1. 서 론
진단 또는 치료를 위하여 체내에 삽입하여 사용하 는 의료기의 제작에 이용되고 있는 재료는 일반적으 로 금속이나 세라믹 또는 합성고분자가 대부분이다.
그러나 이들재료는 체내에 삽입되어 주위조직과 접 촉할 때 비록 이물반응을 일으키지 않는다고 하더라 도 그 자체가 생명력을 가지고 있지 못하기 때문에 엄밀한 의미에서 영원히 이물일 수밖에 없다.
천연조직을 생체재료로서 이용하는 방법의 대표적 인 것은 동종이식( a l l o g r a f t )이지만 천연조직 자체 를 처리하여 직접 사용하거나 필요한 조직성분을 추 출하여 이용하는 것은 비교적 최근의 일로써 분자생 물학, 단백질공학등의 발달에 의해 가능하게 되었다.
인체의 구조를 형성하고 생명기능을 유지하는 물 질은 대부분의 경우 생물학적으로 생성된 고분자형 태로 존재한다. 다당류나 단백질은 그 대표적인 존 재로써, 이들을 의료용생체재료로 이용하려는 가장 큰 이유는 생체내에 존재하는 물질이기 때문에 인공
조직재생공학의 이해
연세대학교 의과대학 의학공학교실
서서활
Comprehension for Tissue Regenerative Engineering
Hwal SUH, D.D.S., Ph.D.
Department of Medical Engineering, Yonsei University College of Medicine
The concepts of biomaterials are rapidly changing in recent. Clinical practitioners require replacement of a damaged tissue by viable or at least tissue regenerative materials in stead of the conventional non-vital materials.
Recent advances in bimolecular biology has provided highly applicable informations about the tissue structure, components, biomechanisms, and even technologies of the DNA modifications.
And these are absolutely necessary tools for us, the biomaterials scientists and engineers, to develop materials closer to the natural tissues.
This is to introduce the various methods under studies related to the vitally functional materials development by reassembling or mimicking the natural tissues in these days.
Key Words : Tissue, Cell, Extracellular Matrix, Cryopreservation, Hybridization
* Address for Correspondence : Hwal SUH, D.D.S., Ph.D.
Department of Medical Engineering, Yonsei University College of Medicine
#134 Shinchon-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea
Tel : 82-2-361-5406, Fax : 82-2-363-9923, E-mail : [email protected]
적으로 이들을 사용할 때에 면역에 의한 거부반응만 없다면 가장 천연상태에 가까운 형태를 부여하는 것 은 물론, 생활기능( v i a b i l i t y )까지 갖춘 생체조직을 만들어낼 수 있다고 기대할 수 있기 때문이다. 즉, 천연조직을 생체재료로 사용하여 무기물이나 합성고 분자등에는 결여되어있는 생물학적기능을 제공하므 로서 인체내에 삽입된 생체재료와 주위조직사이에 생체적합성을 지니도록 환경을 제공하거나, 더 나아 가서 천연조직과 같은 생조직(living tissue)의 역 할을 할수 있도록 만드는 것을 목적으로 한다.
2. 천연조직의 이용
생체재료로 사용하기위해 자연상태의 생체조직을 화학적, 공학적인 방법을 이용하여 생물학적기능을 유지하도록 처리, 가공하는 방법에는 1) 천연고분자 상태인 세포외기질을 인공적으로 처리하는 방법과 2) 필요로하는 조직의 세포를 획득하여 인공적으로 배양하는 방법, 3) 어떤 장기 전체를 처리하여 보존 하였다가 이식에 이용하는 방법이 있고, 이외에 무 기질재료나 합성고분자등과 같은 무생물재료에 생물 학적인 기능을 부여하기 위해 천연재료를 복합화 ( h y b r i d i z a t i o n )하는 방법등 으로 나누어 볼 수 있다. (표 1 )
3. 천연고분자 재료
생체재료로써 이용되는 천연고분자의 대표적인 것 은 세 포 외 기 질 과 단 백 질 이 며 특히 교원질 (Collagen), 섬유결합소(Fibronectin), 비트로넥
틴( V i t r o n e c t i n )등이 대표적이다. 예를 들어 교원 질이나 섬유결합소에는 세포접착을 유도하는 아르기 닌(Arginine:R) - 글리신(Glycine:G) - 아스파 르트 산(Aspartic acid:D)으로 구성된 펩티드서열 이 포함되어 있어, 생체재료의 표면에 RGD 펩티드 를 인공적으로 배열하면 재료표면과 세포의 접착을 유도하는 환경을 제공하므로 주위세포와의 결합으로 천연조직의 기능을 모사할 수 있다.
그 중에서도 단백질을 재료로 응용하는 측면에서 고려할 때 교원섬유는 매우 중요한 생물소재중의 하 나라고 볼 수 있다. 생체내의 거의 모든 조직에 분 포하는 교원질은 세포의 지지, 증식을 위한 구조체 로써 세포로 결합하여 장기와 조직을 형성함으로써 생체를 구축하는데 필수 불가결의 단백질이기 때문 에 만일 교원질이 없다면 다세포동물은 존재할 수가 없다. 따라서 생체에 손상이 발생하면 그 본래의 조 직으로 재생시키는 것이 최선의 방법이라고 볼 때, 손상부위의 조직의 세포외기질이 공급될 경우 그 조 직세포가 재생력을 갖게될 것이므로, 교원질을 인공 조직으로 응용한다는 것은 매우 합리적이라고 할 수 있다.
교원질을 의료용 생체재료로 이용하는 방법에는 첫째, 원료조직으로부터 추출, 정제, 가공하여 응용 하는 것과, 둘째 생체가 가진 교원조직을 파괴하지 않고 가공처리하여 사용하는 방법으로 나누어 볼 수 있다. 첫번째의 경우로 상품화되어 있는 것은 지혈 제, 피부창상피복재, 피하주사용교원질제재, 각막용 투명반창고등이 있다.
지혈제의 경우, 1974년에 우피(calf skin)로부 터 추출한 교원섬유를 분말로 만든 아비텐( A v i t e n ) 생체재료 인공재료
복합화 재료 천연재료
무기재료
유기재료
금속 재료 세라믹 재료 합성고분자 재료
천연고분자 재료 인공배양 세포 인공보존 조직 Table 1.의료용 생체재료의 분류
이라는 상품이 처음 선을 보인후, 인대로부터 추출 한 교원질을 스폰지형태로 만든 것등 교원질의 혈소 판응집반응에 의한 혈전형성 및 혈액응고 성질을 이 용한 지혈제가 많이 개발되고 있다.
화상이나 열상, 심한 찰과상등에 의해 표피가 광 범위하게 박탈되었을 때 필요한 창상피복제의 경우 에는 스폰지나 막( s h e e t )형태로 만든 교원질이 주 로 사용된다. 피부 치유에는 표피의 재생이 필요하 므로 교원질을 피복하는 방법뿐만 아니라 표피세포 를 교원질기질상에 배양증식하는 방법도 고안되고 있다. 피하주사용교원질은제재는 깊은 주름과 같이 함몰된 피부를 성형, 수복하는 데 사용된다.
각막용투명반창고는 각막수술 후나 각막에 손상이 있을 경우 렌즈형태의 교원질막을 삽입하면 몇일후 에 용해되도록 하는 것으로써, 각막은 투명한 조직 이기때문에 매우 고도의 정제와 투명한 교원질의 사 용이 필요하다.
세포배양시에도 교원질용액, 투과성 교원질막, 교 원질소구체( m i c r o s p h e r e )등을 기질로 이용하므로 써 비교적 세포배양의 항상성을 유지할 수 있기때문 에 세포배양용기의 표면에 교원질을 도포 혹은 부착 시키는 방법과 세포배양용 배지와 혼합하여 사용하 는 방법이 주로 이용되고 있다.
또한 교원질은 세포분화성과 세포분해성이 평형을 이루고 있기도 하다. 즉, 세포의 D N A합성은 교원 섬유의 밀도가 높을 수록 저하하고 섬유밀도가 높으 면 교원섬유분해효소( c o l l a g e n a s e )의 합성을 유도 하는 등 세포분해기능을 유도하지만 정상상태에서는 세포의 분화기능을 안정적으로 촉진하는 성질에 의 해 균형을 이룬다. 섬유아세포와 같은 접촉성장형 세포의 경우, 일반배양액에서는 세포돌기가 적은 평 편한 형태로 성장하지만, 교원질을 배양액에 첨가, 기질로 사용하여 배양하면 교원질밀도가 높을 수록 세포돌기가 풍부한 방추형으로 빠르게 성장하며, 각 질세포를 배양할 때 첨가하면 t r a n s g l u t a m i n a s e 의 활성을 촉진하고, 간장세포( h e p a t o c y t e )배양시 에는 알부민합성을 촉진할 뿐만 아니라 합성기간도 연장된다.
따라서 생체재료로써 교원질을 사용할 때, 교원섬 유밀도를 낮추거나 섬유형성을 제한하면 세포분화기
능은 촉진시키고, 분해기능은 열성화하게되어 주위 세포의 성장을 빠르게 촉진하도록 유도할 수 있다.
생체에는 피부, 인대, 골, 혈관, 양막, 심막, 심 장판막, 태반, 각막등 교원질이 대량으로 함유되어 있는 조직이 많지만, 교원질의 종류는 각 조직마다 다르다. I형 교원질은 가장 광법위하게 포함되어 있 으며 비교적 처리하기가 쉽기 때문에 생체재료로써 가장 많이 응용되고 있다.
1 9 7 0년대 중반까지만 해도 교원질은 한 종류인것 으로 생각되었으나 그후 다른 종류들이 발견되어 지 금까지 모두 1 1가지의 종류가 보고 되었다. 발견된 순서에 따라 번호가 붙여진 종류중 첫 번째인 I형 교 원질은 피부, 인대, 골등에 다량 포함되어 있다.
I형 교원질분자는 각각 분자량이 약 1 0만씩인 α- 쇄(α-chain) 3개가 모여 형성되어 있다. 각 α-쇄는 좌선형 나선(left-handed helix)을 형성하고, 3개 의 좌선형 α-쇄는 다시 우선형( r i g h t - h a n d e d )으로 모여 겹나선(helical helix)형태의 교원질분자를 형성하며, 분자의 양쪽 말단에는 나선을 형성하지 않은 텔로펩타이드( t e l o p e p t i d e )라고 불리우는 부 분이 있다. α-쇄의 나선부분은 약 1 0 1 2개의 아미노 산 , 텔로펩타이드부위는 1 2 ~ 2 7개의 아미노산이 차지하고 있다.이때 3중나선(triple helix)는 α-쇄 간의 글리신(Gly) 끼리 수소결합과 수산화글리신 (Hyp) 끼리 수산결합을 형성하여 구조를 유지한다.
교원질분자인 3중나선구조는 다시 서로 라이신 ( L y s i n e )에 의해 가교되어 교원섬유( c o l l a g e n f i b r i l )를 형성한다.
혈관, 판막, 양막, 심막등은 세포성분만을 제거하 여 천연교원섬유구조를 유지한 그 자체를 생체재료로 사용하기도 하고, 피부조직의 경우에는 펩신으로 처 리하여 텔로펩타이드를 제거하므로써 비면역성인 아 텔로교원질( a t e l o c o l l a g e n )로 정제하여 투명성막, 겔(gel), 실(thread), 중공사(hollow thread), 소 구체(microshpere), 스폰지, 봉(rod), 렌즈등 다 양한 형태로 제조하는데 이용되며, 인대를 원료로 사 용할 때에는 주로 분산( d i s p e r s i o n )시켜 높은 강도 를 유지하는 교원섬유상태로 처리하여 우수한 혈소판 응집력을 나타내는 지혈제의 제조에 이용하고 있다.
특히 아텔로교원질은 불용성교원질에서 텔로펩타
이드만을 펩신으로 분해하여 가용화한 것으로서, 교 원질 본래의 분자상은 유지하면서 면역성은 제거된 것이므로 생체재료로 사용하는 데 가장 적합하다고 여겨지고 있다. 정제과정에 있어서 펩신처리는 세포 성분과 같은 교원질이외의 성분을 제거하는데도 효 과적이다. 즉, 펩신으로 가용화된 교원질의 침전추 출조작을 반복하는 과정에서 이들 성분이 완전히 제 거될 수 있기 때문이다. 아텔로교원질은 분자상으로 분산된 상태이므로 체내매입용으로 사용하는 데 알 맞고 투명한 용액, 재가교(re-cross linked)교원섬 유화, 막, 스폰지, 실, 중공사등의 형태로 성형가공 할 수도 있다는 장점이 있다.
한편 인대는 교원섬유가 평행하며 집합한 조직이 기 때문에 쉽게 개개의 미세섬유로 분산시킬 수 있 으므로, 이들 교원섬유를 이용하여 막이나 스폰지를 성형하면 아텔로교원질로 성형한 것보다 강도가 높 은 것을 만들어 낼 수가 있다. I형교원질인 피부조 직의 불용성교원질을 기계적으로 분쇄하더라도 불용 성교원섬유분산물을 얻을 수 있어 지혈제(상품 명: A v i t e n e )로 사용하기도 한다. 그러나 미세섬유 가 결속된 굵은 섬유상태가 남아있고, 인대와 같은 미세섬유분산물을 추출하기가 어려우며, 막이나 스 폰지를 만들더라도 인대교원섬유로 만든 것보다는 강도가 약하다. 또한 불용성교원질은 텔로펩타이드 를 포함하고 있기 때문에 아텔로교원질에 비해 월등 히 높은 항원성을 나타낸다.
교원질의 물리적, 생화학적 안정성 및 항원성 등 의 조절을 위한 목적으로 글루타알데하이드( g l u- taraldehyde: GA), hexamethylenediiso- cyanate(HMDIC), 에폭시수지( p o l y e p o x y : PEC) 등을 사용하여 분자를 가교(cross link)화하 여 사용하는 것이 일반화 되어있고, 교원질재료의 주위조직과의 생체친화성을 향상시키기 위해서는 교 원질재료표면을 s u c c i n y l화, ester화, 탄화수소쇄 의 b r a n c h i n g등과 같이 화학적으로 수식하므로서 전하, 용해성, 혈액 및 세포와의 상호작용 등을 조 절하며, 재료자체가 생리활성기능을 가진 생체재료 를 개발하기 위해서는 프로타민의 고정 또는 헤파린 고정화 등과 같은 효소고정을 하기도 한다.
지금까지 교원질의 화학적가교제로써 가장 일반적
으로 사용한 것은 글루타알데하이드( g l u t a l d e- hyde: GA)로써 인공혈관, 생체판막, 연조직 수복 용 주사제 등의 제작에 사용되어 왔다. 화학적 수식 에 의한 가교는 또한 가장 민감하게 면역학적 부작 용을 나타내기 쉬운 교원질피하주사제의 제조에 이 용하면 교원질의 항원성을 감소시켜 부작용을 비교 적 효과적으로 억제할 수 있다. 이는 교원질의 흡수 속도를 가능한한 늦추어 주므로써 항원성의 발현을 조절하게 되는 것으로 보인다 그러나 G A는 세포독 성이 높고, 가교에 관여하지 않은 G A가 서로 중합 하여 세정( w a s h )하더라도 잘 제거되지 않고 교원 질내에 잔존하여 체내 매식 후 서서히 배출되므로 부작용이 많다는 보고가 있다. 또한 G A로 처리한 생체판막등에서는 석회화가 빨리 일어나서 입상적으 로 중대한 문제를 일으키곤 한다.
교원질의 측쇄(side chain)를 화학적으로 처리 하므로써 교원질의 전하(electric charge)상태를 변화시켜 용해정도, 혈액과의 반응, 세포와의 작용 및 친수친지균형( h y d r o p h i l i c i t y - l i p o p h i l i c i t y balance: HLB)등을 조절할 때, 교원질의 아미노 기를 s u c c i n y l화하면( - )전하가 풍부한 교원질이 되 어 중성 p H영역에서도 가용성 교원질이 된다. 보통 의 교원질은 중성에서 섬유재생이 일어나 침전을 일 으키기 때문에 생리적 조건에서는 투명한 용액을 얻 을 수 없다. 또한 s u c c i n y l화한 교원질의 표면은 혈소판점착 및 응집반응을 억제하는 항혈전성 표면 효과도 나타낸다.
한편, 교원질의 카복실( c a r b o x y l )기에 에탄올 ( e t h a n o l )을 반응시켜 에스터( e s t e r )화하면( + )전하 가 풍부한 교원질이 되면서 역시 중성 p H영역에서 의 가용성이 증가함과 동시에 혈소판점착 및 응집이 잘 되는 고혈전성 표면이 된다. 한편 탄화수소의 b l e n c h i n g에 의해 교원질의 소수성을 높이면 계면 활성 효과를 부여할 수도 있다.
이와 같이 교원질분자 측쇄(side chain)의 화학 적 수식은 천연교원질이 가진 성질외에 다시 이용목 적에 필요한 새로운 기능을 부여하는 데 매우 효과 적인 방법이다. 인공혈관 표면은 s u c c i n y l화, 지혈 제는 e s t e r화 하므로써 더욱 이용가치가 높아진다.
한편 교원질의 여러가지 생리활성물질을 고정화시
켜 그 기능을 효과적으로 이용하는 방법도 있다. 교 원질은 구조지지단백질이기 때문에 세포증식 및 분 화에 관여하지만 효소( e n z y m e )나 림포카인( l y m- p h o c a i n e )등과 같은 생리활성물질은 포함되어 있 지 않다. 따라서 교원질의 생체재료로써의 특징을 더욱 효과적으로 이용하기 위해서는 생리활성물질을 함께 사용할 필요가 요구될 때도 있다. 예를 들어 헤파린( h e p a r i n )을 교원질재료표면에 수식하여 서 방(controlled release)화하면 매우 높은 항혈전성 표면을 얻을 수 있다. 가교제로써 P E C를 사용하여 인공혈관내벽의 교원질중 아미노기를 프로타민 ( p r o t a m i n e )과 공유결합시키면, 프로타민은 염기 성아미노산인 아르기닌( A r g )을 많이 함유하였으므 로 풍부한( + )전하를 띄고 있기 때문에( - )전하를 가 진 고분자인 헤파린과 다시 이온결합하여 고정화된 다. 이렇게 고정화된 헤파린은 서서히 방출되므로써 항혈전성을 높여주고, 방출된 후에는 내피세포의 증 식에 의해 천연혈관과 같은 항혈전성을 획득하게 된 다. 만일 프로타민만 공유결합하면( - )전하를 가진 혈소판( p l a t e l e t )과 결합하므로 매우 효과적인 지혈 제로 사용할 수 있으며, 개심수술(open heart s u r g e r y )등 헤파린을 투여한 경우에도 효과적이다.
또한, 생체내에 매입된 교원질은 교원질분해효소 ( c o l l a g e n a s e )에 의해 분해흡수되는 특성이 있으 므로 약물전달(drug delivery system: DDS)용 수송체( c a r r i e r )로써도 적당하다. 약물의 적당량을 일정기간동안 서방(controlled release)화하는 것
은 약물의 부작용을 최소화하면서 그 효과는 최대화 하는 데 필요한 방법이다. 따라서 교원질에 약물을 화학적으로 결합시키고 교원질이 체내에서 흡수됨에 따라 서서히 약물이 확산되어 방출되도록 하는 것으 로써, 약물의 특성에 따라 교원질의 형상을 만들고 약물과 혼합하여 체내매입하는 방법이 주로 연구되 고 있으며, 특히 인터페론( i n t e r f r o n e )과 같은 림 포카인( l y m p h o c a i n e )류의 수송체로서 효과적일 것으로 기대되고 있다.
교원질을 3 7°C 이상으로 가열하여 열변성( t h e r- mal denaturation)시켜 단일 α-쇄들로 분해시켜 서 얻는 젤라틴( g e l a t i n )에서는 DNA 합성억제현상 과 교원질분해효소( c o l l a g e n a s e )활성화현상이 소 실되지만 α-쇄의 생물성(biological properties)은 유지되므로 비면역성재료로 사용할 가능성이 많은 나, 물리적성질을 조절하기가 매우 어렵다.
한편 복합생체재료(hybrid biomaterial)로써 교원질을 이용하는 것은 세포의 극성( p o l a r i t y )과 깊은 관계가 있다. 세포를 교원질막상에서 배양할 때 보통의 상태에서보다 세포의 증식속도가 매우 빠 르게 나타나는 것은 세포막이 가지고 있는 극성에 의해 교원질막에 접착하면 교원질막의 물질투과성에 의해 배양액으로부터 원활한 영양분을 섭취할 수 있 으므로 세포의 에너지원인 글루코즈의 흡수도가 증 가하고 따라서 세포내에서 대사된 후, 유산( l a c t i c a c i d )의 배출량도 증가하게 된다. 또한 세포의 아미 노산(특히 P r o l i n e )의 흡수도 증가하여 대사후, 암 Table 2. 교원질조직의 선택과 용도
진피
펩신 가용화 펠로펩타이드제거
형상: 아텔로교원질, 저항원성
용도: 투명용액, gel, 막,실,중공사,미세구,스폰지,봉, 렌즈등 가공가능
건
분 산
형상: 섬유상 교원질, 높은 혈소판응집력 용도: 고효율 지혈제, 고강도 창상피복제
혈관,심외막
심장판막 혈액성분제거
형상: 천연교원질섬유 결합 및 구조유지 용도: 인공 조직대체재료
모니아 및 수소이온의 방출량이 감소하게 된다. 이 런 현상은 교원질막상에서 배양중인 섬유아세포 ( f i b r o b l a s t )에서 세포막의 물질수송에 관한 극성 이 향상된다는 것을 의미하므로 교원질을 이용하여 세포배양시간의 연장 가능하다면 다른 합성재료와 복합화하여 세포를 능동적으로 활성화하는 복합재료 개발도 가능한 것이다.
4. 인공배양세포
조직수복(tissue restoration)에 세포를 이용하 기위해서는 우선 필요한 세포를 획득하는 것이 우선 되어야 한다. 일반적으로 건강한 자가세포을 이용하 는 것이 면역학적으로 가장 안전하지만, 수복해야하 는 조직이나 장기가 완전히 손실되었을 경우에는 타 인으로부터 얻어 배양을 하게된다.
현재 인공적인 배양이 가능한 세포는 매우 광범위 하여 섬유아세포, 골아세포나 연골아세포등은 물론 췌장의 랑거한섬세포( L a g e r h a n’s islet cell)과 같은 기능성세포까지도 배양이 가능하다.
세포배양시에 대상이 되는 세포를 선택함에 있어 계대를 확인하는 것은 비교적 확실하게 알수 있지 만, 세포자체가 그 계대내에 어느 위치에 속하는지 는 분명하지 못한경우가 많다. 예를들어 증식세포주 (propagated cell line)에서는 완전분화되어 증식 하지 못하는 세포에 비해 전구세포( p r e c u r s o r c e l l )가 더 많다. 그 결과 세포주가 이종( h e t e r o- g e n e o u s )의 상태가 될수도 있게되며 이를 이종배 양(culture heterogeneity)라고 한다. 예를 들어 피부각화세포를 배양하면 간세포(stem cell), 전구 세포, 각화표피물(keratinized squame)등이 혼 재하기 때문에 간세포의 지속적인 재생, 전구세포의 증식과 성숙( m a t u r a t i o n )에의한 최종산물인 비가 역적분화(irreversible differentiation)에 의한 각화표피물이 배지에 함께 존재하게 된다. 한편 섬 유아세포의 경우, 약 1×1 04/ c m2정도로 적은수를 초기배양하면 증식성세포가 균일하게 나타나지만, 1×1 05/ c m2정도의 높은 농도에서 배양하기 시작하 면 잘 분화된 비증식성세포를 균일하게 나타난다.
이런 고농도의 완전분화세포가 되더라도 트립신
( t r y p s i n )처리 또는 물리적인 방법으로 세포간 결 합을 분해하고 농도를 낮추면 이들 세포들은 다시 생주기(life cycle)에 들어가기 시작한다. 또한 이 종배양은 세포주(cell line)내에 여러계대( m u l t i- ple lineage)가 존재하더라도 나타날 수 있다.
따라서, 세포배양에 있어 단일화 할수 있는 것은 배지와 첨가제의 선택 및 최상의 성장율을 나타내는 세포형태를 취하는 것 뿐이이므로 대부분의 경우 통 상적인 표현형( p h e n o t y p e )의 세포를 사용하지만, 세포자체가 본래지닌 성장 조절기능에 의해 유전적 으로 여러 가지 다른 표현형을 가진 세포가 혼재하 는 상태로 증식하게 된다.
배양세포의 초기농도외에 배지에 첨가되는 혈청이 나 칼슘이온과 같은 영양소, 홀몬, 기질간의 상호작 용등은 세포의 분화와 증식에 중요한 영향을 미친다.
따라서 어떤 세포주의 어떤 계대의 세포를 사용할 것 인가는 물론, 사용세포의 분화단계확인과 세포농도의 조정 및 영양소와 홀몬의 조절에 의한 안정화시키는 것이 균일한 세포를 얻는 기본조건이 된다.
어떤 세포를 연속적으로 증식시켜 본래기관( o r i g- inal organ)의 조직구조를 유지하면서 재현시키는 것은 조직배양(organ culture)라고 한다. 체외에 서 유사조직구조를 재생하기 위해서는 서로 다른 세 포를 배양하여 재집합( r e a g g r e g a t i o n )시키거나, 다세포 구상체(multicellular spheroid)와 같은 고농도의 세포를 배양하는 방법, 세라믹이나 합성고 분자표면에 세포를 다층( m u l t i l a y e r )으로 배양하 거나, 조직의 구조체인 교원섬유상에서 배양하는 방 법등이 시도되고 있다. 그러나 세포가 지닌 생물학 적 역동성 때문에 배양의 조절이 어렵고, 생체외( i n v i t r o )조건에서 나타나는 세포간의 상호작용을 생체 내(in vivo)에서 재현시키기가 어렵기 때문에 많은 연구를 필요로 하고 있다.
한편 자가세포가 아닌 이상, 이식된 동종 혹은 이 종 세포에 대한 면역반응은 피할 수 없는 문제를 가 지고 있다. 이를 해결하는 방법의 하나로 조직공학에 서 사용하는 비자가세포는 유전자를 수혜자의 것으로 변형시켜야 할 필요가 있다. 사람의 유전자를 동물의 난자에 넣어 얻는 방법은 양, 돼지, 원숭이 등 다양 한 동물을 대상으로 이루어지고 있으나, 가장 근본적
인 문제인 동물세포의 수명을 사람세포의 수명과 일 치시키는 방법에 대한 해결은 접근조차 못하고 있는 실정이다. 따라서 조직재생공학분야에서는 이식대상 동종세포를 수혜자의 유전자로 변형시킨 다음 배양하 는 것을 우선적으로 고려하여야 한다.
한편 요즈음 가장 많은 관심을 보이고 있는 대상 은 줄기세포(또는 간세포, stem cell)의 이용에 관 한 것이다. 줄기세포는 다양한 형태의 조직세포로 분화가 가능한 세포로서 자가재신생성( s e l f - r e n e w a l )을 가진 것을 말하며, 발생학적으로는 수 정 후 2주이내 배아( b l a s t o c y s t )의 세포내절형물 (intra cellular mass)이 가장 대표적이라고 볼 수 있다. 아직 면역계를 형성하기 이전인 이들 세포 를 이용하여 원하는 조직으로 분화, 증식시킬 수 있 다면 매우 유용할 것이지만 윤리적 문제를 고려할 때, 실용적이라고 보기에는 어렵다. 따라서 가장 실 용적인 대상은 1 9 9 9년말에 보고된 성인의 골수에 서 발견된 성인줄기세포(adult stem cell)이다.
골수에서는 그동안 가장 널리 알려진 각종 혈액세포 로 분화되는 조혈모줄기세포 ( h e m a t o p o i e t i c stem cell) 뿐만 아니라 골격계, 근육계는 물론 심 지어 신경계로 까지 분화되는 간엽줄기세포( m e s- enchymal stem cell)가 존재한다는 사실이 발표 되므로서, 이들 세포를 조직구조체와 함께 이용하는 것이 가능할 것으로 보고 있다.
5. 인공보존 조직
생체내에 존재하는 교원성조직( c o l l a g e n o u s tissue) 자체를 적출하여 교원질이 형성하고 있는 구조를 파괴하지 않고 세포성분이나 교원질이외의 물질을 제거하여 생체재료로 사용하는 경우도 많아 지고 있다. 이는 합성고분자만으로는 생체조직을 완 전히 복제재현하기 어렵기 때문이다. 예를 들어 동 물의 심막(pericardium), 양막, 심장판막등을 초 음파세척과 효소처리를 통해 교원질이외의 성분은 완전히 제거하고 남은 교원질은 가교시켜 사용하는 경우이다. 이런 천연조직들은 본래 교원질이 구성하 고 있는 조직적구조를 그대로 유지하고 있기 때문에 충분한 인장강도나 왜곡강도를 가지고 있어 충분한
물리적내성을 나타내고 봉합하기도 충분할 많큼 강 하다. 일단 이런 조직을 분쇄하고나면 재생시키는 어렵다. 또한 물리적강도뿐만 아니라 천연조직과 똑 같은 교원조직구조를 가지고 있기 때문에 이를 생체 재료로서 생체내에 매입하면 천연조직과 같은 조직 의 재구축이 가능하다. 예를 들어 돼지의 피부를 동 결건조한 돈피창상피복재(porcine skin wound dressing), 가교화 돼지판막의 심장용 인공판막등 이 있다. 특히 판막의 경우, 생체와 같은 구조이기 때문에 기계판막보다 우수하지만 석회화가 쉽게 일 어나므로 비석회화 생체판막을 제조하기 위한 연구 가 많이 진행되어 있다.
현재 미국에서는 동물의 혈관을 이용하여 인공혈 관으로 사용하는 제품이 상품화되어, 전체 인공혈관 수요중 1 0 %가 소의 동맥을 처리한 생체혈관이다.
합성고분자를 이용한 인공혈관은 직경 4mm 이상 의 것이 상품화 되어 있으며 그 이하의 것은 아직 성공하지 못하고 있다.
한편 손상된 조직을 타인으로부터 적출한 건강조직 으로 대체하는 방법도 널리 사용되고 있으며, 이때 가장 중요한 것은 일단 적출된 조직 또는 장기를 이 식에 이용할 때까지 그 생물학적기능을 잃지 않도록 보존하는 것이다. 또한, 조직공학적으로 만들어진 인 공조직도 포함된 세포의 생장능을 보장해야하며, 특 성상 장기간 보존하면서 필요에 따라 공급해야하므 로, 일반적인 보존조직과 같이 취급되어야 한다.
적출조직의 냉장( r e f r i g e r a t i o n )이나 조직배양과 같은 단순한 방법은 조직의 생존기간이 짧을뿐만 아 니라 많은 비용과 오염( c o n t a m i n a t i o n )가능성 또 는 유전인자의 불일치와 같은 위험성을 가지고 있기 때문에 일반적으로 사용하는데는 무리가 있으며, 이 를 위해 사용되고있는 방법이 조직을 급속하게 낮은 온도로 처리하여 생물화학적으로 보존하는 것으로, 이를 냉동보존( c r y o p r e s e r v a t i o n )이라고 부른다.
모든 조직이나 세포를 냉동시키는 보편적인 방법 은 아직 개발되지 못했으며 냉동한 다음 해동 ( t h a w )할 때 정상상태로의 회복율( r e c o v e r y r a t e )이 낮거나 아예 생장능( v i a b i l i t y )이 없게되 는 경우도 많다. 그러나 심장판막이나 연골과 같은 비교적 큰 구조체조직(structural tissue)나, 정
자( s p e r m )처럼 적은 양의 세포만 있어도 기능을 나타낼 수 있는 정액과 같은 조직, 혹은 골수와 같 이 적은 수의 살아있는 전구세포(progenitor cell) 만 있어도 다시 재생할수 있는 조직의 경우에는 냉 동보존이 매우 유용하게 사용되고 있으며, 이때에 가장 중요한 것은 일단 냉동 되었던 조직세포의 정 상기능화복율이다.
구조체조직의 경우 그 조직의 기능의 대부분은 세 포외기질에 의해 이루어지지만 만일 구성세포의 생 명력이 전혀 없다면 이식후합병증이 일어나 실패할 수도 있다. 따라서 조직을 냉동시킨 다음 다시 해동 시키는 전과정을 통해서 조직의 구조가 유지되어야 하는것은 물론 조직세포의 생장능이 회복되어야 한 다. 일단 조직을 냉동할때는 온도가 3 7℃에서 - 1 9 6
℃까지 급격히 떨어지는 과정에서 세포내 수분중 약 9 5 %가 없어지고, 세포내외의 전해질농도가 규형을 잃게되며, 냉동용매의 농축된 유기화학성분들이 세 포내에 들어가고, 얼음결정들이 조직내에 형성되면 서 세포형태에 변형을 일으키며, 세포내에서 얼음이 형성되면서 세포내구조도 변형된다. 따라서 조직의
냉동보존시에 가장 어려운 점은 높은 생장율을 유지 시키는 방법의 개발에 있다.
REFERENCES
01) 서활: 생체재료학입문. 지성출판사, 서울. 1993.
02) Park JB, Lakes RS: Biomaterials. Plenum Press, New York. 1992.
03) Nimni ME: Collagen. CRC Press. Boca Raton, Fl.
1988.
04) Silver FH: Biomaterials, Medical Devices and Tis- sue Engineering. Champman & Hall, London. 1994.
05) Urist MR: Formation by autoinduction. Science, 150:893, 1965.
06) Woznet JM: Novel regulators of bone formation:
Molecular clones and activities. S c i e n c e , 2 4 2 : 1 5 2 8 , 1 9 8 8 .
07) Davis MW, Vacanti JP: Toward development of an implantable tissue engineered liver. B i o m a t e - rials, 17:365, 1996.
