiment and calculated chromatogram of the catechin compounds in methanol modifier.
Table 3. Comparison of resolution and retention time between experimental data and calculated values
Material Hyp Pur Adn Thb Thp Caf
1)IsocraticI
3)Rscal 6.78 1.60 15.58 13.20 18.74
4)Rsexp 7.53 1.96 20.41 16.47 20.20
5)tR.cal (min) 2.845 4.477 4.960 12.726 24.363 56.354
6)tR.exp (min) 2.933 4.629 5.160 13.676 26.36 61.600
7)Err. of tR (％) 2.97 3.28 3.87 6.94 7.58 8.52
2)Step-gradient II
3)Rscal 6.78 1.60 9.60 8.69 8.80
4)Rsexp 6.61 1.68 10.66 7.22 7.27
5)tR.cal (min) 2.846 4.477 4.960 7.190 8.679 10.619
6)tR.exp (min) 2.790 4.293 4.775 7.074 8.378 10.163
7)Err. oftR (％) 2.00 4.29 3.87 1.64 3.59 4.49
1)Water/methanol = 93/7(v/v), 2)1st mobile phase : water/methanol = 93/7(v/v), gradient time : 5min, 2nd mobile phase : water/methanol = 75/25 (v/v),
3)Calculated resolution, 4)Experimental resolution, 5)Calculated retention time, 6)Experimental retention time,7)Percentage error of retention time
Fig. 7. Compatison of the experiment and calculated chromatogram in step-gradient mode(1st mobile phase : water/methanol = 93/7 (v/v), gradient time : 5 min, 2nd mobile phase : water/
methanol = 75/25 (v/v).
중에서원하는목적물질을고순도로얻기위한기술이절실하게요 구되고있다. 그중에서빠른분석시간과우수한분리도를가진분 석기기로서크로마토그래피가날로각광받고있으나수율에미치 는변수가서로복잡하게연관되어있기때문에조업조건의최적 화는많은경험과실험이요구된다. 또한많은상관된실험변수들 이있고분리하고자하는물질의종류가다양하기때문에수학적
모델을적용하여시료가관내에서거동(behavior)을예측하는것이
쉽지않다. 이러한문제점을해결하기위해서인하대학교고순도분 리연구실에서개발된 HCI 프로그램은최소한의실험으로분리하 고자하는물질의최적분리조건을예측할수있음으로시간상단 축과에네지절약등등면에서유리하다. 따라서 LC에만국한된것 이아니라 GC, SFC(supercritical fluid chromatography) 뿐만아니 라연속식시스템인 SMB(simulated moving bed)까지확장될예정 이다.
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