대한소화기학회지 2006;48:327-336
Correspondence to: Sung Kyu Choi, M.D.
Department of Internal Medicine, Chonnam University Medical School, 8, Hak-dong, Dong-gu, Gwangju 501-757, Korea Tel: +82-62-220-6203, Fax: +82-62-228-1330
E mail: [email protected]
간경변증과 동반된 간세포암종에서 Microsatellite Instability와 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화
전남대학교 의과대학 내과학교실, 병리학교실*
박정호․조성범․이완식․박창환․주영은․김현수․최성규․유종선․이재혁*․김세종
Methylation Pattern of DNA Repair Genes and Microsatellite Instability in Hepatocelluar Carcinoma
Jung Ho Park, M.D., Sung Bum Cho, M.D., Wan Sik Lee, M.D., Chang Hwan Park, M.D., Young Eun Joo, M.D., Hyen Soo Kim, M.D., Sung Kyu Choi, M.D., Jong Sun Rew, M.D.,
Jae Hyek Lee, M.D.*, and Sei Jong Kim, M.D.
Departments of Internal Medicine and Pathology* Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea
Backgrounds/Aim: Epigenetic silencing of DNA repair genes, O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT), hMLH1 and hMSH3, by promoter hypermethylation have been observed in various cancers. However, the relation-
ship between hypermethylation of DNA mismatch repair genes and microsatellite instability (MSI) has not been studied in hepatocellular carcinoma (HCC) associated with cirrhosis. Methods: We investigated the methylation pat- tern of CpG islands of 3 genes using methylation-specific PCR (MSP) and MSI in 40 patients with paired hepatocellular carcinoma and associated cirrhosis. Results: hMSH3 and MGMT were the most methylated genes in both cirrhosis (70% and 68%, respectively) and HCC (75% and 73%, respectively). The methylation of hMLH1 was rarely found in both cirrhosis (8%) and HCC (5%). Gene promoters methylated in cirrhosis were also methylated in HCC with the exception of 9 cases found to be methylated either in cirrhosis or HCC. Of 40 cases of HCC associated with cirrhosis, three had MSI-positive phenotype in which two were MSI-low and one was MSI-high. One MSI-positive phenotype was present both in cirrhosis and in HCC, while two were only in HCC. There was no significant correlation between aberrant DNA methylation of mismatch repair genes and MSI status in HCC associated with cirrhosis. Immunohistochemical expressions of hMLH1, MGMT, and hMSH3 proteins were present in 16 (40%), 6 (15%), and 11 (28%) of 40 cases of HCC respectively. There was no significant correlaton between the aberrant DNA methylation of mismatch repair genes and clinical characteristics such as histological differentiation, postoperative recurrence and mortality. Conclusions: The methylation of
MGMT and hMSH3 among DNA repair genes are frequent, but those of hMLH1 and MSI is very rare in bothcirrhosis and HCC. There is no significant correlation between the methylation of DNA repair genes and clinical characteristics of HCC. (Korean J Gastroenterol 2006;48:327-336)
Key Words:
Hepatocellular carcinoma; MGMT; hMLH1; hMSH3
접수: 2005년 8월 31일, 승인: 2006년 6월 24일
연락처: 최성규, 501-757, 광주광역시 동구 학1동 8번지
전남대학교병원 소화기내과
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328 대한소화기학회지: 제48권 제5호, 2006
서 론
간세포암종은 전 세계적으로 흔한 악성종양 중 하나이 다. 우리나라에서 간세포암종 발생률은 10만 명당 남자 45명, 여자 12명으로 세계에서 가장 높은 편이며 간세포 암종으로 인한 사망률은 10만 명당 22.8명으로 암사망률 중 위암과 폐암에 이어 3위를 차지한다.1 B형 및 C형 간 염 바이러스에 의한 만성 간염과 이에 따른 간경변증이 간세포암종 발생에 중요한 원인인자이며 그 외에도 aflat- oxin B1과 같은 독성물질의 섭취나 음주 등이 유발인자로 알려져 있다.2 일반적으로 간세포암종을 포함하는 많은 악성 종양이 종양유전자 또는 종양억제유전자들과 관련 되어 다단계의 유전 변이나 상유전 변화가 축적되어 발 생하며, 특히 간세포암종은 전암병변으로 간주되는 만성 간염, 간경변증과 형성이상 결절(dysplastic nodule) 등과 함께 그 발생에서 종양억제유전자들의 불활성화와 관계 가 있다.3,4
종양 관련 유전자들의 DNA 메틸화는 여러 종류의 종양에서 보이는 흔하고 일관된 상유전 변화 중 하나이 다.5,6 특히 CpG 밀집부위가 많은 유전자 프로모터 부위 에서 관찰되는 이상 메틸화로 인해 종양유전자, 종양억제 유전자, 종양의 침윤과 전이를 억제하는 유전자, DNA 복 제오류 교정유전자, 호르몬 수용체 관련 유전자와 신생혈 관 형성을 억제하는 유전자들의 기능이 소실된다.7 이 중 DNA 복제오류 교정유전자인 human MutS homologue-2 (hMSH2)와 human MutL homologue-1 (hMLH1)의 생식세포 변이(germline mutation)에 의해 선천비용종대장암(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)이 발생하는 데 반해 비선천 대장암은 상유전 변화인 프로모터 메틸화에 의한 hMLH1 유전자의 불활성화 결과로 발생한다.8,9 최근 인체 유전자 증폭 시 다형성(polymorphism)이 관찰된다는 보고 이후 microsatellite instability (MSI)가 선천 비용종대장암과 깊은 연관성이 있는 것으로 밝혀졌고 그 원인으로 hMLH1, hMSH2와 같은 DNA 복제오류 교정유전자들의 결함이 있 는 것으로 알려졌다.10,11
지금까지의 연구보고는 간세포암종의 발생과정에서도 DNA 복제오류 교정유전자의 관련성을 시사하고 있으 며, 그 중에서도 DNA 복구과정에서 복제오류 교정계 (mismatch repair system)와 O6-methylguanine-DNA methyl- transferase (MGMT)의 중요한 연관성이 제시되었다.12-14 DNA 복제오류 교정효소인 MGMT는 22,000 kD의 단백 질로 메틸화된 guanine의 빠른 반전에 중요하며, 인간에 서는 간세포 내에 가장 높은 MGMT 활성도를 가지고
있다.15,16 간세포암종에서 MGMT는 프로모터 부위의 과
메틸화에 의해 유전자 기능이 상실됨으로써 간세포암종
발생에 관여한다.
따라서 저자들은 간경변증이 동반된 간세포암종에서 상유전 변화인 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화 유무와 MSI 빈도를 조사하고 면역조직화학염색을 통해 메틸화에 따른 단백 소실 유무를 조사하여 간세포암종 과 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화와의 연관성 을 파악하고, 간세포암종의 임상 특징과의 관련성을 알 아보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대상2000년부터 2003년까지 간세포암종으로 수술 적출술 을 시행 받아 병리조직 소견으로 진단된 간세포암종 환 자들 중에서 간경변이 동반된 40예를 대상으로 하였다.
대상 환자들은 의무기록지를 통해 진단 당시의 연령, 성별, 간경변증 원인, 혈청 α-FP 수치, BCLC (Bar- celona clinic liver cancer) 및 TNM 병기(6th AJCC/UICC stage), 종괴 크기, 조직 분화도와 수술 후 재발 유무 등 을 조사하여 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화와 상호 관련성을 조사하였다.
2. 방법
1) 메틸화-특이 중합효소연쇄반응(methylation-spe- cific polymerase reaction, MSP)을 이용한 유전자들의 메틸화 조사
DNA의 bisulfite 전처리 과정을 거친 후 중합효소연쇄 반응(PCR)을 시행하였는데 구체적인 과정은 다음과 같 다. 2 mL DNA를 50μL 증류수에 희석한 다음 2 M NaOH 5.5μL를 첨가하여 잘 혼합한 후 37oC에서 10분 간 반응시켰다. 실험마다 바로 제작한 10 mM hydro- quinone (Sigma, St louis, USA) 30μL와 3M sodium bi- sulfite (Sigma, pH 5.0) 520μL을 첨가한 후 DNA와 잘 혼합하였다. 이 혼합물에 무기질 오일(mineral oil)을 가 한 뒤 암소에서 50oC, 17시간 동안 반응시켰다. 다음날 오일을 제거한 다음 DNA wizard cleanup system (Pro- mega, Madison, USA)을 이용하여 염기 제거와 정제과정 을 거쳤다. 먼저 DNA cleanup resin을 1 mL 첨가한 후 주사기를 이용하여 miniprep column을 통과시켜 DNA를 column에 부착시켰다. 80% isopropanol 2 mL를 넣어 남 아있는 resin과 염기를 제거하는 과정을 2-3회 반복하였 다. 이렇게 처리된 DNA를 튜브에 담아 13,000 G에서 2 분간 원침하여 resin을 건조시킨 후 65oC 증류수 50μL 를 첨가하여 녹였다. 여기에 3M NaOH 5.5μL를 넣은 뒤 실온에서 5분간 반응시킨 다음 glycogen (20 mg/mL,
박정호 외 9인. 간경변증과 동반된 간세포암종에서 Microsatellite Instability와 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화 329
hMLH-1
A
MGMT
hMLH-3
U M 9C
U M 9H
U M 17C
U M 17H
U M 32C
U M 32H
U M 39C
U M 39H
Normal
Cirrhosis HCC
Normal
Cirrhosis HCC
BAT25 BAT26 D2S123 D17S250 D5S346
BAT25 BAT26 D2S123 D17S250 D5S346
B
Fig. 1. Representative data forDNA methylation and microsatel- lite instability. (A) Examples of methylation analysis of hMLH1, MGMT, and hMSH3 in paired liv- er cirrhosis (C) and hepatocellu- lar carcinoma (H) are seen. (B) Examples of microsatellite instabi- lity analysis in normal liver tissu- es, liver cirrhosis and HCC DNA are seen.
hMLH1, human MutL homolo- gue-1; MGMT, O6-methylguanine- DNA methyltransferase; hMSH3, human MutS homologue-3. HCC, hepatocellular carcinoma.
Table 1. Primer Sequence for DNA Repair Genes and Microsatellite Instability (MSI)
Sence Antisense
DNA repair genes
hMLH1 M: 5'-GATACGATTTTTAACGC-3' 5'-TCTATAAATTACTAAATCTCTTCG-3' U: 5'-AGAGTGGATAGTGATTTTTAATGT-3' 5'-CTCTATAAATTACTAAATCTCTTCA-3' MGMT M: 5'-GGTCGTTTGTACGTTCGC-3' 5'-GACCGATACAAACCGAACG-3'
U: 5'-GTAGGTTGTTTGTATGTTTGT-3' 5'-AACCAATACAAACCAAACA-3' hMSH3 M: 5'-AGTTCGTTCGTTATAGTAAGAACGC-3' 5'-AATTCCCAAACGTCTACGAACGC-3'
U: 5'-AGTTTGTTTGTTATAGTAGTTATGT-3' 5'-AATTCCCAAACATCTACAAACAC-3' MSI
D2S123 5'-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3' 5'-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3' D5S346 5'-ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3' 5'-AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT-3' D17S250 5'-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3' 5'-GCTGGCCATATATATATATTTAAACC-3' BAT25 5'-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3' 5'-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3' BAT26 5'-TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3' 5'-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3'
hMLH1, human MutL homologue-1; MGMT, 06-methylguanine-DNA methyltransferase; hMSH3, human MutS homologue-3.
Roche, Mannheim, Germany) 1μL, 10 M ammonium ace- tate (NH4Ac, Sigma) 33μL, 그리고 저온 에탄올 260μL 를 첨가하여 잘 혼합한 뒤 -80oC 저온 냉동고에 1시간
동안 보관하였다. 이 혼합액을 저온 원심분리기를 이용 4oC에서 8,000 rpm으로 30분간 원심분리한 다음 상층액 은 버리고 70% 에탄올 260μL를 첨가한 뒤 4oC에서
330 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 48, No. 5, 2006
8,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 에탄올을 제거 한 뒤 상온에서 건조한 다음 증류수 20μL를 첨가하여 잘 녹인 뒤 중합효소반응 시행 전까지 -20oC 냉동고에 보관하였다.
각각의 중합효소반응 시동체(primer)들은 bisulfite 전처 리 후 메틸화 DNA와 비메틸화 DNA에 선택적으로 결 합할 수 있도록 제작되었으며 분석할 3종류 DNA 복제 오류 교정유전자들의 종류와 MSP 조건을 표시하였다 (Table 1). Thermocycler (Perkin Elmer, Boston, USA)를 사용하여 유전자의 종류에 따라 증폭주기를 35-40회로 시행하였으며 72oC에서 5-8분간 최종 연장 후 증폭산물 을 ethidium bromide가 함유된 2% 우무겔에서 전기영동 하여 확인하였다. 메틸화 Cp에 대한 양성 대조군과 비 메틸화 Cp에 대한 양성 대조군은 이전 위암 실험에서 확인된 표본을 이용하였다(Fig. 1).
2) Microsatellite instability 분석
추출한 DNA에서 5종류의 Bethesda 표지자(D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26)를 이용하여 MSI 상 태를 분석하였다. 사고로 인해 간손상을 받아 부분간절 제술을 받았던 정상 간조직을 기증받아 대조군으로 이 용하였다. 각각의 표지자는 3' 말단에 형광염료(6-FAM) 가 부착된 전방향(forward) 시동체와 형광물질 부착이 없는 역방향(reverse) 시동체를 제작 의뢰하여 사용하였 다(Table 1). 중합효소반응은 DNA 40 ng, 9μL의 ABI PrismⓇ True AlleleTM PCR Premix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 5 pmol의 6-FAM-부착 전방향 시동체 그리고 10 pmol의 역방향 시동체를 넣고 총 부 피를 15μL가 되도록 한 후 효소 불활성화를 위해 92oC 에서 6분간 초기 변성시킨 후, 94oC에서 45초, 55-63oC 에서 1분간 annealing, 72oC에서 1분간 extension 과정을 28-35회 반복하고, 그 후 72oC에서 10분간 방치하여 4oC에서 보관하였다. 증폭산물을 30μL의 증류수에 희 석한 다음 준비된 96 well plate에 각각 희석된 증폭산 물 1μL씩을 분주하고 12μL의 formamide와 0.5μL Genescan 400HD [ROX] size standard (Applied Biosy- stems, Foster City, CA, USA)를 첨가하였다. DNA 혼합 물을 95oC에서 1분간 변성시킨 후 급냉한 다음 ABI 3100 DNA 분석기에 넣어 전기영동 하였고 GeneScan 분석 소 프트웨어(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이 용하여 분석하였다. Microsatellite instability (MSI)의 판정 은 5종류의 표지자 중 하나의 부위에서 MSI가 있으면 저 MSI (MSI-low)군으로, 2개 이상 부위에서 MSI가 있으면 고 MSI (MSI-high)군으로, 하나의 표지자도 MSI가 없다 면 안정 MSI (MSS)군으로 분류하였다(Fig. 1).
3) MGMT, hMLH1, hMSH3에 대한 면역조직화학 염색
면역조직화학염색을 위해 파라핀 포매괴를 5μm로 박절하여 ProbeOn Plus (Fisher Scientific, Springfield, NI, USA)에 부착시켜 건조한 다음 염색에 사용하였고, 염 색 전 과정은 capillary gap action 원리를 응용하여 개발 된 Microprobe manual stainer (Fisher Scientific, USA)를 이용하여 ABC (avidin-biotin complex) 방법으로 하였다.
파라핀 절편이 부착된 슬라이드는 탈파라핀과 함수과정 을 거친 후, 포르말린 고정으로 인하여 조직 내 감추어 진 항원을 노출시키기 위해 citric acid 용액에 담가 microwave oven을 이용하여 7분간 가열한 후 20분간 실 온에 두기를 4회 반복하였다. 면역조직화학염색으로 관 찰될 수 있는 비특이적 항원-항체 반응을 억제하기 위하 여 protein blocker (Reseach Genetics, Huntsville, AL, USA) 로 5분간 반응시킨 후 잘 수세하였다. 일차항체로 MGMT (Zymed, SanFrancisco, CA, USA, 1:100), hMLH1 (Zymed, 1:100), hMSH3 (Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, 1:100)에 대한 항체를 실온에서 12시간 반응 시켰다. 일차항체 검출을 위한 이차항체는 biotin이 부 착된 anti- mouse IgG (Sigma)를 이용하여 7분간 반응시 킨 후 완충액으로 씻어내고, horseradish peroxidase를 7 분간 작용시켰다. 완충액으로 잘 수세한 후 AEC (3- amino-9-ethylcarvazole, Zymed)를 첨가하여 적갈색 반응 을 확인하였다. 헤마톡실린 대조염색 후 Universal Mount (Research Genetics, Huntsville, AL, USA)로 봉입하여 관 찰하였다. 결과 해석은 염색된 세포수가 10% 미만일 때 음성으로 간주하였고, 10% 이상 염색된 세포수를 보일때 양성으로 판정하였다.
3. 통계 분석
통계 분석은 SPSS 프로그램(version 12.0)을 이용하였으 며 유의수준은 95%로 하였다. 연속 변수의 비교 분석에는 Student’s t-test 혹은 Mann-Whitney U-test, ANOVA를 이용 하였고, 비연속 변수의 빈도 분석에는 Pearson chi-square test 혹은 Fisher's exact test를 이용하여 분석하였다.
결 과
1. 임상 특징
대상 환자의 평균 연령은 58세(34-72세)이고, 남녀비 는 9:1였다. 간경변증의 원인은 B형간염 바이러스가 24 예(60%)로 가장 많았으며 대부분 Child-Pugh 분류 A에
Park JH, et al. Methylation Pattern of DNA Repair Genes and Microsatellite Instability in Hepatocelluar Carcinoma 331
Table 2. Clinical Characteristics of Patients
Parameters n=40 (%)
Mean age (years) 58 (34-72)
Male/Female 36/4
Etiologic factors
HBV 24 (60)
HCV 7 (18)
Non-B, Non-C 3 (8) Alcoholic 6 (15) Child-Pugh class (A/B) 38/2 AFP (ng/mL)
＜400 32 (80)
≥400 8 (20)
Mean size of HCC (cm) 4.2±2.6
＜5 29 (73)
≥5 11 (27)
BCLC stage*
Stage A1/A2/A3/A4/B/C 12/3/8/3/8/6 TNM stage†
Stage I/II/III/IVa/IVb 4/24/7/5/0 Pathologic features
Well differentiated 8 (20) Moderately differentiated 19 (48) Poorly differentiated 13 (32) Recurrence/Mortality 25 (63)/15 (38)
1 year 15/4
2 years 6/7
3 years 4/4
* Barcelona clinical liver cancer stage.
†6th AJCC/UICC TNM stage.
HBV, hepatitis B virus; HCV, hepatitis C virus; AFP, alpha-fetoprotein; N, number.
Table 3. DNA Hypermethylation, Microsatellite Instability, and Immunohistochemical Stains in Liver Cirrhosis and Hepatocellular Carcinoma
DNA hypermethylation Immunohistochemical stain
MSI
hMLH1 MGMT hMSH3 hMLH1 MGMT hMSH3
Liver cirrhosis 3 (8%) 27 (68%) 28 (70%) 1 (3%) * * * HCC 2 (5%) 29 (73%) 30 (75%) 3 (8%) 16 (40%) 6 (15%) 11 (28%)
* Not checked.
hMLH1, human MutL homologue-1; MGMT, 06-methylguanine-DNA methyltransferase; hMSH3, human MutS homologue-3;
HCC, hepatocellular carcinoma.
해당되었다. 수술 후 절제된 간세포암종의 평균 크기는 4.2±2.6 cm였고, 5 cm 미만인 경우가 29예(73%), 5 cm 이상인 경우가 11예(27%)였다. 간세포암종 병기분류에 서 BCLC stage A1은 12예(30%), A2는 3예(8%), A3는 8
예(20%), A4는 3예(8%), B는 8예(20%), C는 6예(15%)였 고, TNM stage I은 4예, II는 24예(60%), III는 7예(18%), IVa는 5예(13%)였다. 간세포암종의 조직 분화도 등급에 따라 고분화도 8예(20%), 중분화도 19예(48%), 저분화도 13예(32%)의 분포를 보였다. 수술 후 간세포암종 재발 은 총 25예(63%)에서 발생하였으며, 1년 재발률은 38%, 2년 누적 재발률은 53%, 3년 누적 재발률은 63%였다.
수술 후 간세포암종의 재발 또는 간기능 저하로 사망한 경우는 15예(38%)였고, 1년 사망률은 10%, 2년 누적 사 망률은 28%, 3년 누적 사망률은 35%였다(Table 2).
2. 간경변증과 간세포암종에서 hMLH1, MGMT, hMSH3 유전자의 메틸화 빈도
수술 후 적출된 간경변증과 동반된 간세포암종 조직 40예 중 간경변증 조직에서 hMLH1, MGMT, hMSH3 유 전자의 메틸화를 보이는 경우는 각각 3예(8%), 27예(68%) 및 28예(70%)였다. 간세포암종 조직에서 hMLH1, MGMT, hMSH3 유전자의 메틸화는 각각 2예(5%), 29예(73%), 30 예(75%)로 hMLH1을 제외하고 간경변증에 비해 간세포 암종에서 메틸화 빈도가 약간 증가하였으나 의미있는 차이는 없었다(p＞0.05). DNA 복제오류 교정유전자들 중에서 hMSH3와 MGMT는 간경변증과 간세포암종 모두 에서 높은 메틸화 빈도를 보였으나 hMLH1는 메틸화 빈도가 매우 적었다(Table 3). 간경변증에서 메틸화된 유전자들 대부분은 간세포암종에서도 메틸화되어 있었 으나, 9예에서는 간경변증이나 간세포암종에서만 메틸 화가 관찰되었는데 이 중 hMSH3 4예, hMLH1 3예 그리 고 MGMT가 2예 있었다.
3. Microsatellite instability와 DNA 복제오류 교 정유전자 메틸화와의 상관관계
간경변증이 동반된 간세포암종 조직에서 관찰되는 MSI상태는 대부분의 증례들이 안정 MSI (MSS)였으며 단지 3예(8%)에서만 MSI가 관찰되었다. 이 중에서 2예
332 대한소화기학회지: 제48권 제5호, 2006
A B
Fig. 2. Immunohistochemical stains of hMLH1 and hMSH3 in hepatocellular carcinoma. (A) Diffuse positive nuclear stain- ing for hMLH1 (×400). (B) Focal positive nuclear staining for hMSH3 (×400).
hMLH1, human MutL homologue-1; hMSH3, human MutS homologue-3.
A B
Fig. 3. Immunohistochemical stains of MGMT protein. (A) Positive cytoplasmic staining pattern in cirrhotic nodule (×400). (B) Negative cytoplasmic staining pattern of hepatocellular carcinoma (×400).
MGMT, O6-methylguanine-DNA methyltransferase.
는 저MSI를 그리고 1예는 고MSI군에 해당하였다. 3예 의 MSI 양성군 중에서 간경변증과 간세포암종 모두에 서 동일한 MSI 형태를 보인 경우가 1예 있었고 나머지 2예 모두는 간세포암종에서만 관찰되었다. 이번 증례들 에서 관찰되는 MSI상태는 DNA 복제오류 교정유전자 메틸화와는 무관하게 출현하여, 간세포암종에서는 MSI 와 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화와는 상관관 계가 없는 것으로 추정하였다.
4. MGMT, hMLH1, hMSH3 단백에 대한 면역조 직화학염색 결과 분석
MGMT, hMLH1, hMSH3 단백에 대한 면역조직화학염
색 결과 MGMT는 세포질 내에 과립상으로 관찰되었고, hMLH1와 hMSH3는 핵에 국한되어 적갈색으로 관찰되 었다(Fig. 2, 3). 간세포암 조직에서 MGMT, hMSH3, hMLH1에 양성반응을 보인 경우는 6예(15%), 11예(28%), 16예(40%)로 MGMT에서 가장 낮은 빈도를 보였다. 높 은 빈도의 메틸화를 보인 MGMT와 hMSH3에서 통계적 인 의의는 적었지만 메틸화에 따라 유전자 단백 소실로 면역조직화학염색 결과가 음성인 경우가 많았다(p=0.10).
5. 임상 특징과 DNA 복제오류 교정유전자들의 메 틸화 및 MSI와의 상호연관성
간세포암종 환자의 연령, 성별, 발생 원인, 혈청 α-
박정호 외 9인. 간경변증과 동반된 간세포암종에서 Microsatellite Instability와 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화 333
Table 4. Correlation between DNA Methylation and Clini- cal Characteristics in Hepatocellular Carcinoma
DNA hypermethylation
p +(N=32) -(N=8)
Age (years) .17
＜50 5 (16%) 3 (38%)
≥50 27 (84%) 5 (62%)
Male:Female 29:3 7:1 .79
Cause
HBV 19 (59%) 5 (63%) HCV 6 (19%) 1 (13%) Non B, non C 2 (6%) 1 (13%) Alcoholics 5 (16%) 1 (13%)
Tumor size (cm) .50
＜5 24 (75%) 5 (63%)
≥5 8 (25%) 3 (38%)
AFP (ng/mL) .69
＜400 26 (81%) 6 (75%)
≥400 6 (25%) 2 (25%)
BCLC stage* .91
A1/A2/A3/A4/B/C 10/2/5/3/6/6/ 2/1/3/0/2/0
TNM stage† .30
I/II/III/IVa/IVb 4/17/6/5/0 0/7/1/0/0 Pathologic feature
Well differentiated 7 (22%) 1 (13%) Moderately differentiated 14 (44%) 5 (63%) Poorly differentiated 11 (34%) 2 (25%) Recurrence 19 (76%) 6 (75%) Mortality 11 (34%) 4 (50%) .41
* Barcelona clinic liver cancer stage.
†6th AJCC/UICC TNM stage.
HBV, hepatitis B virus; HCV, hepatitis C virus; AFP, alpha- fetoprotein.
FP 수치, 종양 크기, BCLC 및 TNM 병기, 조직 분화도, 수술 후 재발 유무, 사망률 등 임상 특징과 DNA 복제 오류 교정유전자들의 메틸화 및 MSI와의 의미있는 상 관관계는 없었다(Table 4). 환자가 고령일수록 메틸화 빈도가 증가되는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다(p=0.17).
고 찰
악성 종양은 분자생물학적으로 다단계 유전변이나 상 유전 변화로 인한 다양한 종양유전자와 종양억제유전자 들의 비정상 발현에 의해 발생한다. 최근 각종 돌연변 이와 외부 손상에 의한 유전자 소실이나 과발현과 같은 유전변이뿐 아니라 CpG 밀집부위 메틸화와 같은 상유
전 변화에 의한 종양억제유전자나 DNA 복제오류 교정 유전자의 기능 상실이 악성 종양 발생의 중요한 요인으 로 알려졌다.5,6 간세포암종 역시 고위험 인자인 만성 간염, 간경변증 및 형성이상 결절 등과 함께 그 발생에 서 종양억제유전자들의 불활성화와 관계가 있으며 p16 이나 APC 등의 이상 메틸화가 간세포암과 고위험군에 서 보고되었다.17-20 그러나 DNA 복제오류 교정유전자의 메틸화 양상의 간세포암종 발생 과정에 대한 영향은 아 직 불분명하며 메틸화 빈도도 연구별로 약간씩 다르며 임상 특징과 메틸화의 관계를 분석한 연구는 많지 않 다. 따라서 이번 연구는 간경변증이 동반된 간세포암종 에서 상유전 변화인 DNA 복제오류 교정유전자들의 메 틸화 유무와 MSI 빈도를 조사하고 면역조직화학염색을 통해 메틸화에 따른 단백 소실 유무를 조사하여 간세포 암과 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화와의 연관 성을 파악하고, 간세포암종의 임상 특징에 따른 관련성 을 알아보고자 하였다.
이번 연구에서 hMLH1을 제외한 MGMT와 hMSH3 메 틸화가 73%와 75%로 높게 관찰되었고 간경변증에 비 해 간세포암에서 약간 높게 메틸화되는 경향을 보였지 만 통계학적으로 의미있는 차이를 보이지 않았다. 다른 연구의 경우 MGMT 메틸화는 39-80%로 다양하게 보고 되고 있어12-14 이번 연구에서는 비교적 높은 빈도로 조 사되었다. 그리고 간세포암에서 hMSH3에 대한 메틸화 빈도는 아직까지 문헌보고가 없는 상태이며 이번 연구 에서 최초로 보고한 중요한 자료로 의미가 있다. 단지 hMSH3 부위를 탐지하는 표지자를 이용한 간세포암종 의 loss of heterozyyosity (LOH) 연구보고에서는 간세포 암종에서 LOH가 관찰되지 않았다.21 이번 연구에서 hMSH3 는 간경변증(70%)과 간세포암종(75%)에서 다른 복제오 류 교정유전자들에 비해 가장 높은 메틸화 빈도를 보 여, 추후 MGMT와 같이 간세포암종 발생과의 관련성에 대한 연구가 필요하다. DNA 복구효소인 MGMT는 22,000 kD의 단백질로 메틸화된 guanine의 빠른 반전에 중요하며, 인간에서는 간에서 가장 높은 MGMT 활성도 를 가지고 있어 간세포암종 발생에서 MGMT의 역할에 대 한 연구가 많이 이루어지고 있다. 간세포암종에서 MGMT 는 돌연변이나 결손, 재배열보다는 프로모터의 과메틸 화에 의해 유전자 기능이 불활성화됨으로써 MGMT 단 백 소실을 가져와 간세포암종 발생에 관계가 있다고 한
다.22,23 한 보고에 의하면 간세포암종에서 MGMT의 메
틸화가 있었던 대부분(32예 중 30예)에서 면역조직화학 염색 결과 MGMT 단백 발현이 소실됨을 보였고12 이번 연구에서도 85%에 이르는 MGMT 단백 발현 소실을 보 여 메틸화와 MGMT 단백의 기능 상실과 밀접한 연관
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성이 있을 것이다. 하지만 일부 MGMT 메틸화가 없는 증례들에서도 MGMT 발현이 소실되어 메틸화는 면역조 직화학염색 결과와 통계적인 의미가 없었는데, 이는 조 직고정 중 세포 내 단백 파괴에 따른 면역조직화학염색 음성 결과나 메틸화 기전 이외에 MGMT 유전자의 돌연 변이 등에 의한 결과로 추정해 볼 수 있다. 일부 보고 에 의하면 DNA 메틸전환효소 mRNA 수치가 정상 간 조직보다 바이러스성 만성 간염, 간경변증 그리고 간세 포암종에서 점차 증가하고 증가된 효소 활성도에 의해 MGMT 메틸화가 종양 발생 초기에 관찰되었다.14 이번 연구에서도 간경변증, 간세포암종 모두에서 높은 빈도 의 MGMT 메틸화와 면역조직화학염색 결과 MGMT 단 백 소실을 보여 간세포암종 발생 초기에 이러한 유전자 변화가 관련될 가능성을 제시하였다. 임상 특징과 MGMT 유전자 메틸화 또는 단백소실과 관련성을 분석한 연구 는 많지 않다. MGMT와 hMLH1 단백 소실된 간세포암 종에서 예후가 더 좋지 못함을 보고한 연구가 있으나24 이번 연구에서는 수술 후 재발이나 예후가 유전자들의 메틸화나 단백 소실과는 의미있는 차이를 보이지 않았 다. 단지 임상 특징 중 연령이 증가할수록 메틸화 빈도 가 증가하는 경향을 보였지만 통계적인 차이는 없었다.
향후 간세포암종의 분자생물학적인 원인과 임상 특징 간의 대단위 연구가 필요하다.
hMLH1은 대부분의 연구에서 간세포암종에서 10% 내 외의 낮은 hMLH1 유전자 메틸화 빈도를 보였다.6,14,17 일 부 보고에 의하면 간세포암종의 발생과정에서 돌연변이 나 프로모터 메틸화에 의한 hMLH1이나 hMSH2 유전자 의 기능 소실이 이들의 유전자 단백산물의 발현 여부와 무관하다고 하였는데,25 이번 연구에서는 hMLH1의 메틸 화 빈도가 매우 낮고 메틸화를 보인 증례에서도 hMLH1 단백에 대한 면역조직화학염색 결과 양성으로 출현하여 hMLH1 유전자의 메틸화는 단백 발현과는 무관하다고 생 각한다.
Microsatellite는 1-5개의 짧은 염기배열이 반복되는 유 전자의 조합으로 이 부위를 PCR 증폭할 때 다형성이 관찰되어 유전자의 불안정성을 확인할 수 있다.26 현재 까지 알려진 microsatellite DNA의 기능은 단순히 exon 을 연결시켜 주는 의미 없는 유전자(junk)라는 생각 이 외에, 구조가 완전히 반복되는 염기 서열로 구성되어 있지 않아 동종 유전자교환에 대한 방어 역할을 하는 것으로 생각한다.27 암종에서는 이런 반복되는 염기 서 열의 확장으로 인한 방어기전 상실이 빈번한 유전자교 환을 일으켜 발암 과정에 관여할 것으로 추정되고 있 다.28 또한 MSI의 원인인 stability gene 결함 자체도 DNA 복제오류 교정계의 장애를 초래하거나 종양유전자(ras,
Rb, p53)에 돌연변이를 유발하여 종양을 형성한다.28,29 여러 장기에서 발생한 암종마다 MSI의 빈도는 차이가 있는데 지금까지의 보고에 의하면 간세포암종은 MSI가 없거나 낮은 빈도(0-20%)를 보였으며, 특히 간세포암종 에 비해 간경변증에서 더 높은 MSI를 보였다.25,28,30 이 번 연구에서도 간경변증을 동반한 간세포암종 40예 중 3예(8%)에서만 MSI를 보여 이전 보고와 비교적 일치하 는 결과를 보였으나 간경변증보다는 간세포암종에서 MSI 빈도가 약간 높았다. 또한 C형간염이나 알코올성 간염에 의한 경우보다는 B형간염 후에 발생한 간경변 증에서 MSI 빈도가 높아 발생 원인에 따른 MSI 빈도 차이가 있으나31 이번 연구에서는 간세포암종이 발생한 기저 간질환의 종류와 MSI와는 유의한 상관관계가 없 었다.
결론으로, 간세포암종 환자에서 DNA 복제오류 교정 유전자들 중 MGMT와 hMSH3 유전자 메틸화가 간세포 암종 및 동반된 간경변증에서 흔히 관찰되며 메틸화에 따라 이들 단백 발현이 소실되어 있는 경우가 많아 간 세포암종 발생에 연관이 있으리라 생각한다. 또한 간세 포암종에서 낮은 빈도의 MSI를 보였으며 DNA 복제오 류 교정유전자와 MSI는 서로 상관관계가 없었다. 수술 후 재발이나 예후와 같은 임상 특징과 DNA 복제오류 교정유전자들의 메틸화와는 의미있는 상관관계는 보이 지 않았다.
요 약
목적: 최근 간세포암종 발생과정에서 DNA 복제오류 교정유전자의 관련성을 시사해 주고 있으며 그 중에서 도 DNA 복구과정에서 복제오류 교정계(mismatch repair system)와 O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MG- MT)의 중요한 연관성이 있음이 제시되었다. 대상 및 방 법: 2000년부터 2003년까지 간세포암종으로 수술을 시행 받아 병리조직학적으로 진단된 환자들 중에서 간경변증이 동반된 40예를 대상으로 하여 hMLH1, MGMT, hMSH3과 같 은 DNA 복제오류 교정유전자의 프로모터 부위 메틸화 유무와 그 빈도를 조사하고 microsatellite instability (MSI) 와 면역조직화학염색을 통한 이들 유전자 산물의 발현 여부와의 상관성 및 임상 특징과 연관성을 조사하였다.
결과: 수술 후 절제된 간세포암종의 평균 크기는 4.2±
2.6 cm였다. 간세포암종 병기분류에서 BCLC stage A1 은 12예(30%), A2는 3예(8%), A3는 8예(20%), A4는 3예 (8%), B는 8예(20%), C는 6예(15%)였고, TNM stage I은 4예, II는 24예(60%), III는 7예(18%), IVa는 5예(13%)였 다. 간세포암종의 조직 분화도 등급에 따라 고분화도 8
Park JH, et al. Methylation Pattern of DNA Repair Genes and Microsatellite Instability in Hepatocelluar Carcinoma 335
예(20%), 중분화도 19예(48%), 저분화도 13예(32%) 보였 다. 수술 후 간세포암종 재발은 총 25예(63%)에서 발생 하였으며, 수술 후 간세포암종 재발 또는 간기능 저하 로 사망한 경우는 15예(38%)였다. hMLH1, MGMT, hMSH3 유전자의 메틸화를 보이는 경우가 동반된 간경변증에서 각각 3예 (8%), 27예(68%), 28예(70%)였고, 간세포암종에서 각각 2예(5%), 29예(73%), 30예(75%)로 간경변증과 간세 포암종에서 높은 빈도를 보이는 DNA 복제오류 교정유 전자는 hMSH3, MGMT였고 낮은 빈도를 보이는 것은 hMLH1이었다. MSI 상태는 대부분의 증례들이 안정 MSI였으며 단지 3예(8%)에서만 MSI가 관찰되었다.
MGMT, hMLH1, hMSH3 단백에 대한 면역조직화학염색 결과 양성반응을 보인 경우가 6예(15%), 16예(40%), 11예 (28%)였다. MGMT의 경우 유전자 메틸화에 따라 MGMT 단백 소실이 있는 경향을 보였으나 의미있는 상관관계 는 보이지 않았다(p=0.10). 간세포암종의 조직 분화도, 수술 후 재발 및 예후 등 임상 특징과 유전자 메틸화와 는 의미있는 상관관계를 보이지 않았다(p＞0.05). 결론:
간경변증과 동반된 간세포암종 환자에서 DNA 복제오 류 교정유전자 중 MGMT와 hMSH3 유전자 메틸화 빈도 가 높게 나타났다. 또한 간세포암종에서 낮은 빈도의 MSI를 보였으며 DNA 복제오류 교정유전자와 MSI는 서로 상관관계가 없었다. 수술 후 재발이나 예후와 같 은 임상적인 특징과 DNA 복제오류 교정유전자들의 메 틸화는 의미있는 상관관계는 보이지 않았다.
색인단어: 간세포암종, hMLH1, MGMT, hMSH3
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